Établissement et analyse des organoïdes tridimensionnels (3D) dérivés des spécimens de métastasie osseuse du cancer de la prostate du patient et de leurs Xénogreffes

Résumé

Les cultures tridimensionnelles des spécimens patients de BMPC et des xénogreffes du cancer de la prostate métastatique d'os maintiennent l'hétérogénéité fonctionnelle de leurs tumeurs originales ayant pour résultat des kystes, des sphéroïdes et des organoïdes complexes de tumeur-comme. Ce manuscrit fournit une stratégie d'optimisation et un protocole pour la culture 3D d'échantillons dérivés de patients hétérogènes et leur analyse à l'aide de l'IFC.

Résumé

La culture tridimensionnelle (3D) des organoïdes des spécimens de tumeur des patients humains et des modèles de xénogreffe (PDX) de patient-dérivé (PDX), désignés sous le nom d'organoïdes patient-dérivés (PDO), sont une ressource inestimable pour étudier le mécanisme de tumorigenesis et métastasie du cancer de la prostate. Leur principal avantage est qu'ils maintiennent l'hétérogénéité génomique et fonctionnelle distinctive du tissu original par rapport aux lignées cellulaires conventionnelles qui ne le font pas. En outre, les cultures 3D de l'ADP peuvent être utilisées pour prédire les effets du traitement médicamenteux sur les patients individuels et sont une étape vers la médecine personnalisée. Malgré ces avantages, peu de groupes utilisent régulièrement cette méthode en partie en raison de l'optimisation étendue des conditions de culture des APR qui peuvent être nécessaires pour différents échantillons de patients. Nous avons précédemment démontré que notre modèle de métastasie d'os de prostate PDX, PCSD1, a récapitulé la résistance de la métaste d'os du patient de distributeur au traitement d'anti-androgène. Nous avons employé des organoïdes 3D de PCSD1 pour caractériser plus loin les mécanismes de la résistance d'anti-androgène. À la suite d'un aperçu des études actuellement publiées sur les modèles PDX et ADP, nous décrivons un protocole étape par étape pour la culture 3D de l'ADO à l'aide de membranes en dôme ou flottantes (p. ex. Matrigel) dans des conditions de culture optimisées. L'imagerie in vivo de point et le traitement cellulaire pour l'histologie sont également décrits. Ce protocole peut être optimisé pour d'autres applications, y compris la tache occidentale, la co-culture, etc. et peut être utilisé pour explorer les caractéristiques de l'AOP cultivé en 3D concernant la résistance aux médicaments, la tumorigénèse, la métastes et la thérapeutique.

Introduction

Les organoïdes cultivés tridimensionnels ont attiré l'attention sur leur potentiel de récapituler l'architecture in vivo, la fonctionnalité cellulaire et la signature génétique de leurs tissus d'origine^1,2,3,4,5. Plus important encore, les organoïdes 3D établis à partir de tissus tumoraux patients ou de xénogreffes dérivées du patient (PDX) modèles fournissent des occasions inestimables de comprendre les mécanismes de signalisation cellulaire sur la tumorigénèse et de déterminer les effets du traitement médicamenteux sur chaque population cellulaire^{6,7,8,9,10,11,12,13}. Drost et coll.⁵ ont élaboré un protocole standard pour l'établissement d'organoïdes de la prostate humains et souris, qui a été largement adopté dans le domaine de l'urologie. En outre, un effort significatif a été consacré pour la caractérisation des organoïdes 3D et de comprendre les mécanismes détaillés de la tumorigénèse et la métastes^4,12,14,15. En plus du protocole précédemment établi et largement accepté pour les cultures d'organoïdes 3D, nous décrivons ici un protocole étape par étape pour la culture 3D de PDO utilisant trois méthodes différentes de doming dans des conditions de culture optimisées.

