Istituzione e analisi di organidi tridimensionali (3D) Derivati dagli spettri della metastasi ossea del cancro della prostata del paziente e dai loro xenoinfi

Riepilogo

Le colture tridimensionali di campioni di BMPC pazienti e xenografi del carcinoma della prostata metastatica ossea mantengono l'eterogeneità funzionale dei loro tumori originali con conseguenti cisti, sferoidi e organoidi complessi simili a tumori. Questo manoscritto fornisce una strategia di ottimizzazione e un protocollo per la cultura 3D di campioni eterogenei derivati dai pazienti e la loro analisi utilizzando IFC.

Abstract

La coltura tridimensionale (3D) degli organoidi da campioni tumorali di pazienti umani e modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente del cancro alla prostata, indicati come organoidi derivati dal paziente (DOP), sono una risorsa inestimabile per studiare il meccanismo di tumoraligenesi e metastasi del cancro alla prostata. Il loro principale vantaggio è che mantengono l'eterogeneità genomica e funzionale distintiva del tessuto originale rispetto alle linee cellulari convenzionali che non lo fanno. Inoltre, le colture 3D della DOP possono essere utilizzate per prevedere gli effetti del trattamento farmacologico sui singoli pazienti e sono un passo verso la medicina personalizzata. Nonostante questi vantaggi, pochi gruppi utilizzano abitualmente questo metodo in parte a causa dell'ampia ottimizzazione delle condizioni di coltura DOP che possono essere necessarie per diversi campioni di pazienti. In precedenza abbiamo dimostrato che il nostro modello di metastasi ossea del cancro alla prostata, PCSD1, ha ricapitolato la resistenza della metastasi ossea del donatore alla terapia anti-androgena. Abbiamo usato organoidi 3D PCSD1 per caratterizzare ulteriormente i meccanismi della resistenza anti-androgeni. Seguendo una panoramica degli studi attualmente pubblicati sui modelli PDX e DOP, descriviamo un protocollo passo-passo per la cultura 3D della DOP utilizzando sfere a cupola o galleggianti in terra seminterrato (ad esempio, Matrigel) in condizioni di cultura ottimizzate. Vengono descritti anche l'imaging dei punti in vivo e l'elaborazione cellulare per l'istologia. Questo protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per altre applicazioni tra cui macchia occidentale, co-cultura, ecc. e può essere utilizzato per esplorare le caratteristiche della PDO coltivata 3D relative alla resistenza ai farmaci, alla tumorigenesi, alle metastasi e alle terapie.

Introduzione

Gli organoidi colti tridimensionali hanno attirato l'attenzione sul loro potenziale di ricapitolazione dell'architettura in vivo, della funzionalità cellulare e della firma genetica dei loro tessuti originali^1,2,3,4,5. Ancora più importante, gli organoidi 3D stabiliti dai tessuti tumorali dei pazienti o dai modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) offrono opportunità inestimabili per comprendere i meccanismi di segnalazione cellulare sulla tumorigenesi e per determinare gli effetti del trattamento farmacologico su ogni popolazione cellulare^{6,7,8,9,10,11,12,13}. Drost et al.⁵ ha sviluppato un protocollo standard per la creazione di organoidi della prostata umana e murina, che è stato ampiamente adottato nel campo dell'urologia. Inoltre, è stato dedicato uno sforzo significativo per un'ulteriore caratterizzazione degli organoidi 3D e per comprendere i meccanismi dettagliati della tumorigenesi e metastasi^4,12,14,15. Oltre al protocollo precedentemente stabilito e ampiamente accettato per le colture di organoidi 3D, descriviamo qui un protocollo passo-passo per la cultura 3D di DOP utilizzando tre diversi metodi di doming in condizioni di coltura ottimizzate.

