Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

Resumo

Um protocolo para gerar os organóides endometrial preliminares humanos que consistem em pilhas epithelial e stromal e retêm características do tecido endometrial nativo é apresentado. Este protocolo descreve métodos da aquisição uterine do tecido ao processamento histologic de organoids endometrial.

Resumo

O endométrio humano é um dos tecidos mais responsivos hormonalmente no corpo e é essencial para o estabelecimento da gravidez. Este tecido também pode tornar-se doente e causar morbidade e até mesmo a morte. Os sistemas modelo para estudar a biologia endometrial humana foram limitados aos sistemas in vitro da cultura de únicos tipos da pilha. Além disso, as células epiteliais, um dos principais tipos de células do endométrio, não se propagam bem ou mantêm suas características fisiológicas na cultura e, portanto, nossa compreensão da biologia endometrial permanece limitada. Nós geramos, pela primeira vez, os organóides endometrial que consistem em pilhas epithelial e stromal do endométrio humano. Estes organóides não exigem nenhuns materiais exógenos do andaime e organizam-se especificamente de modo que as pilhas epithelial engloquem a estrutura spheroid-like e se tornem polarizada com as pilhas stromal no centro que produzem e secretam o colagénio. Os receptores de estrogênio, progesterona e andrógeno são expressos nas células epiteliais e estromais e tratamento com níveis fisiológicos de estrogênio e testosterona promovem a organização dos organóides. Este novo modelo de sistema pode ser usado para estudar a biologia endometrial normal e doença de maneiras que não eram possíveis antes.

Introdução

O endométrio humano alinha a cavidade uterine e sere como o primeiro contato para o embrião durante a implantação. O endométrio é composto de células epiteliais luminais e glandulares, fibroblastos estromais favoráveis, células endoteliais e células imunes. Juntos, esses tipos de células compõem o tecido endometrial, que é um dos tecidos mais responsivos aos hormônios esteróides sexuais¹. As mudanças que ocorrem durante cada ciclo menstrual são impressionantes. O crescimento e a remodelação apropriados do endométrio são exigidos para permitir que a implantação do embrião ocorra. A resposta aberrante ao estrogênio e progesterona pode resultar em um endométrio refratário que não permite o estabelecimento bem-sucedido da gravidez e pode até resultar em doenças, incluindo neoplasia endometrial.

A fim de estudar as respostas hormonais e alterações essenciais que ocorrem no endométrio, as células dos tecidos endometriais extirpada de pacientes durante a cirurgia ou biópsia endometrial têm sido propagadas na cultura celular. Células estromais endometriais preferencialmente proliferam e se propagam prontamente, e o processo de diferenciação induzido pela progesterona pode ser recapitulado in vitro. Como resultado, muita coisa foi aprendida durante esse processo de diferenciação, denominada decidualização^2,3. O outro tipo principal da pilha no endométrio, as pilhas epithelial Luminal e glandular, entretanto, não cresce bem como monolayers tradicionais, perdendo a polaridade, tornando-se senescent, e tendo o potencial proliferative limitado. Como resultado, menos é conhecido de sua biologia e seu papel no endométrio humano. Como muitas Neoplasias se originam das células epiteliais, os mecanismos associados à hiperplasia ou transformação de células cancerosas permanecem totalmente definidos. Além disso, estudos estabeleceram que a resposta hormonal envolve as ações paracrinas íntimas entre as células epiteliais e estromais do endométrio^4,5.

Recentemente^{, uma}cultura organoid tridimensional (3D) de pilhas epithelial endometrial foi estabelecida por dois grupos independentes^{6,7, que}são os primeiros relatórios dos organóides dados forma do tecido endometrial. Estes organóides foram compreendidos das pilhas epithelial endometrial encaixadas dentro de uma matriz da proteína (tabela dos materiais) e não incluiu um compartimento hormonalmente responsivo importante do endométrio endometrial, os fibroblasto stromal. Como as proteínas da matriz podem variar de lote para lote e pode desencadear vias de sinalização que não ocorrem necessariamente no tecido, seria ideal para substituir as proteínas da matriz com componentes do endométrio. No estudo atual, um protocolo para gerar organóides endometrial humanos Scaffold-livres de pilhas epithelial e stromal do endométrio humano é apresentado. A presença de células estromais não só fornece o suporte para células epiteliais, mas também fornece as ações paracrinas necessárias que foram estabelecidas para serem importantes para a resposta hormonal endometrial^4,8,9 .