Dans ce manuscrit, des organoïdes 3D ont été établis comme modèle ex vivo du cancer de la prostate métastatique d'os (BMPC). Les cellules utilisées pour ces cultures provenaient de la prostate Cancer San Diego (PCSD) série et ont été dérivés directement de patients cancer de la prostate os métastatique tissus tumoraux (PCSD18 et PCSD22) ou le patient dérivé xénogreffe (PDX) modèles tumoraux (échantillons nommés PCSD1, PCSD13, et PCSD17). Parce que la métastase spontanée d'os des cellules cancéreuses de la prostate est rare dans les modèles génétiquement modifiés de souris^16,nous avons employé l'injection intra-fémorale directe (IF) des cellules humaines de tumeur dans le Rag2 mâle -/--c------souris pour établir les modèles de PDX du cancer de la prostate métastatique^{d'os 17.}

Une fois que les organoïdes 3D sont établis à partir des cellules hétérogènes de tumeur patiente ou des xénogreffes dérivées de patient, il est essentiel de confirmer leur identité en tant que cellules de tumeur de prostate et de déterminer leurs phénotypes dans les cultures organoïdes 3D. La chimie de l'immunofluorescence (IFC) permet la visualisation de l'expression des protéines in situ dans chaque cellule, indiquant souvent les fonctions potentielles pour des populations cellulaires spécifiques^2,4. En général, les protocoles IFC pour une grande majorité d'échantillons, y compris les tissus et les cellules, sont simples et entièrement optimisés. Cependant, la densité cellulaire et le nombre d'organoïdes peuvent être significativement inférieurs à ceux de la culture conventionnelle. Par conséquent, le protocole de l'IFC pour les organoïdes nécessite des mesures supplémentaires pour assurer un traitement approprié et l'intégration de la paraffine pour tous les organoïdes dans les échantillons. Nous décrivons des étapes supplémentaires pour un processus de pré-embedding d'agarose et des bouts pour étiqueter l'emplacement des organoïdes sectionnés sur la glissière qui augmente le taux de succès de l'IFC sur des organoïdes particulièrement quand les échantillons des organoïdes ont la densité cellulaire inférieure que désiré.

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Protocole

Cette étude a été réalisée dans le strict respect des recommandations du Guide for the University of California San Diego (UCSD) Institutional Review Board (IRB). L'Accord de #090401 de la CISR a été reçu de la Commission d'examen institutionnel de l'UCSD (CISR) pour recueillir des échantillons chirurgicaux de patients à des fins de recherche. Un consentement informé a été obtenu de chaque patient et un spécimen chirurgical de métastasie de cancer de la prostate d'os a été obtenu de la réparation orthopédique d'une rupture pathologique dans le fémur. Les protocoles sur les animaux ont été exécutés dans le cadre du protocole approuvé par l'Université de Californie à San Diego (UCSD) et le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) #S10298. Des cellules du tissu de tumeur patiente mécaniquement et enzymatiquement dissocié ont été intra-fémoralement injectées dans le Rag2mâle de 6 à 8 semaines^-/-;c-/- souris comme précédemment décrit^17. Le volume de tumeur de Xénograft a été déterminé utilisant un système in vivo de formation image de bioluminescence et des mesures d'étrier. Sur la croissance de tumeur jusqu'à 2.0 cm (la taille autorisée maximale approuvée par IACUC), la tumeur a été moissonnée pour l'établissement 3D d'organoïdes.

REMARQUE : La figure 1 montre le flux de travail pour l'établissement des organoïdes 3D et un numéro de protocole pour chaque étape des procédures expérimentales.

1. Traitement des tissus tumoraux dérivés de xénogreffe (PDX) de patient

REMARQUE : Il s'agit d'une première étape pour l'établissement d'organoïdes pour une tumeur dérivée d'un modèle de souris xénogreffe. Ce protocole est adapté d'une publication précédente par Drost et coll.⁵ et nous avons modifié les conditions médiatiques pour inclure la supplémentation en sérum aux médias organoïdes.