In questo manoscritto, gli organoidi 3D sono stati stabiliti come un modello ex vivo di cancro alla prostata metastatica ossea (BMPC). Le cellule utilizzate per queste colture provenivano dalla serie Prostate Cancer San Diego (PCSD) ed erano derivate direttamente dai tessuti tumorali metastatici del cancro della prostata del paziente (PCSD18 e PCSD22) o dai modelli tuminanti xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente (campioni denominati PCSD1, PCSD13 e PCSD17). Poiché la metastasi ossea spontanea delle cellule tumorali della prostata è rara nei modelli murini geneticamente ingegnerizzati¹⁶, abbiamo usato l'iniezione intrafmorale diretta (IF) delle cellule tumorali umane nel maschio Rag2^{-/-z -/-} topi per stabilire i modelli PDX del cancro alla prostata metastatico osseo¹⁷.

Una volta che gli organoidi 3D sono stabiliti da cellule tumorali del paziente eterogenee o xenogratraps derivati dal paziente, è essenziale confermare la loro identità come cellule tumorali della prostata e determinare i loro fenotipi nelle colture organoidi 3D. La chimica dell'immunofluorescenza (IFC) consente la visualizzazione dell'espressione proteica in situ in ogni cellula, spesso indicando le potenziali funzioni per specifiche popolazioni cellulari^2,4. In generale, i protocolli IFC per la maggior parte dei campioni, inclusi tessuti e cellule, sono semplici e completamente ottimizzati. Tuttavia, la densità cellulare e il numero di organoidi possono essere significativamente inferiori a quelli della coltura convenzionale. Pertanto, il protocollo IFC per gli organoidi richiede passaggi aggiuntivi per garantire una corretta elaborazione e incorporamento in paraffina per tutti gli organoidi nei campioni. Descriviamo ulteriori passaggi per un processo di pre-incorporamento dell'agarose e suggerimenti per etichettare la posizione degli organoidi sezionati sul vetrino che aumenta il tasso di successo di IFC sugli organoidi, soprattutto quando i campioni di organoidi hanno una densità di cellule inferiore a quella desiderata.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per l'Università della California di San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). IRB #090401 Approvazione è stata ricevuta dall'UCSD Institutional Review Board (IRB) per raccogliere campioni chirurgici dai pazienti per scopi di ricerca. Un consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente e un campione chirurgico di metastasi della prostata ossea è stato ottenuto dalla riparazione ortopedica di una frattura patologica nel femore. I protocolli sugli animali sono stati eseguiti nell'ambito del protocollo approvato dall'Università della California a San Diego (UCSD) e dal protocollo approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (IACUC) #S10298. Cellule provenienti da tessuto tumorale del paziente meccanicamente ed enzimaticamente dissociato sono state iniettate intra-femoralmente nel maschio Rag2-/-8 settimane di età maschio Rag2^-/--;;c^-/- topi come descritto in precedenza¹⁷. Il volume del tumore dello xenotrapianto è stato determinato utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza in vivo e misurazioni della pinza. Dopo la crescita del tumore fino a 2,0 cm (la dimensione massima consentita approvato da IACUC), il tumore è stato raccolto per la creazione di organoidi 3D.

NOTA: Figura 1 mostra il flusso di lavoro per la creazione di organiidi di organidi 3D e un numero di protocollo per ogni fase delle procedure sperimentali.

1. Elaborazione dei tessuti tumorali xenotrapianto derivati dal paziente (PDX)

NOTA: Questo è un primo passo per la creazione di organiidi per un tumore derivato da un modello murino xenotrapianto. Questo protocollo è adattato da una precedente pubblicazione di Drost et al.⁵ e abbiamo modificato le condizioni dei media per includere il completamento del siero ai media organoidi.

