Hasta Prostat Kanseri Kemik Metastazı Örneklerinden ve Ksenogreftlerinden Elde Edilen Üç Boyutlu (3D) Organoidlerin Oluşturulması ve Analizi

Özet

Hasta BMPC örneklerinin üç boyutlu kültürleri ve kemik metastatik prostat kanserinin ksenogreftleri orijinal tümörlerinin fonksiyonel heterojenliğini korur ve bu da kistler, sferoidler ve kompleks, tümör benzeri organoidlerle sonuçlanır. Bu makale, heterojen hasta türemiş örneklerin 3D kültürü ve IFC kullanılarak analizleri için bir optimizasyon stratejisi ve protokolü sağlar.

Özet

İnsan hastalarının tümör örneklerinden organoidlerin üç boyutlu (3D) kültürü ve hasta kaynaklı organoidler (PDO) olarak adlandırılan prostat kanserinin hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelleri, tümörigenez ve prostat kanseri metastazı. Onların en büyük avantajı, orijinal dokunun ayırt edici genomik ve fonksiyonel heterojenliğini geleneksel hücre hatlarına göre korumalarıdır. Ayrıca, PDO'nun 3D kültürleri ilaç tedavisinin bireysel hastalar üzerindeki etkilerini tahmin etmek için kullanılabilir ve kişiselleştirilmiş tıbba doğru atılmış bir adımdır. Bu avantajlara rağmen, farklı hasta örnekleri için gerekli olabilecek PDO kültür koşullarının kapsamlı optimizasyonu nedeniyle bu yöntemi rutin olarak çok az grup kullanmaktadır. Daha önce prostat kanseri kemik metastazı PDX modelimizin PCSD1'in donör hastanın kemik metastazının anti-androjen tedavisine direncini yeniden kapladığını gösterdik. Biz anti-androjen direnci daha fazla mekanizmaları karakterize PCSD1 3D organoidler kullanılır. PDX ve PDO modellerinin şu anda yayınlanmış çalışmalarının genel bir görünümünü takiben, optimize edilmiş kültür koşullarında kubbeli veya yüzen bazal membran (örneğin, Matrigel) küreler kullanarak PDO'nun 3B kültürü için adım adım bir protokol uyguluyoruz. In vivo dikiş görüntüleme ve histoloji için hücre işleme de açıklanmıştır. Bu protokol batı leke, co-kültür, vb dahil olmak üzere diğer uygulamalar için daha optimize edilebilir ve ilaç direnci, tümörigenez, metastaz ve terapötik ile ilgili 3D kültürlü PDO özelliklerini keşfetmek için kullanılabilir.

Giriş

Üç boyutlu kültürlü organoidler in vivo mimarisi, hücresel işlevsellik ve orijinal dokularının genetik imza sını yeniden özetleme potansiyelleri için dikkat^{çekti1 ler 1,2,3,4,5}. En önemlisi, hasta tümör dokularından veya hasta türetilmiş ksenogreft (PDX) modellerinden kurulan 3D organoidler, tümörigenez üzerine hücresel sinyalizasyon mekanizmalarını anlamak ve ilaç tedavisinin her hücre popülasyonu^{6,7,8,9,10,11,12,13}üzerindeki etkilerini belirlemek için paha biçilmez fırsatlar sağlar. Drost ve ark.⁵ üroloji alanında yaygın olarak benimsenen insan ve fare prostat organoidlerinin kurulması için standart bir protokol geliştirmiştir. Buna ek olarak, 3D organoidlerin daha fazla karakterizasyonu ve tümörigenez ve metastaz^4,12,14,15ayrıntılı mekanizmaları anlamak için önemli çaba adanmıştır. 3D organoid kültürleri için önceden belirlenmiş ve yaygın olarak kabul görmüş protokole ek olarak, optimize edilmiş kültür koşullarında üç farklı doming yöntemi kullanılarak PDO'nun 3D kültürü için adım adım bir protokol uyguluyoruz.

