Generación de organoides endometriales primarios humanos multicelulares

Resumen

Se presenta un protocolo para generar organoides endometriales primarios humanos que consisten en células epiteliales y estromales y retienen las características del tejido endometrial nativo. Este protocolo describe los métodos desde la adquisición de tejido uterino hasta el procesamiento histológico de organoides endometriales.

Resumen

El endometrio humano es uno de los tejidos más hormonalmente sensibles en el cuerpo y es esencial para el establecimiento del embarazo. Este tejido también puede enfermarse y causar morbilidad e incluso la muerte. Los sistemas modelo para estudiar la biología endometrial humana se han limitado a los sistemas de cultivo in vitro de tipos de células únicas. Además, las células epiteliales, uno de los principales tipos celulares del endometrio, no propagan bien ni conservan sus rasgos fisiológicos en el cultivo, y por lo tanto nuestra comprensión de la biología endometrial sigue siendo limitada. Hemos generado, por primera vez, organoides endometriales que consisten en células epiteliales y estromales del endometrio humano. Estos organoides no requieren ningún material de andamio exógeno y se organizan específicamente para que las células epiteliales abarquen la estructura similar a los esferoides y se polarericen con células estromales en el centro que producen y secretan colágeno. Los receptores de estrógeno, progesterona y andrógenos se expresan en las células epiteliales y estromales y el tratamiento con niveles fisiológicos de estrógeno y testosterona promueven la organización de los organoides. Este nuevo sistema modelo se puede utilizar para estudiar la biología endometrial normal y la enfermedad de maneras que antes no eran posibles.

Introducción

El endometrio humano recubre la cavidad uterina y sirve como primer contacto para el embrión durante la implantación. El endometrio se compone de células epiteliales luminales y glandulares, fibroblastos estromales de apoyo, células endoteliales y células inmunitarias. Juntos, estos tipos de células conforman el tejido endometrial que es uno de los tejidos más sensibles a las hormonas esteroides sexuales¹. Los cambios que ocurren durante cada ciclo menstrual son sorprendentes. Se requiere un crecimiento y remodelación adecuados del endometrio para permitir la implantación de embriones. Respuesta aberrante al estrógeno y la progesterona puede resultar en un endometrio refractario que no permite el establecimiento exitoso del embarazo e incluso puede resultar en enfermedades como la neoplasia endometrial.

Con el fin de estudiar las respuestas hormonales y los cambios esenciales que se producen en el endometrio, las células de los tejidos endometriales exhalados de los pacientes durante la cirugía o la biopsia endometrial se han propagado en el cultivo celular. Las células estromales endometriales proliferan y propagan fácilmente, y el proceso de diferenciación inducido por la progesterona puede recapitularse in vitro. Como resultado, mucho se ha aprendido durante este proceso de diferenciación, llamado decidualización^2,3. El otro tipo de célula importante en el endometrio, las células epiteliales luminales y glandulares, sin embargo, no crecen bien como las monocapas tradicionales, perdiendo polaridad, convirtiéndose en senescente, y teniendo un potencial proliferativo limitado. Como resultado, se sabe menos de su biología y su papel en el endometrio humano. Como muchas neoplasias se originan a partir de las células epiteliales, los mecanismos asociados con la hiperplasia o la transformación a las células cancerosas siguen estando completamente definidos. Además, los estudios han establecido que la respuesta hormonal implica las acciones paracrinos íntimas entre las células epiteliales y estromales del endometrio^4,5.

Recientemente, dos grupos independientes^6,7,que son los primeros informes de organoides formados a partir de tejido endometrial, estableció un cultivo organoide tridimensional (3D) de células epiteliales endometriales. Estos organoides estaban compuestos de células epiteliales endometriales incrustadas dentro de una matriz proteica(Tabla de Materiales)y no incluían un compartimiento sensible hormonalmente importante del endometrio endometrial, los fibroblastos estromales. Como las proteínas de la matriz pueden variar de un lote a un lote y pueden desencadenar vías de señalización que no necesariamente se producen en el tejido, sería ideal reemplazar las proteínas de matriz con componentes del endometrio. En el estudio actual, se presenta un protocolo para generar organoides endometriales humanos libres de andamios de células epiteliales y estromales del endometrio humano. La presencia de células estromales no sólo proporciona el apoyo a las células epiteliales, sino que también proporciona las acciones paracrinos necesarias que se han establecido para ser importantes para la respuesta de la hormona endometrial^4,8,9 .