1. Elaborare il campione di tumore come descritto di seguito.
   1. Mitire campioni di tumore a 1-3 mm³ pezzi di dimensioni e digerire i campioni con 10 mL di soluzione di dissociazione cellulare per 45 min a temperatura ambiente.
   2. Per terminare la digestione, aggiungere 20 mL di supporti completi DMEM agli esempi.
   3. Filtrare la sospensione attraverso un colino cellulare da 70 m. Utilizzare una flangia sterile di stantuffo per spingere qualsiasi tessuto residuo sulla parte superiore del colino cellulare di 70 m.
   4. Centrifuga a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
   5. Lavare il pellet cellulare tre volte con un nuovo supporto adDMEM completo. Abbinare il volume dei supporti per il lavaggio e la sospensione con il volume dei supporti suggerito nella tabella 3. Ad esempio, per una condizione di coltura di 24 pozzi, il volume per il lavaggio deve essere di 500.L.
      NOTA: come illustrato nella tabella 3, il protocollo è applicabile alle diverse condizioni di impostazioni cultura.
   6. Determinare il numero di cellule finali utilizzando il colorante blu Trypan e un emocitometro.
   7. Dopo aver ottenuto il numero di cellule, sospendere il pellet cellulare in 80 : L del 2% FBS in PBS per 2 x 10⁶ cellule tumorali.
   8. Aggiungete 20 dollari di cocktail di esaurimento delle cellule del topo per 2 x 10⁶ cellule tumorali. Mescolare bene e incubare per 15 min a 2-8 gradi centigradi.
   9. Regolare il volume a 500 -L con 2% FBS nel buffer PBS per 2 x 10⁶ cellule tumorali.
      NOTA: Fino a 1 x 10⁷ cellule tumorali in 2,5 mL di sospensione cellulare possono essere elaborate su una colonna LS.
   10. Caricare le colonne LS sul separatore di colonna magnetico e posizionare un tubo conico da 15 mL su un rack sottostante per raccogliere il flusso.
   11. Sciacquare ogni colonna con 3 mL del 2% FBS nel buffer PBS. Scartare il tubo conico con il flusso di lavaggio e sostituirlo con un nuovo tubo conico sterile da 15 mL.
   12. Aggiungere la sospensione cellulare (fino a 2,5 mL di 1 x 10⁷ cellule tumorali) sulla colonna. Raccogliere flusso attraverso che sarà arricchito con cellule tumorali umane.
   13. Lavare la colonna due volte con 1 mL del 2% FBS nel buffer PBS.
       NOTA: È importante eseguire i passaggi di lavaggio non appena la colonna è vuota. Inoltre, cercare di evitare di formare bolle d'aria.
2. Aliquota il volume appropriato di sospensione cellulare a un tubo da 1,5 mL per la coltura desiderata impostata (Tabella 3).
3. Centrifugare il tubo da 1,5 mL a 300 x g e 4 gradi centigradi per 5 min.
4. Rimuovere e scartare con attenzione il supernatante.

2. Elaborazione dei tessuti tumorali primari del paziente

NOTA: Questo è un primo passo per lo stabilimento organoide.

1. Seguire tutti i passaggi 1 tranne il processo di esaurimento delle cellule del topo, che non è necessario per l'elaborazione dei tessuti tumorali primari del paziente.

3. Formare una cupola rotonda attaccata sulla piastra

NOTA: Questo manoscritto descrive tre modi per fare una cupola da una miscela del pellet cellulare e la membrana seminterrato (ad esempio, Matrigel) come mostrato Figura 1 e Figura 2. Nei passaggi 2-4, le cellule e la membrana seminterrato devono essere tenute sul ghiaccio per evitare la solidificazione della membrana seminterrato.

1. Risospendere il pellet cellulare nel volume appropriato della membrana del seminterrato (ad es., 40 oL) per una piastra di 24 pozzetti impostata (Tabella 3).
2. Pipetta su e giù delicatamente per garantire che le cellule sono ri-sospesi bene nella membrana seminterrato.
3. Pipette il volume appropriato (Tabella 3) della miscela di membrana cella-basement (e opzionale 10 -L di adDMEM supporto completo) al centro della piastra di coltura dei tessuti preriscaldato.
4. Invertire la piastra e posizionare immediatamente la piastra a testa in giù nell'incubatrice di coltura cellulare CO₂ impostata al 5% CO₂, 37 gradi centigradi per 15 min. Ciò impedisce alle cellule di assestarsi e aderire al fondo della piastra, consentendo al contempo alla membrana del seminterrato di solidificare.
5. Pipette il volume appropriato (Tabella 3) di mezzo preriscaldato contenente 10 .
6. Posizionare la piastra a destra all'interno dell'incubatore di coltura delle cellule CO₂ (5% CO₂, 37 gradi centigradi).
7. Cambiare i media ogni 3-4 giorni. Dopo 5-7 giorni, utilizzare il mezzo di coltura senza 10 sM Y-27632 dihydrochlor per mantenere le colture.