1. Traiter le spécimen de tumeur tel que décrit ci-dessous.
   1. Mince échantillons de tumeur à 1-3 mm³ morceaux de taille et digérer les échantillons avec 10 ml de solution de dissociation cellulaire pendant 45 min à température ambiante.
   2. Pour mettre fin à la digestion, ajouter 20 ml de dMEM de support complet aux échantillons.
   3. Filtrer la suspension à l'autre d'une passoire cellulaire de 70 m. Utilisez une bride stérile pour pousser les restes de tissu sur le dessus de la passoire cellulaire de 70 m.
   4. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.
   5. Laver la pastille cellulaire trois fois avec un média complet adDMEM frais. Associez le volume des médias pour le lavage et la suspension avec le volume de médias suggéré dans le tableau 3. Par exemple, pour une condition de culture de 24 plaques de puits, le volume pour le lavage doit être de 500 L.
      REMARQUE : Comme indiqué dans le tableau 3, le protocole s'applique à différentes conditions de culture.
   6. Déterminer le nombre final de cellules à l'aide de colorant bleu Trypan et d'un hémocytomètre.
   7. Après avoir obtenu des comptes cellulaires, re-suspendre le granule de cellules dans 80 'L de 2% FBS dans PBS par 2 x 10⁶ cellules tumorales.
   8. Ajouter 20 l de cocktail d'épuisement des cellules de souris par 2 x 10⁶ cellules tumorales. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 2-8 oC.
   9. Ajustez le volume à 500 L avec 2% de FBS en tampon PBS pour 2 x 10⁶ cellules tumorales.
      REMARQUE : Jusqu'à 1 x 10⁷ cellules tumorales dans 2,5 ml de suspension cellulaire peuvent être traitées sur une colonne de LS.
   10. Chargez les colonnes LS sur le séparateur de colonne magnétique et placez un tube conique de 15 ml sur un support en dessous pour recueillir le flux à travers.
   11. Rincer chaque colonne avec 3 ml de 2% FBS dans le tampon PBS. Jetez le tube conique avec le flux de lavage à travers et remplacez-le par un nouveau tube conique stérile de 15 ml.
   12. Ajouter la suspension cellulaire (jusqu'à 2,5 ml de 1 x 10⁷ cellules tumorales) sur la colonne. Recueillir flow-through qui sera enrichi avec des cellules tumorales humaines.
   13. Laver la colonne deux fois avec 1 ml de 2% FBS dans le tampon PBS.
       REMARQUE : Il est important d'effectuer des étapes de lavage dès que la colonne est vide. Aussi, essayez d'éviter de former des bulles d'air.
2. Aliquot le volume approprié de suspension cellulaire à un tube de 1,5 ml pour la culture désirée mis en place (tableau 3).
3. Centrifuger le tube de 1,5 ml à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
4. Retirez soigneusement et jetez le supernatant.

2. Traitement des tissus tutules primaires du patient

REMARQUE : Il s'agit d'une première étape pour l'établissement des organoïdes.

1. Suivez tous les étapes 1 excepté le processus d'épuisement de cellules de souris, qui n'est pas nécessaire pour le traitement des tissus primaires patients de tumeur.

3. Formation d'un dôme rond attaché sur la plaque

REMARQUE : Ce manuscrit décrit trois façons de fabriquer un dôme à partir d'un mélange de granule de cellules et de membrane du sous-sol (p. ex. Matrigel) comme le montre la figure 1 et la figure 2. Dans les étapes 2-4, les cellules et la membrane du sous-sol doivent être maintenues sur la glace pour empêcher la solidification de la membrane du sous-sol.