Bu yazıda kemik metastatik prostat kanserinin (BMPC) ex vivo modeli olarak 3Boyutlu organoidler oluşturulmuştur. Bu kültürler için kullanılan hücreler Prostat Kanseri San Diego (PCSD) serisi geldi ve doğrudan hasta prostat kanseri kemik metastatik tümör dokuları (PCSD18 ve PCSD22) veya hasta türetilen ksenogreft (PDX) tümör modelleri (pcsd1, PCSD13 ve PCSD17 adlı örnekler) türetilmiştir. Prostat kanseri hücrelerinin spontan kemik metastazı genetik olarak tasarlanmış fare modellerinde nadir olduğu için¹⁶, biz erkek Rag2 içine insan tümör hücrelerinin doğrudan intra-femoral (IF) enjeksiyonu kullanılan^-/-γc^-/- fareler kemik metastatik prostat kanseri PDX modelleri kurmak için¹⁷.

3D organoidler heterojen hasta tümör hücrelerinden veya türetilmiş ksenogreftlerden oluşturulduktan sonra, prostat tümör hücreleri olarak kimliklerini doğrulamak ve 3D organoid kültürlerde fenotiplerini belirlemek esastır. İmmünofloresan kimyası (IFC) her hücrede protein ekspresyonunun görüntülenmesine izin verir, genellikle belirli hücre popülasyonları için potansiyel işlevleri gösteren^2,4. Genel olarak, dokular ve hücreler de dahil olmak üzere örneklerin büyük bir çoğunluğu için IFC protokolleri basit ve tamamen optimize edilebistir. Ancak, hücre yoğunluğu ve organoidlerin sayısı önemli ölçüde konvansiyonel kültürdaha düşük olabilir. Bu nedenle, organoidler için IFC protokolü, numunelerdeki tüm organoidler için parafinin uygun şekilde işlenmesini ve gömülmesini sağlamak için ek adımlar gerektirir. Özellikle organoid örneklerinin hücre yoğunluğunun istenildiğinde nisbeten daha düşük olması durumunda, akderose ön gömme işlemi için ek adımlar ve kesitli organoidlerin yerini slaytta etiketlemek için ipuçları açıklıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma, California Üniversitesi San Diego (UCSD) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) Kılavuzu'ndaki tavsiyelere sıkı bir şekilde uygun olarak gerçekleştirilmiştir. IRB #090401 Onayı UCSD Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) araştırma amaçlı hastalardan cerrahi numune toplamak için alındı. Her hastadan bilgilendirilmiş bir ret alındı ve femurdaki patolojik kırığın ortopedik onarımından cerrahi kemik prostat kanseri metastazı örneği alındı. Hayvan protokolleri California San Diego Üniversitesi (UCSD) hayvan refahı ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onaylı protokol #S10298 altında yapıldı. Mekanik ve enzimatik olarak ayrıştırılmış hasta tümör dokusundan hücreler daha önce^{açıklandığı}gibi 6-8 haftalık erkek Rag2^-/-;γ_c^-/- farelere intra-femorally enjekte edildi. Ksenogreft tümör hacmi in vivo biyolüminesans görüntüleme sistemi ve kaliper ölçümleri ile belirlendi. Tümör büyümesi üzerine 2.0 cm (IACUC tarafından onaylanan maksimal izin verilen boyut), tümör 3D organoidler kurulması için hasat edildi.

NOT: Şekil 1, 3B Organoidler oluşturmak için iş akışını ve deneysel prosedürlerin her adımı için bir protokol numarasını gösterir.

1. Hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) tümör dokularının işlenmesi

NOT: Bu bir ksenogreft fare modeli türetilen bir tümör için organoid kurulması için bir ilk adımdır. Bu protokol Drost ve ark.⁵ tarafından bir önceki yayından uyarlanmıştır ve medya koşullarını organoid ortama serum takviyesi içerecek şekilde modifiye ettik.