4. Formare una cupola galleggiante da una cupola rotonda attaccata sul piatto

1. Dopo il passaggio 3.7, staccare la cupola utilizzando un raschietto cellulare.

5. Formare perline galleggianti

NOTA: Questo protocollo è chiamato come perline galleggianti dal momento che la miscela di membrana seminterrato, media, e organoidi sembrano perline.

1. Tagliare un pezzo di pellicola di paraffina da 2 pollici x 4 pollici.
2. Posizionare la pellicola di paraffina sulla parte superiore dei divots di un portapacchi vuoto da una scatola di punta di plastica da 1000 l.
3. Premere delicatamente verso il basso sulla pellicola di paraffina per tracciare i divots utilizzando un dito indice guantato, ma senza sfondare la pellicola di paraffina.
4. Spruzzare la pellicola di paraffina con il 70% di etanolo e accendere la lampada UV nella cappa di coltura cellulare per sterilizzare la pellicola di paraffina preparata per almeno 30 min.
5. Preparare una miscela di cellule e 20 - L di membrana seminterrato. La densità di semina può essere 50.000 - 250.000 cellule per cupola.
6. Pipette la miscela di cellule elaborate dal punto 1 o 2, e 20 l di membrana seminterrato nello stampo del divot formato nella pellicola di paraffina preparata.
7. Risospendere il pellet cellulare nella membrana del seminterrato e pipetta repertare la sospensione cellulare nei divots preparati in paraffina.
8. Posizionare le perline solidificate e la pellicola di paraffina in una piastra di 6 pozze. Un pozzo in una piastra 6-po 'può adattarsi fino a 5 perline.
9. Pipette 3-5 mL di mezzo preriscaldato contenente 10 - M Y-27632 dihydrochlor in ogni pozzo mentre spazzolare delicatamente perline fuori della pellicola di paraffina.
   NOTA: come volume minimo, si consiglia 3 mL. Per un numero massimo di perline (N-5) per pozzo, si consigliano 5 mL di mezzo.
10. Collocare la piastra all'interno di un'incubatrice di CO₂ (5% CO₂, 37 gradi centigradi).
11. Cambiare il supporto organoide ogni 3-4 giorni. Dopo 5-7 giorni, utilizzare il mezzo di coltura senza 10 sM Y-27632 dihydrochlor per mantenere le colture.

6. Organoidi in vivo cucitura immagine al microscopio⁸

NOTA: Alcuni microscopi non sono in grado di raggiungere il perimetro esterno della piastra cellulare (parete del bordo); pertanto, si consiglia di utilizzare i pozzi vicino al perimetro della piastra della cella quando si cucitura immagine.

1. Posizionare la piastra di coltura cellulare in posizione verso l'alto nel supporto della piastra nel microscopio Keyence.
2. Posizionare l'obiettivo al centro della cupola bersaglio.
3. Impostare il processo di cucitura automatica selezionando il numero dei fotogrammi. Ad esempio, è possibile scegliere 3 x 3 o 5 x 5 per generare 9 immagini o 25 immagini in totale.
4. Premere il pulsante di acquisizione per avviare il processo di imaging.
5. Aprire il software del visualizzatore di immagini e caricare un gruppo di immagini scattate al passaggio 4.
6. Fare clic su Stitching immagine per creare un'immagine con cuciture ad alta risoluzione.
   NOTA: l'acquisizione di immagini seriali 9 o 25 può essere eseguita tramite configurazione manuale o automatica per mettere a fuoco le celle.