1. Resuspendre la pastille cellulaire dans le volume approprié de la membrane du sous-sol (p. ex., 40 l) pour une plaque de 24 puits mise en place (tableau 3).
2. Pipette de haut en bas doucement pour s'assurer que les cellules sont bien suspendues dans la membrane du sous-sol.
3. Pipette le volume approprié (tableau 3) du mélange de membrane de cellules-sous-sol (et en option 10 l de milieu complet adDMEM) dans le centre de la plaque de culture de tissu pré-chauffée.
4. Inverser la plaque et placer immédiatement la plaque à l'envers dans l'incubateur de culture cellulaire CO₂ fixé à 5 % CO₂, 37 oC pendant 15 min. Cela empêche les cellules de se tasser et d'adhérer au fond de la plaque tout en permettant à la membrane du sous-sol de se solidifier.
5. Pipette le volume approprié (tableau 3) de milieu pré-chauffé contenant 10 'M Y-27632 dihydrochlorure dans chaque puits.
6. Placez la plaque à droite vers le haut à l'intérieur de l'incubateur de culture cellulaire CO₂ (5 % CO₂, 37 oC).
7. Changez les médias tous les 3-4 jours. Après 5-7 jours, utilisez le milieu de culture sans 10 M Y-27632 dihydrochlorure pour maintenir les cultures.

4. Formation d'un dôme flottant à partir d'un dôme rond attaché sur la plaque

1. Après l'étape 3.7, détachez le dôme à l'aide d'un grattoir cellulaire.

5. Former des perles flottantes

REMARQUE : Ce protocole est nommé comme perles flottantes puisque le mélange de membrane de sous-sol, de médias, et d'organoïdes ressemblent à des perles.

1. Couper un morceau de 2 pouces x 4 pouces de film de paraffine.
2. Placez le film de paraffine sur le dessus des divots d'une grille vide de tip-holding à partir d'une boîte de tuyauterie en plastique de 1000 l.
3. Appuyez doucement sur le film de paraffine pour tracer les divots à l'aide d'un index ganté, mais sans percer le film de paraffine.
4. Vaporiser le film de paraffine avec 70% d'éthanol et allumer la lampe UV dans le capot de culture cellulaire pour stériliser le film de paraffine préparé pendant au moins 30 min.
5. Préparer un mélange de cellules et 20 l de membrane de sous-sol. La densité d'ensemencement peut être de 50 000 à 250 000 cellules par dôme.
6. Pipette le mélange de cellules traitées à partir de l'étape 1 ou 2, et 20 l de membrane de sous-sol dans le moule du divot formé dans le film de paraffine préparé.
7. Resuspendre la pastille cellulaire dans la membrane du sous-sol et pipette la suspension cellulaire dans les divots filmés paraffins préparés.
8. Placer les perles solidifiées et le film de paraffine dans une assiette de 6 puits. Un puits dans une assiette de 6 puits peut s'adapter jusqu'à 5 perles.
9. Pipette 3-5 ml de milieu pré-chauffé contenant 10 M Y-27632 dihydrochlorure dans chaque puits tout en brossant doucement les perles hors du film de paraffine.
   REMARQUE : En volume minimum, 3 ml sont recommandés. Pour un nombre maximum de perles (N-5) par puits, 5 ml de milieu est recommandé.
10. Placer la plaque à l'intérieur d'un incubateur de CO₂ (5 % CO₂, 37 oC).
11. Changez les médias organoïdes tous les 3-4 jours. Après 5-7 jours, utilisez le milieu de culture sans 10 M Y-27632 dihydrochlorure pour maintenir les cultures.

6. Coutured d'image d'organoïdes in vivo utilisant le microscope⁸

REMARQUE : Certains microscopes sont incapables d'atteindre le périmètre externe de la plaque cellulaire (mur de bord); par conséquent, nous vous suggérons d'utiliser les puits près du périmètre de la plaque cellulaire lors de la couture de l'image.

1. Placez la plaque de culture cellulaire en position ascendante dans le porte-plaque dans le microscope Keyence.
2. Placez la lentille au centre du dôme cible.
3. Configurez le processus de couture automatique en sélectionnant le nombre des images. Par exemple, 3 x 3 ou 5 x 5 peuvent être choisis pour générer 9 images ou 25 images au total.
4. Appuyez sur le bouton de capture pour lancer le processus d'imagerie.
5. Ouvrez le logiciel de visionneuse d'images et chargez un groupe d'images prises par l'étape 4.
6. Cliquez sur Image Stitching pour créer une image cousue haute résolution.
   REMARQUE : La capture d'images série 9 ou 25 peut être réalisée par commande manuelle ou automatique pour concentrer les cellules.

