Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Erzeugung menschlicher primärer Endometrium-Organoide, die aus epithelialer und stromaler Zellen bestehen und Eigenschaften des nativen Endometriumgewebes beibehalten, wird vorgestellt. Dieses Protokoll beschreibt Methoden von der Erfassung des Gebärmuttergewebes bis zur histologischen Verarbeitung von Endometriumorganoiden.

Zusammenfassung

Das menschliche Endometrium ist eines der hormonell ansprechbarsten Gewebe im Körper und ist für die Etablierung einer Schwangerschaft unerlässlich. Dieses Gewebe kann auch krank werden und Morbidität und sogar Tod verursachen. Modellsysteme zur Untersuchung der Humanendometriumbiologie sind auf In-vitro-Kultursysteme einzelner Zelltypen beschränkt. Darüber hinaus vermehren sich die Epithelzellen, eine der wichtigsten Zelltypen des Endometriums, nicht gut oder behalten ihre physiologischen Merkmale in der Kultur, und so bleibt unser Verständnis der Endometriumbiologie begrenzt. Wir haben zum ersten Mal Endometrium-Organoide erzeugt, die sowohl epitheliale als auch stromale Zellen des menschlichen Endometriums bestehen. Diese Organoide benötigen keine exogenen Gerüstmaterialien und organisieren sich gezielt so, dass Epithelzellen die sphäroidartige Struktur umfassen und mit Stromalzellen in der Mitte polarisieren, die Kollagen produzieren und absondern. Östrogen, Progesteron und Androgen-Rezeptoren werden in den epitheliaalen und stromalen Zellen exprimiert und Die Behandlung mit physiologischen Niveaus von Östrogen und Testosteron fördern die Organisation der Organoide. Dieses neue Modellsystem kann verwendet werden, um normale Endometriumbiologie und Krankheiten auf eine Weise zu studieren, die vorher nicht möglich war.

Einleitung

Das menschliche Endometrium säumt die Gebärmutterhöhle und dient als erster Kontakt für den Embryo während der Implantation. Das Endometrium besteht aus luminalen und drüsen Epithelzellen, unterstützenden stromalen Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen. Zusammen bilden diese Zelltypen das Endometriumgewebe, das eines der reaktionsschnellsten Gewebe für Sexualsteroidhormone^{ist 1}. Die Veränderungen, die während jedes Menstruationszyklus auftreten, sind auffallend. Ein angemessenes Wachstum und eine Umgestaltung des Endometriums ist erforderlich, damit eine Embryoimplantation möglich ist. Eine aberrante Reaktion auf Östrogen und Progesteron kann zu einem feuerfesten Endometrium führen, das keine erfolgreiche Etablierung einer Schwangerschaft zulässt und sogar zu Krankheiten wie endometriener Neoplasie führen kann.

Um die Hormonreaktionen und wesentlichen Veränderungen im Endometrium zu untersuchen, wurden Zellen aus Endometriumgeweben, die von Patienten während der Operation oder der Endometriumbiopsie entnommen wurden, in der Zellkultur vermehrt. Endometrium-Stromalzellen vermehren sich bevorzugt und vermehren sich leicht, und der durch Progesteron induzierte Differenzierungsprozess kann in vitro rekapituliert werden. Als Ergebnis wurde während dieses Differenzierungsprozesses viel gelernt, die so genannten Dezidualisierung^2,3. Der andere große Zelltyp im Endometrium, die luminalen und drüsigen Epithelzellen, wachsen jedoch nicht gut als traditionelle Monolayer, verlieren Polarität, werden seneszierend und haben ein begrenztes proliferatives Potenzial. Infolgedessen ist weniger über ihre Biologie und ihre Rolle im menschlichen Endometrium bekannt. Da viele Neoplasie aus den Epithelzellen stammen, müssen Mechanismen, die mit Hyperplasie oder Transformation in Krebszellen verbunden sind, noch vollständig definiert werden. Darüber hinaus haben Studien festgestellt, dass die Hormonreaktion die intimen parakrinen Aktionen zwischen den epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums^4,5umfasst.