7. Lavorazione organoide per l'istologia: il metodo spin down agarose

NOTA: Questo protocollo è adattato da una precedente pubblicazione di Vlachogiannis et al.⁷. Abbiamo aggiunto un passaggio che coinvolge l'incorporamento di agarose per incorporare con successo tutte le popolazioni di organoidi.

1. Rimuovere i supporti esistenti dal pozzo. Fare attenzione a non aspirare le cupole della membrana del seminterrato.
2. Aggiungere un volume uguale (uguale al volume di supporti rimosso dal passaggio 1) della soluzione di recupero cellulare e incubare per 60 min a 4 gradi centigradi.
3. Scissare la cupola della membrana del seminterrato utilizzando una pipetta e schiacciare la cupola della membrana del seminterrato utilizzando una punta del pipet. Raccogliere la cupola dissociata e la soluzione di recupero cellulare in un tubo da 1,5 mL.
4. Centrifuga a 300 x g e 4 gradi centigradi per 5 min.
5. Rimuovere il super-natante (soluzione di recupero cellulare). Salvare tutti i supernatanti in tubi separati fino alla fine quando la presenza di organoidi è confermata nella fase finale di pelletazione.
6. Aggiungere il volume desiderato (Tabella 3) di PBS freddo e pipetta delicatamente su e giù per disturbare meccanicamente pellet.
7. Centrifuga a 300 x g e 4 gradi centigradi per 5 min.
8. Rimuovere il super-anabile (PBS).
9. Fissare il pellet in un volume abbinato (ad esempio, 500 L per un pellet dalla condizione di coltura 24 pozzo piastra, Tabella 3)del 4% PFA per 60 min a temperatura ambiente.
10. Dopo la fissazione, centrifugare a 300 x g e 4 gradi centigradi per 5 min.
11. Rimuovere il super-ataliante (PFA).
12. Lavare con volume abbinato (ad es. 500 L per un pellet dalla condizione di coltura del pozzo 24, Tabella 3) di PBS e centrifuga a 300 x g e 4 gradi centigradi per 5 min.
13. Preparare agarose calde (2% agarose in PBS).
    NOTA: Qui, i pellet cellulari per le sezioni congelate possono essere risospesi direttamente in 200 gradi l un composto dello Strumento di personalizzazione di Office senza ulteriori passaggi nel Protocollo 7.
14. Sospendere nuovamente il pellet cellulare in 200 gradi L di agarose (2% in PBS).
    1. Subito dopo l'aggiunta di agarose, staccare delicatamente il pellet cellulare dalla parete del tubo da 1,5 mL utilizzando l'ago da 25 G attaccato a 1 mL di siringa. Come mostrato nella Figura 3, se il pellet cellulare non è fisicamente staccato dalla parete del tubo da 1,5 mL, c'è il rischio di perdere tutto o parte del pellet cellulare durante il processo di incorporamento dell'agarose.
15. Attendere che l'agarose del 2% in PBS sia completamente solidificato.
16. Staccare il blocco di agarose solidificano dal tubo da 1,5 mL utilizzando un ago da 25 G attaccato alla siringa da 1 mL.
17. Trasferire il blocco di agarose staccato contenente il pellet cellulare in un nuovo tubo da 1,5 mL.
18. Riempire il tubo con 70% EtOH e procedere ulteriormente utilizzando il protocollo convenzionale per la disidratazione dei tessuti e l'incorporamento della paraffina.