7. Traitement organoïde pour l'histologie : la méthode de spin down d'agarose

REMARQUE: Ce protocole est adapté d'une publication précédente par Vlachogiannis et al.⁷. Nous avons ajouté une étape impliquant l'intégration d'agarose pour intégrer avec succès toutes les populations d'organoïdes.

1. Retirez les médias existants du puits. Veillez à ne pas aspirer les dômes de membrane du sous-sol.
2. Ajouter un volume égal (égal au volume de support retiré de l'étape 1) de la solution de récupération cellulaire et incuber pendant 60 min à 4 oC.
3. Déloger le dôme de membrane du sous-sol à l'aide d'une pipette et écraser le dôme de membrane du sous-sol à l'aide d'une pointe de tuyauterie. Recueillir le dôme dissocié et la solution de récupération cellulaire dans un tube de 1,5 ml.
4. Centrifugeuse à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
5. Retirez le supernatant (solution de récupération cellulaire). Enregistrer tous les supernatants dans des tubes séparés jusqu'à la fin lorsque la présence d'organoïdes est confirmée dans l'étape finale de granulement.
6. Ajouter le volume désiré (tableau 3) de PBS froid et doucement pipette de haut en bas pour déranger mécaniquement les granulés.
7. Centrifugeuse à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
8. Retirez le supernatant (PBS).
9. Fixez la pastille dans un volume assorti (p. ex., 500 l pour une pastille de l'état de culture de 24 plaques de puits, tableau 3) de 4 % de PFA pendant 60 min à température ambiante.
10. Après fixation, centrifugeuse à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
11. Retirez le supernatant (PFA).
12. Laver avec un volume assorti (p. ex., 500 l pour une pastille de l'état de culture des 24 plaques de puits, tableau 3) de PBS et centrifugeuse à 300 x g et 4 oC pendant 5 min.
13. Préparer l'agarose chaude (2% d'agarose en PBS).
    REMARQUE : Ici, les granulés cellulaires pour les sections congelées peuvent être directement suspendus dans 200 L de composé OCT sans autre étape dans le Protocole 7.
14. Suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 200 l d'agarose (2 % en PBS).
    1. Immédiatement après l'ajout de l'agarose, détachez délicatement la pastille cellulaire de la paroi du tube de 1,5 ml à l'aide de l'aiguille de 25 G fixée à une seringue de 1 ml. Comme le montre la figure 3, si le granule cellulaire n'est pas physiquement détaché de la paroi du tube de 1,5 ml, il y a un risque de perdre tout ou partie de la pastille cellulaire pendant le processus d'intégration de l'agarose.
15. Attendez que l'agarose de 2% dans PBS soit complètement solidifiée.
16. Détachez le bloc d'agarose solidifié du tube de 1,5 ml à l'aide d'une aiguille de 25 G fixée à la seringue de 1 ml.
17. Transférer le bloc d'agarose détaché contenant le granule de cellules dans un nouveau tube de 1,5 ml.
18. Remplissez le tube avec 70% EtOH et procéder plus loin en utilisant le protocole conventionnel pour la déshydratation des tissus et l'incorporation de paraffine.

8. Histologie et cytochimie immunofluorescente (IFC) des organoïdes

1. Sélectionnez la diapositive (s) pour l'histologie ou l'IFC.
2. Avant d'initier le processus de coloration, découvrez où les cellules sont situées sur la diapositive et dessinez un cercle autour des cellules sur la diapositive à l'aide d'un marqueur.
3. Dessinez le périmètre autour du bord ou du bord de la glissière et où les cercles sont situés sur la glissière dans un cahier de laboratoire pour enregistrer leurs emplacements.
4. Effectuer la coloration désirée.
   REMARQUE : Au cours de ce processus, les cercles marqués disparaissent puisque le fabricant régulier n'est pas résistant aux produits chimiques. Même certains marqueurs permanents d'histologie peuvent être effacés pendant le processus de coloration.
5. Après le processus de coloration, placez la diapositive sur le dessin dans le cahier de laboratoire pour trouver l'emplacement des cellules sur la diapositive.