El nuevo organoide endometrial multicelular ofrece un sistema modelo del endometrio que es fácil de generar y que incorpora células epiteliales y estromales. Estos organoides se pueden utilizar para estudiar cambios hormonales a largo plazo y eventos tempranos de enfermedad como la tumorigenesis debido a desequilibrio hormonal o insultos exógenos. La complejidad de estos organoides podría eventualmente ampliarse para incluir otros tipos celulares, incluyendo células endoteliales e inmunes con células posiblemente miometriales para imitar realmente la fisiología del tejido humano.

Protocolo

Se recogieron muestras de endometriales de mujeres premenopáusicas sometidas a histerectomía de rutina para afecciones uterinas benignas en el Hospital de Mujeres de la Universidad Northwestern Prentice, de acuerdo con un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todas las mujeres incluidas en el estudio.

1. Preparación de moldes de agarosa

1. Antes del inicio del aislamiento celular, moldee y equilibra 1.5% micromoldes de agarosa(Tabla de Materiales)para albergar los organoides de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2. Generación de organoides endometriales

1. Cosecha de células estromales y epiteliales primarias
   1. En un gabinete de bioseguridad utilizando una técnica aséptica, prepare la solución enzimática (2,5 mg/ml de colagenasa tipo I + 0,1 mg/ml de DNase I en 10 ml de dosis [500 unidades]) a 37 oC, y filtre estérilmente la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,2 m en un tubo cónico de 15 ml.
   2. En un gabinete de bioseguridad utilizando una técnica aséptica, raspa el endometrio de las biopsias uterinas y el tejido picado bajo el capó en trozos muy pequeños con un bisturí.
      NOTA: Se requiere tejido endometrial de al menos 20 mm x 10 mm x 1 mm para generar un número suficiente de organoides.
   3. Poner tejido recién picado en la solución enzimática en un tubo cónico de 15 ml. Cierre la tapa y envuelva la tapa con una película de cera(Tabla de materiales)para evitar la contaminación.
   4. Coloque el tubo con tejido en un baño de agua o una incubadora a 37 oC durante 30 minutos con un suave temblor (80-100 rpm).
   5. Apilar un colador de células de 100 m en la parte superior de un colador de células de 20 m en un tubo cónico de 50 ml. Filtrar la solución a través de los dos coladores, y luego enjuagar el tubo cónico de 15 ml con 10 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS; Tabla de Materiales) y poner el lavado a través del colador para asegurarse de que todas las células se recogen.
      NOTA: El líquido de flujo a través contiene células estromales y glóbulos rojos (20 ml en total). Las células epiteliales se recogen en el colador de 20 m. Los trozos de tejido no digerido permanecen encima del colador de 100 m. Deseche el tejido no digerido en un contenedor de residuos peligrosos.
   6. Invierta el colador de células de 20 m del paso 2.1.5 en un nuevo tubo cónico de 50 ml y lave las células epiteliales del colador con 20 ml de medios organoides(Tabla de materiales)complementados con 1% de pluma/estreptococo.
   7. Centrifugar los tubos cónicos de los escalones 2.1.5 y 2.1.6 a 500 x g durante 5 min.
   8. Con las células estromales recogidas, retire el sobrenadante y resuspenda el pellet con 10 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos.  Incubar a 37 oC durante 10 a 15 minutos. Centrifule el tubo cónico a 500 x g durante 5 min, retire el sobrenadante y resuspenda el pellet con 200 a 300 ml de medios organoides (consulte el paso 2.2.2 para obtener más instrucciones).
   9. Con las células epiteliales recogidas, retire el sobrenadante y vuelva a suspender con 100 s de medios organoides (consulte el paso 2.2.2 para obtener más instrucciones).
2. Células de sembrado
   1. Después de equilibrar los moldes de agarosa del 1,5% en pozos (1 molde por pozo) de una placa de 24 pocillos, retire los medios organoides en el exterior de los moldes de agarosa e incline la placa de cultivo de tejido para que el medio de la cámara de sembración celular de los platos de agarosa también pueda ser cuidadosamente retirados.
   2. Vea las suspensiones celulares epiteliales (del paso 2.1.9) y estromales (del paso 2.1.8) bajo el microscopio.  Añadir más medios organoides a las suspensiones de células epiteliales o estromales 100 oL a la vez, de modo que las suspensiones sean aproximadamente iguales en densidad.
      NOTA: Las células epiteliales se aglutinarán, y no es aconsejable digerir/trippsinizar las células epiteliales en suspensiones de una sola célula.
   3. Combine 1 parte de las células estromales con 3 partes de células epiteliales por volumen.
   4. Pipetear 50 l (60.000 células) de la suspensión de celda combinada en la cámara de sembración celular del molde de agarosa.
   5. Una vez que los moldes de agarosa se llenan de células, agregue cuidadosamente 400 ml de medios organoides frescos en el pozo de la placa de 24 pocillos.
      NOTA: El medio llega justo debajo de la superficie de los platos de agarosa y no hará que las células flotan fuera de los moldes. Después de 2 a 3 días, las células se asentarán y comenzarán a formar organoides.
   6. Cambie el medio cada segundo día con 500 ml de medios organoides.
   7. Después de 2-3 días, cambiar medio a uno que se complementa con 0.1 nM estradiol (E) y 0.8 nM testosterona (T) para promover la organización de células epiteliales y estromales.
      NOTA: Aunque la organización de las células epiteliales y estromales puede ocurrir con o sin hormonas, más organoides se organizarán en presencia de hormonas.

