Generazione di organoidi endometriali primari umani multicellulari

Riepilogo

Viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali primari umani costituiti da cellule epiteliali e stromali e che conservano le caratteristiche del tessuto endometriale nativo. Questo protocollo descrive i metodi dall'acquisizione del tessuto uterino all'elaborazione istologica degli organoidi endometriali.

Abstract

L'endometrio umano è uno dei tessuti più ormonali reattivi nel corpo ed è essenziale per l'istituzione della gravidanza. Questo tessuto può anche diventare malato e causare morbilità e persino la morte. I sistemi modello per studiare la biologia endometriale umana sono stati limitati a sistemi di coltura in vitro di tipo a cellula singola. Inoltre, le cellule epiteliali, uno dei principali tipi di cellule dell'endometrio, non si propagano bene o mantengono i loro tratti fisiologici nella coltura, e quindi la nostra comprensione della biologia endometriale rimane limitata. Abbiamo generato, per la prima volta, organoidi endometriali costituiti da cellule epiteliali e stromali dell'endometrio umano. Questi organoidi non richiedono materiali di impalcatura esogeni e specificamente organizzano in modo che le cellule epiteliali comprendano la struttura simile a uno sferoide e diventino polarizzate con cellule stromali al centro che producono e secernono collagene. I recettori dell'estrogeno, del progesterone e dell'androgeno sono espressi nelle cellule epiteliali e stromali e il trattamento con livelli fisiologici di estrogeni e testosterone promuovono l'organizzazione degli organoidi. Questo nuovo sistema modello può essere utilizzato per studiare la biologia endometriale normale e la malattia in modi che prima non erano possibili.

Introduzione

L'endometrio umano allinea la cavità uterina e serve come primo contatto per l'embrione durante l'impianto. L'endometrio è composto da cellule epiteliali luminali e ghiandolari, fibroblasti stromali di supporto, cellule endoteliali e cellule immunitarie. Insieme, questi tipi di cellule costituiscono il tessuto endometriale che è uno dei tessuti più reattivi agli ormoni steroidei sessuali¹. I cambiamenti che si verificano durante ogni ciclo mestruale sono sorprendenti. È necessaria un'adeguata crescita e rimodellamento dell'endometrio per consentire l'impianto dell'embrione. La risposta aberrante agli estrogeni e al progesterone può provocare un endometrio refrattario che non consente l'istituzione di una gravidanza di successo e può anche provocare malattie tra cui la neoplasia endometriale.

Al fine di studiare le risposte ormonali e i cambiamenti essenziali che si verificano nell'endometrio, le cellule dei tessuti endometriali eccitate dai pazienti durante l'intervento chirurgico o la biopsia endometriale sono state propagate nella coltura cellulare. Le cellule stromali endometriali proliferano preferibilmente e si propagano prontamente, e il processo di differenziazione indotto dal progesterone può essere ricapitolato in vitro. Di conseguenza, molto è stato appreso durante questo processo di differenziazione, definito deciduizzazione^2,3. L'altro tipo di cellula principale nell'endometrio, le cellule epiteliali luminali e ghiandolare, tuttavia, non crescono così come i monostrati tradizionali, perdendo la polarità, diventando senescenti e con un limitato potenziale proliferare. Di conseguenza, meno è noto della loro biologia e del loro ruolo nell'endometrio umano. Poiché molti neoplasia provengono dalle cellule epiteliali, i meccanismi associati all'iperplasia o alla trasformazione nelle cellule tumorali rimangono da definire completamente. Inoltre, gli studi hanno stabilito che la risposta ormonale coinvolge le azioni paracrine intime tra le cellule epiteliali e stromali dell'endometrio^4,5.

Recentemente, una coltura organoide tridimensionale (3D) di cellule epiteliali endometriali è stata stabilita da due gruppi indipendenti^6,7, che sono i primi rapporti di organoidi formati dal tessuto endometriale. Questi organoidi erano costituiti da cellule epiteliali endometriali incorporate all'interno di una matrice proteica (Table of Materials) e non includevano un importante compartimento ormonale reattivo dell'endometrio endometriale, i fibroblasti stromali. Poiché le proteine della matrice possono variare da un lotto all'altro e possono innescare percorsi di segnalazione che non si verificano necessariamente nel tessuto, sarebbe ideale sostituire le proteine della matrice con componenti dell'endometrio. Nello studio attuale, viene presentato un protocollo per generare organoidi endometriali umani privi di scaffold di cellule epiteliali e stromali dell'endometrio umano. La presenza di cellule stromali non solo fornisce il supporto per le cellule epiteliali, ma fornisce anche le azioni paracrine necessarie che sono state stabilite per essere importanti per la risposta dell'ormone endometriale^4,8,9 .