1. Aşağıda açıklandığı gibi tümör örneğini işleyin.
   1. 1-3 mm³ boyutlu parçalara kıyma tümör örnekleri ve oda sıcaklığında 45 dakika hücre dissosyasyon çözeltisi 10 mL ile örnekleri sindirmek.
   2. Sindirimi sonlandırmak için örneklere 20 mL DMEM komple ortam ekleyin.
   3. Süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. 70 μm hücresüz üst herhangi bir kalan doku itmek için steril bir piston flanş kullanın.
   4. Santrifüj 300 x g için 5 dk 4 °C'de.
   5. Hücre peletini taze adDMEM tam ortamile üç kez yıkayın. Yıkama ve yeniden süspansiyon için ortam hacmini Tablo 3'teönerilen ortam hacmiyle eşleştirin. Örneğin, 24 kuyu plaka kültür durumu için yıkama hacmi 500 μL olmalıdır.
      NOT: Tablo 3'tegösterildiği gibi protokol farklı kültür koşullarına uygulanabilir.
   6. Trypan mavi boya ve hemositometre kullanarak son hücre sayılarını belirleyin.
   7. Hücre sayımı nı aldıktan sonra, PBS'de %2 FBS'nin 80 μL'lik hücre pelletini 2 x 10⁶ tümör hücresi başına yeniden askıya alın.
   8. 2 x 10⁶ tümör hücresi başına 20 μL Fare Hücre Tükenmesi Kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve 2-8 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   9. 2 x 10⁶ tümör hücresi başına PBS tamponunda %2 FBS ile hacmi 500 μL'ye ayarlayın.
      NOT: 2,5 mL hücre süspansiyonunda 1 x 10⁷ tümör hücresi bir LS kolonüzerinde işlenebilir.
   10. LS kolonlarını manyetik kolon ayırıcısına yükleyin ve akış tanbirini toplamak için altında bir rafa 15 mL konik bir tüp yerleştirin.
   11. PBS arabelleğinde her sütunu %2 FBS'nin 3 mL'si ile durulayın. Konik tüpü yıkama akışıyla atın ve yeni, steril 15 mL konik tüple değiştirin.
   12. Hücre süspansiyonu (1 x 10⁷ tümör hücresinin 2,5 mL'sine kadar) sütunun üzerine ekleyin. Insan tümör hücreleri ile zenginleştirilmiş olacak akış-through toplamak.
   13. PBS arabelleğinde 1 mL %2 FBS ile kolonu iki kez yıkayın.
       NOT: Sütun boşalır boşalır atmaz yıkama adımlarını gerçekleştirmek önemlidir. Ayrıca, hava kabarcıkları oluşturan önlemek için deneyin.
2. Aliquot istenilen kültür kurmak için 1,5 mL tüp için hücre süspansiyon uygun hacmi (Tablo 3).
3. 1,5 mL'lik tüpü 300 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj edin.
4. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve atın.

2. Hasta primer tümör dokularının işlenmesi

NOT: Bu organoid kurulması için bir ilk adımdır.

1. Hasta primer tümör dokularının işlenmesi için gerekli değildir fare hücresi tükenme süreci dışında adım 1, tüm izleyin.

3. Plaka üzerinde ekli yuvarlak bir kubbe oluşturma

NOT: Bu el yazması, Şekil 1 ve Şekil 2'degösterildiği gibi hücre peleti ve bazmembran (örneğin, Matrigel) karışımından kubbe yapmanın üç yolunu açıklar. 2-4. basamaklarda, hücre ve bazal membran, bazmembranın katılaşmasını önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır.