3. Cosecha de organoides endometriales para experimentos

NOTA: Una vez realizado el experimento, los organoides endometriales se pueden procesar para su histología o análisis de ARN. Los pasos siguientes describen cómo procesar los organoides.

1. Histología
   1. Disolver 1.5% agarosa en solución salina con fosfato (PBS) por ebullición. Deje que el agarosa líquida se enfríe a aproximadamente 50 oC.
   2. Bajo un microscopio de disección, incline la placa de 24 pocillos y pipetee cuidadosamente el medio desde el exterior del molde de agarosa. Pipetear cuidadosamente el medio del interior del molde de agarosa para evitar interrumpir los organoides.
   3. Bajo un microscopio de disección, pipeta cuidadosamente 70-75 s de caliente (50 oC) 1.5% agarose en la cámara de la placa de agarosa. Tenga cuidado de no molestar a los organoides.
   4. Dejar enfriar a 4oC durante 5 min.
   5. Añadir un 4% de paraformaldehído (PFA) en cada pocal de la placa de 24 pocillos y fijar todo el molde de agarosa sellada que contiene organoides durante la noche a 4 oC. Luego almacenar en 70% etanol a 4 oC hasta que esté listo para procesar para la incrustación de parafina.
2. Aislamiento de ARN
   1. Bajo un microscopio de disección, incline la placa de 24 pocillos y pipetee cuidadosamente el medio de la cámara del molde de agarosa.
   2. Pipeta forzosa de 1 ml de medio organoide fresco directamente en el molde de agarosa para que los organoides se expulsen de los micropozos. Tenga cuidado de no crear demasiadas burbujas.
   3. Repita el pipeteo de nuevo con el mismo medio del paso 3.2.2.
   4. Recoger todo el medio que contiene los organoides. Centrifugar a la velocidad máxima para recoger los organoides y proceder a la extracción de ARN.

Resultados

En la Figura 1se muestra un esquema del protocolo. El tejido uterino se obtuvo de la cirugía después de que fue examinado por los patólogos. El revestimiento endometrial se separó del miometrio raspando y el tejido endometrial se digería enzimáticamente a las células como se describe en el protocolo. Las células epiteliales y estromales se añadieron a los micropozos en los moldes de agarosa. Después de 7 días en cultivo, los organoides fueron tratados con E y T durante 7 a 14 día...

Discusión

Hemos generado organoides endometriales humanos compuestos por células epiteliales y estromales del endometrio sin el uso de materiales de andamios exógenos. Si bien ya se ha demostrado que las células epiteliales endometriales primarias pueden formar organoides^6,7, estas células se incrustaron en una matriz gelatinosa de proteínas secretadas por las células del sarcoma del ratón (ver Tabla de Materiales)para ayudar a forman estructuras es...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose HS, molecular biology grade	Denville Scientific	CA3510-6
Agarose molds	Sigma-Aldrich	Z764043	(https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl)	Amresco	0621
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257
Collagenase, Type II, powder	Thermo Fisher Scientific	17101015
Dispase	Corning	354235
DNase I	Sigma-Aldrich	D4513
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Eosin Stain	VWR	95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium	Sigma-Aldrich	F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution	Thermo Fisher Scientific	3530-32	Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution	STEMCELL Technologies	07980	added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution	STEMCELL Technologies	07925	added to MammoCult media
Organoid media - Mammocult	STEMCELL Technologies	05620	supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant	Agilent Technologies	M356801-2
protein matrix - Matrigel	BD Biosciences	356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody	BD Biociences	610181	Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]	Abcam	ab92547
RNA lysis and isolation kit	Zymo Research	R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Testosterone	Sigma-Aldrich	86500
Trichrome Stain	Abcam	ab150686
Wax film - Parafilm	VWR	52858-000