Il nuovo organoide endometriale multicellulare offre un sistema modello dell'endometrio che è semplice da generare e che incorpora cellule epiteliali e stromali. Questi organoidi possono essere utilizzati per studiare i cambiamenti ormonali a lungo termine e i primi eventi di malattia come la tumorigenesi a causa di squilibri ormonali o insulti esogeni. La complessità di questi organoidi potrebbe infine essere ampliata per includere altri tipi di cellule, tra cui cellule endoteliali e immunitarie con cellule potenzialmente miometriali per imitare veramente la fisiologia del tessuto umano.

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Protocollo

Campioni endometriali sono stati raccolti da donne in premenopausa sottoposte a isterectomia di routine per condizioni uterine benigne presso il Northwestern University Prentice Women's Hospital, secondo un protocollo approvato dall'Institutional Review Board. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutte le donne incluse nello studio.

1. Preparazione delle muffe Agarose

1. Prima di iniziare l'isolamento cellulare, lanciare ed eclicare 1,5% di micro stampi agarose (Tabella dei materiali) per ospitare gli organoidi secondo le istruzioni del produttore.

2. Generazione di organoidi endometriali

1. Raccogliere cellule stromali ed epiteliali primarie
   1. In un armadio di biosicurezza con tecnica asettica, preparare la soluzione enzimatica (2,5 mg/mL di tipo collagenase I - 0,1 mg/mL DNase I in 10 mL di dispasi [500 unità]) a 37 mL, e sterile-filtro la soluzione utilizzando un filtro di siringa 0,2 m in un tubo conico 15 mL.
   2. In un armadio di biosicurezza con tecnica asettica, raschiare l'endometrio dalle biopsie uterine e macinare il tessuto sotto il cappuccio in pezzi molto piccoli con un bisturi.
      NOT: Il tessuto endometriale di almeno 20 mm x 10 mm x 1 mm è necessario per generare un numero sufficiente di organoidi.
   3. Mettere il tessuto appena macinato nella soluzione enzimatica in un tubo conico da 15 mL. Chiudere il tappo e avvolgere la parte superiore con una pellicola di cera (Tabella dei materiali) per evitare la contaminazione.
   4. Mettete il tubo con il tessuto in un bagno d'acqua o in un'incubatrice a 37 gradi centigradi per 30 min con agitazione delicata (80-100 giri/m).
   5. Impilare un colino a 100 m sopra un colino da 20 m su un tubo conico da 50 ml. Filtrare la soluzione attraverso i due ceppi, quindi sciacquare il tubo conico da 15 mL con 10 mL di soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS; Tabella dei materiali) e mettere il lavaggio attraverso il colino per garantire che tutte le cellule siano raccolte.
      NOT: Il liquido fluivo contiene globuli stromali e globuli rossi (20 mL in totale). Le cellule epiteliali vengono raccolte sul colino da 20 m. Pezzi di tessuto non digerito rimangono in cima al colino da 100 m. Eliminare il tessuto non digerito in un contenitore di rifiuti di pericolo biologico.
   6. Invertire il colino a 20 m dal passo 2.1.5 su un nuovo tubo conico da 50 ml e lavare le cellule epiteliali dal colino con 20 mL di supporti organoidi (Tabella dei materiali) completate con 1% di penna/strep.
   7. Centrifugare i tubi conici da passi 2.1.5 e 2.1.6 a 500 x g per 5 min.
   8. Con le cellule strone raccolte, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet con 10 mL di lisi di lissi dei globuli rossi.  Incubare a 37oC per 10-15 min. Centrifugare il tubo conico a 500 x g per 5 min, rimuovere il supernatante, e sospendere nuovamente il pellet con 200'300 l di supporti organoidi (vedere passo 2.2.2 per ulteriori istruzioni).
   9. Con le cellule epiteliali raccolte, rimuovere il sovratalgarico e sospendere nuovamente con 100 -L di supporti organoidi (vedere il passaggio 2.2.2 per ulteriori istruzioni).
2. Seeding cellule
   1. Dopo aver equilibrato l'1,5% di stampi agarose in pozzetti (1 stampo per pozzo) di una piastra di 24 pozzetti, rimuovere i supporti organoidi all'esterno degli stampi agarose e inclinare la piastra di coltura del tessuto in modo che il mezzo dalla camera di semina cellulare dei piatti agarose può anche essere accuratamente rimosso.
   2. Visualizzare le sospensioni epiteliali (dal punto 2.1.9) e stromali (dal punto 2.1.8) delle sospensioni cellulari al microscopio.  Aggiungere più supporti organoidi alle sospensioni delle cellule epiteliali o stromali 100 gradi alla volta, in modo che le sospensioni siano approssimativamente uguali in densità.
      NOT: Le cellule epiteliali si aggregano insieme, e non è consigliabile digerire / provare le cellule epitiniali in sospensioni a cella singola.
   3. Combina 1 parte delle cellule stromali con 3 parti di cellule epiteliali per volume.
   4. Pipetta 50 L (60.000 cellule) della sospensione cellulare combinata nella camera di semina cellulare dello stampo agarose.
   5. Una volta che gli stampi di agarose sono riempiti con le cellule, aggiungere con cura 400 - L di supporti organoidi freschi nel pozzo della piastra di 24 pozze.
      NOT: Il mezzo raggiunge appena sotto la superficie dei piatti agarose e non farà galleggiare le cellule fuori dagli stampi. Dopo 2/3 giorni, le cellule si depositano e iniziano a formare organoidi.
   6. Cambiare media ogni due giorni con 500 -L di supporti organoidi.
   7. Dopo 2-3 giorni, cambiare medio a uno che è integrato con 0.1 nM estradiol (E) e 0.8 nM di testosterone (T) per promuovere l'organizzazione delle cellule epiteliali e stromali.
      NOT: Anche se l'organizzazione delle cellule epiteliali e stromali può verificarsi con o senza ormoni, più organoidi si organizzeranno in presenza di ormoni.