O organoid endometrial multicelular novo oferece um sistema modelo do endométrio que é simples de gerar e que incorpora pilhas epithelial e stromal. Estes organóides podem ser usados para estudar as mudanças hormonais a longo prazo e os eventos adiantados da doença tais como o tumorigênese devido ao desequilíbrio hormonal ou aos insultos exógenos. A complexidade destes organóides poderia eventualmente ser expandida para incluir outros tipos da pilha, incluindo pilhas endothelial e imunes com as pilhas possivelmente myometrial para imitar verdadeiramente a fisiologia humana do tecido.

Protocolo

Amostras endometriais foram coletadas de mulheres na pré-menopausa submetidas à histerectomia de rotina para condições uterinas benignas no hospital das mulheres da Universidade do noroeste, de acordo com protocolo aprovado pelo Conselho de revisão institucional. O consentimento por escrito foi obtido de todas as mulheres incluídas no estudo.

1. preparação de moldes de agarose

1. Antes do início da célula de isolamento, elenco e equilibrar 1,5% agarose micro moldes (tabela de materiais) para abrigar os organóides de acordo com as instruções do fabricante.

2. geração de Organoides endometriais

1. Colheita de células estromal primárias e epiteliais
   1. Em um gabinete de biossegurança usando técnica asséptica, prepare a solução enzimática (2,5 mg/ml de colagenase tipo i + 0,1 mg/ml DNase i em 10 ml de Dispase [500 unidades]) a 37 ° c e esterilizado-filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,2 μm em um tubo cônico de 15 ml.
   2. Em um gabinete de biossegurança usando técnica asséptica, raspar o endométrio das biópsias uterinas e picar o tecido a capa em pedaços muito pequenos com um bisturi.
      Nota: O tecido endometrial com pelo menos 20 mm x 10 mm x 1 mm é necessário para gerar números suficientes de organóides.
   3. Coloque o tecido recém-picado na solução enzimática em um tubo cônico de 15 mL. Feche a tampa e enrole a parte superior com um filme de cera (tabela de materiais) para evitar a contaminação.
   4. Põr o tubo com o tecido em um banho de água ou em uma incubadora em 37 ° c por 30 minutos com agitação delicada (80 − 100 RPM).
   5. Empilhe um filtro de células de 100 μm na parte superior de um filtro de célula de 20 μm em um tubo cônico de 50 mL. Filtre a solução através dos dois filtros e, em seguida, enxague o tubo cônico de 15 mL com 10 mL da solução de sal balanceada de Hank (HBSS; Tabela de materiais) e põr a lavagem através do filtro para assegurar-se de que todas as pilhas estejam coletadas.
      Nota: O líquido de fluxo-através contem pilhas stromal e glóbulos vermelhos (~ 20 mL total). As células epiteliais são coletadas no filtro de 20 μm. Os pedaços de tecido não digerido permanecem em cima do filtro de 100 μm. Descarte o tecido não digerido em um recipiente de resíduos de risco biológico.
   6. Inverta o filtro de células de 20 μm da etapa 2.1.5 para um novo tubo cônico de 50 mL e lave as células epiteliais fora do filtro com 20 mL de meio organoide (tabela de materiais) suplementado com 1% de caneta/Strep.
   7. Centrifugue os tubos cônicos das etapas 2.1.5 e 2.1.6 em 500 x g por 5 min.
   8. Com as células estromais coletadas, retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet com 10 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos.  Incubar a 37 ° c por 10 − 15 min. centrifugar o tubo cônico a 500 x g durante 5 min, retirar o sobrenadante e ressuscite o pellet com 200 − 300 μL de meio organoide (ver passo 2.2.2 para mais instruções).
   9. Com as células epiteliais coletadas, retire o sobrenadante e Resuspenda com 100 μL de meio organoide (ver passo 2.2.2 para mais instruções).
2. Células de semeadura
   1. Após equilibrar os moldes do agarose de 1,5% nos poços (1 molde por o poço) de uma placa de 24 poços, remova meios organoid na parte externa dos moldes do agarose e incline a placa da cultura do tecido de modo que o meio da câmara de semeadura da pilha dos pratos do agarose possa igualmente ser cuidadosamente removidos.
   2. Veja as suspensões epiteliais (da etapa 2.1.9) e stromal (da etapa 2.1.8) o microscópio.  Adicione mais meios organoid às suspensões epithelial ou stromal da pilha 100 μL em um momento, de modo que as suspensões sejam aproximadamente iguais na densidade.
      Nota: Células epiteliais irão se juntar, e não é aconselhável para digerir/Trypsinize células epiteliais em suspensões de células únicas.
   3. Combine 1 parte de pilhas stromal com 3 porções de pilhas epithelial pelo volume.
   4. Pipeta 50 μL (60.000 pilhas) da suspensão combinada da pilha na câmara de semeadura da pilha do molde do agarose.
   5. Uma vez que os moldes do agarose são enchidas com as pilhas, adicione com cuidado 400 μL de meios organoid frescos no poço da placa 24-well.
      Nota: O meio atinge logo abaixo da superfície dos pratos de agarose e não fará com que as células flutuem para fora dos moldes. Após 2 − 3 dias, as células se instalam e começam a formar organóides.
   6. Mude o meio cada segundo dia com 500 μL de meios organoid.
   7. Após 2-3 dias, mude o meio a um que é suplementado com o estradiol de 0,1 nanômetro (E) e a testosterona de 0,8 nanômetro (T) para promover a organização de pilhas epithelial e stromal.
      Nota: Embora a organização de pilhas epithelial e stromal possa ocorrer com ou sem hormonas, mais organóides organizará na presença de hormonas.