Kürzlich wurde eine dreidimensionale (3D) Organoidkultur von endometriellen Epithelzellen von zwei unabhängigen Gruppen^6,7, die erste Berichte über Organoide aus Endometriumgewebe sind. Diese Organoide bestanden aus endometrialen Epithelzellen, die in eine Proteinmatrix (Tabelle der Materialien)eingebettet waren, und enthielten kein wichtiges hormonell reaktionsfähiges Fach des Endometriums, die stromalen Fibroblasten. Da die Matrixproteine von Los zu Los variieren und Signalwege auslösen können, die nicht unbedingt im Gewebe vorkommen, wäre es ideal, die Matrixproteine durch Komponenten des Endometriums zu ersetzen. In der aktuellen Studie wird ein Protokoll zur Erzeugung von gerüstfreien menschlichen Endometriumorganoiden epitheliale und stromalen Zellen des menschlichen Endometriums vorgestellt. Das Vorhandensein von Stromalzellen bietet nicht nur die Unterstützung für Epithelzellen, sondern auch die notwendigen parakrinen Aktionen, die für die Endometriumhormonreaktion^{4,8,9 wichtig sein sollen.} .

Das neue multizelluläre Endometriumorganoid bietet ein Modellsystem des Endometriums, das einfach zu erzeugen ist und sowohl epitheliale als auch stromale Zellen umfasst. Diese Organoide können verwendet werden, um langfristige hormonelle Veränderungen und frühe Ereignisse von Krankheiten wie Tumorigenese aufgrund von hormonellen Ungleichgewicht oder exogene Beleidigungen zu studieren. Die Komplexität dieser Organoide könnte schließlich auf andere Zelltypen erweitert werden, einschließlich endotheliale und Immunzellen mit möglicherweise myometrialen Zellen, um die Physiologie des menschlichen Gewebes wirklich nachzuahmen.

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Protokoll

Endometriale Proben wurden von prämenopausalen Frauen gesammelt, die sich einer routinemäßigen Hysterektomie für gutartige Gebärmuttererkrankungen im Northwestern University Prentice Women es Hospital unterziehen, gemäß einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll. Die schriftliche Zustimmung wurde von allen Frauen eingeholt, die in die Studie einbezogen wurden.

1. Herstellung von Agarose-Formen

1. Vor Beginn der Zellisolierung 1,5% Agarose-Mikroformen(Materialtabelle) gießen und ausdemieren, um die Organoide gemäß den Anweisungen des Herstellers zu beherbergen.