3. Raccolta degli organidi endometriali per gli esperimenti

NOT: Una volta fatto l'esperimento, gli organoidi endometriali possono essere elaborati per l'istologia o l'analisi dell'RNA. I passaggi seguenti descrivono come elaborare gli organoidi.

1. Istologia
   1. Sciogliere l'1,5% di agarose nella salina con buffer fosfato (PBS) bollendo. Lasciare raffreddare l'agarose liquido a circa 50 gradi centigradi.
   2. Sotto un microscopio dissettivo, inclinare la piastra di 24 pozze e pipetta con attenzione fuori dal mezzo dall'esterno dello stampo agarose. Attentamente pipette fuori il mezzo dall'interno dello stampo agarose per evitare di interrompere gli organoidi.
   3. Al microscopio sezionato, con cura la pipetta 70-75 - L di caldo (50 oC) 1,5% agarose nella camera del piatto di agarose. Fare attenzione a non disturbare gli organoidi.
   4. Lasciar raffreddare a 4 gradi centigradi per 5 min.
   5. Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) in ogni pozzetto della piastra 24 e fissare l'intero stampo agarose sigillato contenente organoidi durante la notte a 4 gradi centigradi. Quindi conservare nel 70% di etanolo a 4 gradi centigradi fino a quando non è pronto per l'elaborazione per l'incorporamento della paraffina.
2. Isolamento dell'RNA
   1. Al microscopio dissezioso, inclinare la piastra di 24 pozze e pipetta con attenzione fuori dalla camera dello stampo agarose.
   2. Con forza pipetta 1 mL di mezzo organoide fresco direttamente nello stampo agarose in modo che gli organoidi vengano scaricati dai micropozzi. Fare attenzione a non creare troppe bolle.
   3. Ripetere la pipa con lo stesso supporto dal passaggio 3.2.2.
   4. Raccogliere tutto il mezzo contenente gli organoidi. Centrifuga a velocità massima per raccogliere gli organoidi e procedere all'estrazione dell'RNA.

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Risultati

Uno schema del protocollo è illustrato nella Figura 1. Il tessuto uterino è stato ottenuto da un intervento chirurgico dopo che è stato esaminato dai patologi. Il rivestimento endometriale è stato separato dal miometrio raschiando e il tessuto endometriale è stato enzimaticamente digerito alle cellule come delineato nel protocollo. Le cellule epiteliali e stromali sono state aggiunte nei micropozzi negli stampi agarose. Dopo 7 giorni di coltura, gli organoidi sono stati trattati con E e...

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Discussione

Abbiamo generato organoidi endometriali umani composti da cellule epiteliali e stromali dell'endometrio senza l'uso di materiali scaffold esogeni. Mentre è già stato dimostrato che le cellule epiteliali endometriali primarie possono formare organoidi^6,7, queste cellule sono state incorporate in una matrice gelatinosa di proteine secrete da cellule di sarcoma del topo (vedi Tabella dei materiali)per aiutare formano strutture simili a sferoidi. I...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose HS, molecular biology grade	Denville Scientific	CA3510-6
Agarose molds	Sigma-Aldrich	Z764043	(https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl)	Amresco	0621
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257
Collagenase, Type II, powder	Thermo Fisher Scientific	17101015
Dispase	Corning	354235
DNase I	Sigma-Aldrich	D4513
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Eosin Stain	VWR	95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium	Sigma-Aldrich	F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution	Thermo Fisher Scientific	3530-32	Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution	STEMCELL Technologies	07980	added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution	STEMCELL Technologies	07925	added to MammoCult media
Organoid media - Mammocult	STEMCELL Technologies	05620	supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant	Agilent Technologies	M356801-2
protein matrix - Matrigel	BD Biosciences	356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody	BD Biociences	610181	Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]	Abcam	ab92547
RNA lysis and isolation kit	Zymo Research	R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Testosterone	Sigma-Aldrich	86500
Trichrome Stain	Abcam	ab150686
Wax film - Parafilm	VWR	52858-000