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Résultats

Des organoïdes 3D ont été établis avec succès à partir d'un modèle de xénogreffe dérivé de patient (PDX) du cancer de la prostate métastatique d'os (BMPC) aussi bien que directement du tissu métastatique patient de cancer de la prostate (figure 4). En bref, nos modèles de PDX de BMPC ont été établis par l'injection intra-fémorale (IF) des cellules de tumeur dans le Rag2^{mâle -/-} c^-/- souris et puis les tumeurs de PDX ont été moissonnées et traitées ...

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Discussion

Les organoïdes 3D dérivés des cellules cancéreuses de prostate de métastasie d'os patient sont encore relativement rares. Ici, nous décrivons des stratégies et le protocole optimisé de nouveau pour établir avec succès les organoïdes dérivés de patient 3D de série (PDO) de BMPC. En outre, des protocoles sont décrits pour fixer les organoïdes dans les échantillons avec la densité cellulaire inférieure pour l'analyse d'IFC et d'IHC. Les phénotypes différentiels sous forme de kyste, de sphéroïdes et d'...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Pipettman	Gilson	F123602
1 mL Syringe	BD Syringe	329654
1.5 mL tube	Spectrum Lab Products	941-11326-ATP083
25G Needle	BD PrecisionGlide Needle	305122
4% Paraformaldehyde (PFA)	Alfa Aesar	J61899
70% Ethanol (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
A83-01	Tocris Bioscience	2939
Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
adDMEM	Life Technologies	12634010
Agarose	Lonza	50000
Antibody -for Cytokeratin 5	Biolegend	905901
Antibody for Cytokeratin 8	Biolegend	904801
B27	Life Technologies	17504044
Bioluminescence imaging system, IVIS 200	Perkin Elmer Inc	IVIS 200
Cell Culture Plate - 24 well	Costar	3524
Cell Culture Plate - 48 well	Costar	3548
Cell Culture Plate - 6 well	Costar	3516
Cell Dissociation Solution, Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
Cell Recovery Solution	Corning	354253
Cell Scraper	Sarstedt	83.180
Cell Strainer	Falcon (Corning)	352350
CO2 incubator	Fisher Scientific	3546
DAPI	Vector Vectashield	H-1200
DHT	Sigma-Aldrich	D-073-1ML
dPBS	Corning/Cellgro	21-031-CV
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Gemini Bio-Products	100-106
FGF10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
Forceps	Denville Scientific	S728696
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
LS Columns	Miltenyi	130-0420401
Magnetic Column Seperator: QuadroMACS Separator	Miltenyi	130-090-976
Marker	VWR	52877-355
Matrigel (Growth Factor Reduced)	Mediatech Inc. (Corning)	356231
Matrigel (High Concentration)	BD (Fisher Scientific)	CB354248
Microscope Imaging Software, Keyence	BZ-X800 (newest software) BZ-X700 (old software)
Microscope, Keyence	BZ-X700 (model 2016-2017)/BZ-X710 (model 2018-2019)
Mouse Cell Depletion Kit	Miltenyi	130-104-694
N-Acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-100G
Noggin	PeproTech	120-10C
OCT Compound	Tissue-Tek	4583
Parafilm	American National Can	N/A
Pen-Strep	Mediatech Inc. (Corning)	30-002-CI-1
Pipette tipes for 1 mL (Blue Tips)	Fisherbrand Redi-Tip	21-197-85
Plunger (from 3 mL syringe)	BD Syringe	309657
Prostaglandin E2	Tocris Bioscience	2296
R-Spondin 1	Trevigen	3710-001-01
SB2021190	Sigma-Aldrich	S7076-25MG
Small Table Top Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75002426
Water Bath	Fisher Sci	2320
Y-27632 Dihydrochloride	Abmole Bioscience	M1817