1. 24 kuyu plakası için hücre peletini uygun hacimde (örn. 40°L) yeniden askıya alın(Tablo 3).
2. Pipet yukarı ve aşağı yavaşça hücrelerin bodrum zarında iyi askıya emin olmak için.
3. Pipet, hücre-bodrum membran karışımının uygun hacmini(Tablo 3)(ve isteğe bağlı 10 μL adDMEM komple ortam) önceden ısıtılmış doku kültür plakasının ortasına yerleştirin.
4. Plakayı ters çevirin ve plakayı %5 CO₂, 37 °C olarak 15 dakika olarak belirlenen CO₂ hücre kültürü kuluçka makinesine hemen ters yerleştirin. Bu, hücrelerin yerleşmesini ve taban zarının katılaşmasını sağlarken plaka nın dibine yapışmasını önler.
5. Pipet uygun hacimli(Tablo 3)her kuyuya 10 μM Y-27632 dihidroklorür içeren önceden ısıtılmış ortam.
6. Plakayı sağ tarafa CO₂ hücre kültürü kuluçka makinesinin içine yerleştirin (%5 CO₂, 37 °C).
7. Her 3-4 günde bir ortamı değiştirin. 5-7 gün sonra, kültürleri korumak için 10 μM Y-27632 dihidroklorür olmadan kültür ortamı kullanın.

4. Plaka üzerinde ekli yuvarlak bir kubbeden yüzen bir kubbe oluşturma

1. Adım 3.7 sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak kubbe ayırmak.

5. Yüzen boncukların oluşturulması

NOT: Bu protokol, bodrum zarı, ortam ve organoidlerin karışımı boncuk gibi göründüğü için yüzen boncuklar olarak adlandırılır.

1. Parafin film 2 inç x 4 inç parça kesti.
2. Parafin filmini 1000 μL plastik pipet ucu kutusundan boş bir uç tutma rafının divotlarının üstüne yerleştirin.
3. Eldivenli bir işaret parmağını kullanarak ancak parafin filmini kırmadan divotları izlemek için parafin filmine hafifçe bastırın.
4. Sprey parafin filmi% 70 etanol ile ve en az 30 dakika için hazırlanan parafin film sterilize etmek için hücre kültürü başlık UV lambası açın.
5. Hücre ve 20 μL bazal membran karışımı hazırlayın. Tohumlama yoğunluğu kubbe başına 50.000 - 250.000 hücre olabilir.
6. Pipet, 1 veya 2.
7. Hazırlanan parafin filme divots hücre süspansiyon bodrum membran ve pipet hücre pelet resuspend.
8. Katılaşmış boncukları ve parafin filmini 6 kuyulu bir tabağa yerleştirin. 6 kuyulu bir tabakta bir kuyu 5 boncuk sığabilir.
9. Pipet 3-5 mL önceden ısıtılmış ortam içeren 10 μM Y-27632 dihidroklorür her kuyuya parafin filmden boncukları hafifçe fırçalarken.
   NOT: Minimum hacim olarak 3 mL önerilir. Kuyu başına maksimum sayıda boncuk (N=5) için 5 mL orta boy tavsiye edilir.
10. Plakayı bir CO₂ kuluçka makinesinin içine yerleştirin (%5 CO₂, 37 °C).
11. Organoid ortamı her 3-4 günde bir değiştirin. 5-7 gün sonra, kültürleri korumak için 10 μM Y-27632 dihidroklorür olmadan kültür ortamı kullanın.

6. In vivo organoids görüntü mikroskop kullanarak dikiş⁸

NOT: Bazı mikroskoplar hücre plakasının dış çevresine (kenar duvar) ulaşamaz; bu nedenle, görüntü dikiş yaparken hücre plakasının çevresine yakın kuyular kullanmanızı öneririz.

1. Hücre kültür plakasını keyence mikroskobundaki plaka tutucuya yukarı doğru yerleştirin.
2. Merceği hedef kubbenin ortasına yerleştirin.
3. Çerçeve lerin sayısını seçerek otomatik dikiş işlemini ayarlayın. Örneğin, toplam 9 görüntü veya 25 görüntü oluşturmak için 3 x 3 veya 5 x 5 seçilebilir.
4. Görüntüleme işlemini başlatmak için yakalama düğmesine basın.
5. Görüntü görüntüleyici yazılımını açın ve adım 4'e göre alınan bir grup görüntü yükleyin.
6. Yüksek çözünürlüklü dikişli görüntü oluşturmak için Resim Dikişi'ni tıklatın.
   NOT: Seri 9 veya 25 görüntülerinin yakalanması, hücreleri odaklamak için manuel veya otomatik olarak ayarlanılarak gerçekleştirilebilir.