2. Erzeugung von Endometrium-Organoiden

1. Ernte primäre stromal- und epitheliale Zellen
   1. In einem Biosicherheitsschrank mit aseptischer Technik Enzymlösung (2,5 mg/ml Kollagenase Typ I + 0,1 mg/ml DNase I in 10 ml Dispase [500 Einheiten]) bei 37 °C vorbereiten und die Lösung mit einem 0,2 m-Spritzenfilter in ein 15 ml konisches Rohr steril filtern.
   2. In einem Biosicherheitsschrank mit aseptischer Technik Endometrium aus den Gebärmutterbiopsien abkratzen und Gewebe unter der Haube in sehr kleine Stücke mit einem Skalpell zerkleinern.
      HINWEIS: Endometriumgewebe, das mindestens 20 mm x 10 mm x 1 mm beträgt, ist erforderlich, um eine ausreichende Anzahl von Organoiden zu erzeugen.
   3. In einer 15 ml konischen Röhre frisch gehacktes Gewebe in die Enzymlösung geben. Schließen Sie die Kappe und wickeln Sie die Oberseite mit einem Wachsfilm (Materialtabelle), um eine Kontamination zu verhindern.
   4. Das Rohr mit Gewebe in ein Wasserbad oder einen Inkubator bei 37 °C 30 min mit sanftem Schütteln (80 bis 100 U/min) geben.
   5. Stapeln Sie ein 100-m-Zellsieb auf einem 20-m-Zellsieb auf einem 50 ml konischen Röhrchen. Filtern Sie die Lösung durch die beiden Siebe und spülen Sie dann das 15 ml konische Rohr mit 10 ml der ausgewogenen Salzlösung von Hank (HBSS; Materialtabelle) und legen Sie die Wäsche durch das Sieb, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt werden.
      HINWEIS: Die Durchflussflüssigkeit enthält Stromalzellen und rote Blutkörperchen (insgesamt ca. 20 ml). Epithelzellen werden auf dem 20-m-Sieb gesammelt. Brocken unverdautes Gewebe verbleiben auf dem 100 m Sieb. Entsorgen Sie unverdautes Gewebe in einen Biorisiko-Abfallbehälter.
   6. Invertieren Sie das 20 m Zellsieb von Schritt 2.1.5 auf ein neues 50 ml konisches Rohr und waschen Sie die Epithelzellen vom Sieb mit 20 ml organoiden Medien (Materialtabelle) ergänzt mit 1% Stift/Strep.
   7. Zentrifugieren Sie die konischen Rohre aus den Schritten 2.1.5 und 2.1.6 bei 500 x g für 5 min.
   8. Mit den gesammelten Stromalzellen den Überstand entfernen und das Pellet mit 10 ml roter Blutzelllysepuffer wieder aufhängen.  Bei 37 °C für 10 bis 15 min inkubieren. Zentrifugieren Sie das konische Rohr bei 500 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit 200 bis 300 l Organoidmedien wieder auf (weitere Anweisungen siehe Schritt 2.2.2).
   9. Entfernen Sie mit den gesammelten Epithelzellen den Überstand und setzen Sie ihn mit 100 l Organoidmedien erneut aus (weitere Anweisungen finden Sie unter Schritt 2.2.2).
2. Säzellen
   1. Nach dem Ausgleich der 1,5% Agarose-Formen in Brunnen (1 Form pro Brunnen) einer 24-Well-Platte, entfernen Sie organoide Medien an der Außenseite der Agarose-Formen und kippen Sie die Gewebekulturplatte, so dass das Medium aus der Zellsäkammer der Agarose-Gerichte auch sorgfältig entfernt werden.
   2. Sehen Sie epitheliale (ab Schritt 2.1.9) und stromale (ab Schritt 2.1.8) Zellsuspensionen unter dem Mikroskop.  Fügen Sie entweder den epithelialen oder stromalen Zellsuspensionen jeweils mehr organoide Medien hinzu, so dass die Suspensionen in etwa gleich dicht sind.
      HINWEIS: Epithelzellen verklumpen zusammen, und es ist nicht ratsam, Epithelzellen in einzelzellige Suspensionen zu verdauen/trypsinisieren.
   3. Kombinieren Sie 1 Teil der Stromalzellen mit 3 Teilen der Epithelzellen nach Volumen.
   4. Pipette 50 l (60.000 Zellen) der kombinierten Zellsuspension in die Zellsaatkammer der Agaroseform.
   5. Sobald die Agarose-Formen mit Zellen gefüllt sind, fügen Sie vorsichtig 400 l frische organoide Medien in den Brunnen der 24-Well-Platte.
      HINWEIS: Das Medium reicht knapp unter der Oberfläche der Agarose-Gerichte und lässt die Zellen nicht aus den Formen schweben. Nach 2 bis 3 Tagen setzen sich die Zellen ab und beginnen, Organoide zu bilden.
   6. Wechseln Medium jeden zweiten Tag mit 500 L Organoid-Medien.
   7. Nach 2-3 Tagen, ändern Medium zu einem, das mit 0,1 nM Estradiol (E) und 0,8 nM Testosteron (T) ergänzt wird, um die Organisation von Epithel- und Stromalzellen zu fördern.
      HINWEIS: Obwohl die Organisation von Epithel- und Stromalzellen mit oder ohne Hormone auftreten kann, organisieren sich mehr Organoide in Gegenwart von Hormonen.

3. Ernte von Endometrium-Organoiden für Experimente

HINWEIS: Nach Abschluss des Experiments können Endometrium-Organoide für die Histologie oder RNA-Analyse verarbeitet werden. Die folgenden Schritte beschreiben, wie die Organoide verarbeitet werden.