3. colhendo Organoides endometriais para experimentos

Nota: Depois que o experimento é feito, os organóides endometriais podem ser processados para histologia ou análise de RNA. As etapas a seguir descrevem como processar os organóides.

1. Histologia
   1. Dissolva 1,5% de agarose em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS) por ebulição. Permita que o agarose líquido esfrie a aproximadamente 50 ° c.
   2. um microscópio de dissecação, incline a placa 24-well e pipeta com cuidado para fora o meio da parte externa do molde do agarose. Cuidadosamente pipeta para fora o meio do interior do molde do agarose para evitar interromper os organóides.
   3. um microscópio de dissecação, cuidadosamente Pipetar 70-75 μL de quente (50 ° c) 1,5% agarose na câmara do prato de agarose. Tenha cuidado para não perturbar os organóides.
   4. Deixe esfriar a 4 ° c por 5 min.
   5. Adicione o paraformaldeído de 4% (PFA) em cada poço da placa de 24 poços e fixe o molde selado inteiro do agarose que contem organóides durante a noite em 4 ° c. Em seguida, armazene em 70% etanol a 4 ° c até estar pronto para o processo de incorporação de parafina.
2. Isolação do RNA
   1. um microscópio de dissecação, incline a placa 24-well e pipeta com cuidado para fora o meio da câmara do molde do agarose.
   2. A pipeta forcefully 1 ml do meio organoid fresco diretamente no molde do agarose assim que os organóides são liberados fora dos micropoços. Tenha cuidado para não criar muitas bolhas.
   3. Repita a pipetagem novamente com o mesmo meio da etapa 3.2.2.
   4. Colete todo o meio contendo os organóides. Centrifugue na velocidade máxima para recolher os organóides e para proceder à extração do RNA.

Resultados

Um esquema do protocolo é representado na Figura 1. O tecido uterine foi obtido da cirurgia depois que foi examinado por patologistas. O forro endometrial foi separado do miométrio raspando e o tecido endometrial foi digerido enzimaticamente às pilhas como esboçado no protocolo. As pilhas epithelial e stromal foram adicionadas em micropoços nos moldes do agarose. Após 7 dias na cultura, os organóides foram tratados com o e e o T por uns 7 − 14 dias adicionais.

Discussão

Nós geramos os organóides endometrial humanos compreendidos das pilhas epithelial e stromal do endométrio sem o uso de materiais exógenos do andaime. Embora já tenha sido demonstrado que as células epiteliais do endométrio primário podem formar organóides^{6,7, essas}células foram encaixadas em uma matriz gelatinosa de proteínas secretadas por células de sarcoma de camundongo (ver tabela de materiais) para ajudar forma spheroid-como estr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose HS, molecular biology grade	Denville Scientific	CA3510-6
Agarose molds	Sigma-Aldrich	Z764043	(https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl)	Amresco	0621
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257
Collagenase, Type II, powder	Thermo Fisher Scientific	17101015
Dispase	Corning	354235
DNase I	Sigma-Aldrich	D4513
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Eosin Stain	VWR	95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium	Sigma-Aldrich	F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution	Thermo Fisher Scientific	3530-32	Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution	STEMCELL Technologies	07980	added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution	STEMCELL Technologies	07925	added to MammoCult media
Organoid media - Mammocult	STEMCELL Technologies	05620	supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant	Agilent Technologies	M356801-2
protein matrix - Matrigel	BD Biosciences	356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody	BD Biociences	610181	Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]	Abcam	ab92547
RNA lysis and isolation kit	Zymo Research	R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Testosterone	Sigma-Aldrich	86500
Trichrome Stain	Abcam	ab150686
Wax film - Parafilm	VWR	52858-000