7. Histoloji için organoid işleme: agarose spin down yöntemi

NOT: Bu protokol Vlachogiannis ve ark.⁷tarafından bir önceki yayınuyarlanmıştır. Tüm organoid popülasyonlarını başarıyla gömmek için agarose gömmeyi içeren bir adım ekledik.

1. Varolan ortamı kuyudan kaldırın. Bodrum membran kubbeleri aspire değil dikkatli olun.
2. Hücre geri kazanım çözeltisinin hacmine eşit (adım 1'den çıkarılan ortam hacmine eşit) ekleyin ve 4 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Bir pipet kullanarak bodrum membran kubbe sitrenin ve bir pipet ucu kullanarak bodrum membran kubbe ezmek. Ayrıştırılmış kubbe ve hücre kurtarma çözeltisini 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın.
4. Santrifüj 300 x g ve 4 °C 5 dakika.
5. Supernatant (hücre kurtarma çözümü) kaldırın. Organoidlerin varlığı son peletleme adımında doğrulandığında sonuna kadar ayrı tüpler de tüm supernatants kaydedin.
6. İstenilen hacim(Tablo 3)soğuk PBS ve hafifçe pipet yukarı ve aşağı mekanik olarak rahatsız pelet ekleyin.
7. Santrifüj 300 x g ve 4 °C 5 dakika.
8. Supernatant (PBS) çıkarın.
9. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %4 PFA'nın 24 kuyu plaka kültürü koşulundan bir pelet için 500 μL, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %4 PFA ile eşleşen hacimdeki peleti düzeltin.
10. Fiksasyondan sonra 300 x g ve 4 °C'de 5 dk santrifüj.
11. Supernatant (PFA) çıkarın.
12. Eşleşen hacimle yıkayın (örn. 24 kuyu plaka kültür koşulundan bir pelet için 500 μL, PBS tablo 3)ve santrifüj 300 x g ve 4 °C 5 dakika için.
13. Hazırlamak sıcak agarose (2% PBS agarose).
    NOT: Burada, dondurulmuş kesitler için hücre peletleri, Protokol 7'de başka adımlar olmadan 200 μL OCT bileşiğinde doğrudan yeniden askıya alınabilir.
14. Agarose'un 200 μL'sinde hücre peletini yeniden askıya alın (PBS'de %2).
    1. Agarose'u ekledikten hemen sonra, hücre peletini 1 mL şırıngaya bağlı 25 G iğneyi kullanarak 1,5 mL tüpün duvarından yavaşça ayırın. Şekil 3'tegösterildiği gibi, hücre peleti 1,5 mL tüpün duvarından fiziksel olarak ayrılmadıysa, agarose gömme işlemi sırasında hücre peletinin tamamını nveya bir kısmını kaybetme riski vardır.
15. PBS%2 agarose tamamen katılaşmış kadar bekleyin.
16. 1 mL şırıngaya bağlı 25 G iğne kullanarak katılaşmış agarose bloğunu 1,5 mL tüpten ayırın.
17. Hücre peletini içeren müstakil agarose bloğunu yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın.
18. Tüpü %70 EtOH ile doldurun ve doku dehidratasyonu ve parafin katıştırma için geleneksel protokolü kullanarak daha da ilerleyin.