1. Histologie
   1. 1,5% Agarose in phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) durch Kochen auflösen. Lassen Sie die flüssige Agarose auf ca. 50 °C abkühlen.
   2. Kippen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die 24-Well-Platte und pipetten Sie das Medium vorsichtig von der Außenseite der Agaroseform heraus. Das Medium vorsichtig aus dem Inneren der Agaroseform herauszupfeifen, um eine Störung der Organoide zu vermeiden.
   3. Unter einem Sezieren mikroskop, sorgfältig Pipette 70-75 l warm (50 °C) 1,5% Agarose in die Kammer der Agaroseschale. Achten Sie darauf, die Organoide nicht zu stören.
   4. Bei 4 °C 5 min abkühlen lassen.
   5. 4% Paraformaldehyd (PFA) in jeden Brunnen der 24 Brunnenplatte geben und die gesamte versiegelte Agaroseform mit Organoiden über Nacht bei 4 °C fixieren. Dann in 70% Ethanol bei 4 °C lagern, bis sie für die Paraffineinbettung bereit sind.
2. RNA-Isolierung
   1. Kippen Sie unter einem Sezierendes Mikroskop die 24-Well-Platte und pipetten Sie vorsichtig das Medium aus der Kammer der Agaroseform heraus.
   2. Kraftvoll Pipette 1 ml frisches organoides Medium direkt in die Agaroseform, so dass die Organoide aus den Mikrobrunnen gespült werden. Achten Sie darauf, nicht zu viele Blasen zu erstellen.
   3. Wiederholen Sie die Pipettenz erneut mit dem gleichen Medium aus Schritt 3.2.2.
   4. Sammeln Sie alle Mediums, das die Organoide enthält. Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit, um die Organoide zu sammeln und zur RNA-Extraktion überzugehen.

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Ergebnisse

Ein Schaltplan des Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt. Uterusgewebe wurde aus der Operation gewonnen, nachdem es von Pathologen untersucht wurde. Die Endometriumschleimhaut wurde durch Abkratzen vom Myometrium getrennt und das Endometriumgewebe enzymatisch zu den Zellen verdaut, wie im Protokoll beschrieben. Epithel- und Stromalzellen wurden in den Agaroseformen in Mikrobrunnen zugegeben. Nach 7 Tagen in der Kultur wurden Organoide mit E und T für weitere 7 bis 14 Tage behandelt.

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Diskussion

Wir haben menschliche Endometrium-Organoide erzeugt, die aus epitheliaalen und stromalen Zellen des Endometriums bestehen, ohne die Verwendung von exogenen Gerüstmaterialien. Während bereits gezeigt wurde, dass primäre endometriale Epithelzellen Organoide bilden können^6,7, wurden diese Zellen in eine gelatineartige Matrix von Proteinen eingebettet, die von Maussarkomzellen abgesondert wurden (siehe Tabelle der Materialien), um sphäroidartige...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose HS, molecular biology grade	Denville Scientific	CA3510-6
Agarose molds	Sigma-Aldrich	Z764043	(https://www.microtissues.com/)
Ammonium chloride (NH4Cl)	Amresco	0621
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2257
Collagenase, Type II, powder	Thermo Fisher Scientific	17101015
Dispase	Corning	354235
DNase I	Sigma-Aldrich	D4513
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Eosin Stain	VWR	95057-848
Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody	Thermo Fisher Scientific	RM-9101-S
Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium	Sigma-Aldrich	F6057
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV	1x without calcium, magnesium, and phenol red
Hematoxylin Stain Solution	Thermo Fisher Scientific	3530-32	Modified Harris formulation, mercury free
Heparin solution	STEMCELL Technologies	07980	added to MammoCult media
Hydrocortisone stock solution	STEMCELL Technologies	07925	added to MammoCult media
Organoid media - Mammocult	STEMCELL Technologies	05620	supplemented with 2 µL/mL heparin and 5 µL/mL hydrocortisone
Paraformaldehyde, 16% solution	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate buffered saline, pH 7.4	Sigma-Aldrich	P3813
Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant	Agilent Technologies	M356801-2
protein matrix - Matrigel	BD Biosciences	356231
Purified mouse anti-E-cadherin antibody	BD Biociences	610181	Clone 36
Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]	Abcam	ab92547
RNA lysis and isolation kit	Zymo Research	R2060
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Testosterone	Sigma-Aldrich	86500
Trichrome Stain	Abcam	ab150686
Wax film - Parafilm	VWR	52858-000