8. Istologia e citochimica immunofluorescente (IFC) degli organoidi

1. Selezionare le diapositive per l'istologia o IFC.
2. Prima di iniziare il processo di colorazione, scoprire dove si trovano le celle sulla diapositiva e disegnare un cerchio intorno alle celle sulla diapositiva utilizzando un marcatore.
3. Disegnare il perimetro intorno al bordo o al bordo della diapositiva e dove i cerchi si trovano sulla diapositiva in un taccuino di laboratorio per registrarne le posizioni.
4. Eseguire la colorazione desiderata.
   NOTA: Durante questo processo, i cerchi marcati scompaiono poiché il produttore regolare non è resistente alle sostanze chimiche. Anche alcuni marcatori permanenti istologici possono essere cancellati durante il processo di colorazione.
5. Dopo il processo di colorazione, posizionare la diapositiva sopra il disegno nel taccuino di laboratorio per trovare le posizioni delle celle sulla diapositiva.

Risultati

Gli organoidi 3D sono stati stabiliti con successo da un modello di xenotrapianto (PDX) derivato dal paziente di cancro alla prostata metastatica ossea (BMPC) e direttamente dal tessuto del cancro prostatico metastatico dell'osso del paziente (Figura 4). In breve, i nostri modelli PDX di BMPC sono stati stabiliti mediante iniezione intrafemorale (IF) di cellule tumorali nei topi Rag2^{maschi -/-} c^-/- e poi i tumori PDX sono stati raccolti ed elaborati come descritto in qu...

Discussione

Gli organoidi 3D derivati dalle cellule tumorali della prostata della metastasi ossea del paziente sono ancora relativamente rari. Qui, descriviamo strategie e ulteriore protocollo ottimizzato per stabilire con successo organiidi derivati del paziente 3D seriale (PDO) di BMPC. Inoltre, vengono descritti i protocolli per proteggere gli organoidi in campioni con densità cellulare inferiore per l'analisi IFC e IHC. Fenotipi differenziali sotto forma di cisti, sferoidi e organoidi più complessi indicano che questo protocol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipettman	Gilson	F123602
1 mL Syringe	BD Syringe	329654
1.5 mL tube	Spectrum Lab Products	941-11326-ATP083
25G Needle	BD PrecisionGlide Needle	305122
4% Paraformaldehyde (PFA)	Alfa Aesar	J61899
70% Ethanol (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
A83-01	Tocris Bioscience	2939
Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
adDMEM	Life Technologies	12634010
Agarose	Lonza	50000
Antibody -for Cytokeratin 5	Biolegend	905901
Antibody for Cytokeratin 8	Biolegend	904801
B27	Life Technologies	17504044
Bioluminescence imaging system, IVIS 200	Perkin Elmer Inc	IVIS 200
Cell Culture Plate - 24 well	Costar	3524
Cell Culture Plate - 48 well	Costar	3548
Cell Culture Plate - 6 well	Costar	3516
Cell Dissociation Solution, Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cell Scraper	Sarstedt	83.180
Cell Strainer	Falcon (Corning)	352350
CO2 incubator	Fisher Scientific	3546
DAPI	Vector Vectashield	H-1200
DHT	Sigma-Aldrich	D-073-1ML
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Gemini Bio-Products	100-106
FGF10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
Forceps	Denville Scientific	S728696
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
LS Columns	Miltenyi	130-0420401
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator	Miltenyi	130-090-976
Marker	VWR	52877-355
Matrigel (Growth Factor Reduced)	Mediatech Inc. (Corning)	356231
Matrigel (High Concentration)	BD (Fisher Scientific)	CB354248
Microscope Imaging Software, Keyence	BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)
Microscope, Keyence	BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)
Mouse Cell Depletion Kit	Miltenyi	130-104-694
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Noggin	PeproTech	120-10C
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Parafilm	American National Can	N/A
Pen-Strep	Mediatech Inc. (Corning)	30-002-CI-1
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Plunger (from 3 mL syringe)	BD Syringe	309657
Prostaglandin E2	Tocris Bioscience	2296
R-Spondin 1	Trevigen	3710-001-01
SB2021190	Sigma-Aldrich	S7076-25MG
Small Table Top Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75002426
Water Bath	Fisher Sci	2320
Y-27632 Dihydrochloride	Abmole Bioscience	M1817