8. Organoidlerin Histolojisi ve İmmünofloresan Sitokimyası (IFC)

1. Histoloji veya IFC için slayt(lar)ı seçin.
2. Boyama işlemini başlatmadan önce, hücrelerin slaytta nerede olduğunu bulun ve bir işaretçi kullanarak slayttaki hücrelerin etrafına bir daire çizin.
3. Slaytın kenarının veya tahtanın etrafındaki çevreyi ve konumlarını kaydetmek için bir laboratuvar not defterinde slaytta dairelerin bulunduğu yeri çizin.
4. İstediğiniz boyamayı gerçekleştirin.
   NOT: Bu işlem sırasında, düzenli yapıcı kimyasallara karşı dirençli olmadığından işaretli daireler kaybolur. Hatta bazı histoloji kalıcı belirteçleri boyama işlemi sırasında silinebilir.
5. Boyama işleminden sonra, slayttaki hücrelerin konumlarını bulmak için slaytı çizimin üzerine laboratuvar not defterine yerleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

3D organoidler kemik metastatik prostat kanseri (BMPC) modelinden ve doğrudan hasta kemik metastatik prostat kanseri dokusundan elde edilen ksenogreft (PDX) modelinden başarılı bir şekilde saptandı(Şekil 4). Kısaca, BMPC PDX modellerimiz erkek Rag2^-/- c^-/- farelere tümör hücrelerinin intra-femoral (IF) enjeksiyonu ile oluşturulmuş ve daha sonra PDX tümörleri bu el yazmasında açıklandığı şekilde hasat edilerek işlenmiştir. Şe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hasta kemik metastazı prostat kanseri hücrelerinden elde edilen 3D organoidler hala nispeten nadirdir. Burada, BMPC'nin seri 3D hasta kaynaklı organoidlerini (PDO'ları) başarıyla kurmak için stratejileri ve daha da optimize edilmiş protokolü tanımlıyoruz. Buna ek olarak, IFC ve IHC analizi için daha düşük hücre yoğunluğuna sahip numunelerde organoidlerin güvenliğini sağlamak için protokoller tanımlanmıştır. Kist, sferoidler ve daha karmaşık organoidler şeklindeki diferansiyel fenotipler, bu p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipettman	Gilson	F123602
1 mL Syringe	BD Syringe	329654
1.5 mL tube	Spectrum Lab Products	941-11326-ATP083
25G Needle	BD PrecisionGlide Needle	305122
4% Paraformaldehyde (PFA)	Alfa Aesar	J61899
70% Ethanol (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
A83-01	Tocris Bioscience	2939
Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
adDMEM	Life Technologies	12634010
Agarose	Lonza	50000
Antibody -for Cytokeratin 5	Biolegend	905901
Antibody for Cytokeratin 8	Biolegend	904801
B27	Life Technologies	17504044
Bioluminescence imaging system, IVIS 200	Perkin Elmer Inc	IVIS 200
Cell Culture Plate - 24 well	Costar	3524
Cell Culture Plate - 48 well	Costar	3548
Cell Culture Plate - 6 well	Costar	3516
Cell Dissociation Solution, Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cell Scraper	Sarstedt	83.180
Cell Strainer	Falcon (Corning)	352350
CO2 incubator	Fisher Scientific	3546
DAPI	Vector Vectashield	H-1200
DHT	Sigma-Aldrich	D-073-1ML
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Gemini Bio-Products	100-106
FGF10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
Forceps	Denville Scientific	S728696
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
LS Columns	Miltenyi	130-0420401
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator	Miltenyi	130-090-976
Marker	VWR	52877-355
Matrigel (Growth Factor Reduced)	Mediatech Inc. (Corning)	356231
Matrigel (High Concentration)	BD (Fisher Scientific)	CB354248
Microscope Imaging Software, Keyence	BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)
Microscope, Keyence	BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)
Mouse Cell Depletion Kit	Miltenyi	130-104-694
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Noggin	PeproTech	120-10C
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Parafilm	American National Can	N/A
Pen-Strep	Mediatech Inc. (Corning)	30-002-CI-1
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Plunger (from 3 mL syringe)	BD Syringe	309657
Prostaglandin E2	Tocris Bioscience	2296
R-Spondin 1	Trevigen	3710-001-01
SB2021190	Sigma-Aldrich	S7076-25MG
Small Table Top Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75002426
Water Bath	Fisher Sci	2320
Y-27632 Dihydrochloride	Abmole Bioscience	M1817