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Resumen

Describimos un sistema de cultivo in vitro de matriz-adipocitos extracelulares humanos 3D que permite la disección de las funciones de la matriz y los adipocitos en contribuir al fenotipo metabólico del tejido adiposo.

Resumen

La matriz extracelular (ECM) desempeña un papel central en la regulación de la homeostasis tisular, participando en la conversación cruzada con las células y regulando múltiples aspectos de la función celular. El ECM desempeña un papel particularmente importante en la función del tejido adiposo en la obesidad, y las alteraciones en la deposición y composición del ECM del tejido adiposo se asocian con enfermedades metabólicas en ratones y humanos. Los modelos in vitro tractables que permiten la disección de las funciones del ECM y las células para contribuir al fenotipo tisular global son escasos. Describimos un novedoso modelo 3D in vitro del cultivo humano ECM-adipocyte que permite estudiar las funciones específicas del ECM y los adipocitos en la regulación del fenotipo metabólico del tejido adiposo. El tejido adiposo humano se descelulariza para aislar la ECM, que posteriormente se repobla con preadipocitos que luego se diferencian dentro del ECM en adipocitos maduros. Este método crea construcciones ECM-adipocitos que son metabólicamente activas y retienen características de los tejidos y pacientes de los que se derivan. Hemos utilizado este sistema para demostrar la conversación cruzada ECM-adipocyte específica de la enfermedad en el tejido adiposo humano. Este modelo de cultivo proporciona una herramienta para disección de las funciones de la ECM y los adipocitos en la contribución al fenotipo metabólico del tejido adiposo global y permite el estudio del papel del ECM en la regulación de la homeostasis del tejido adiposo.

Introducción

La matriz extracelular (ECM) no sólo proporciona un andamio mecánico para los tejidos, sino que también se involucra en una compleja conversación cruzada con las células que residen dentro de ella, regulando diversos procesos necesarios para la homeostasis tisular, incluida la proliferación celular, diferenciación, señalización y metabolismo1. Mientras que el ECM sano desempeña un papel esencial el mantenimiento de la función normal del tejido, ECM disfuncional se ha implicado en múltiples enfermedades2.

El tejido adiposo desempeña un papel importante en la patogénesis de la enfermedad metabólica. La obesidad se asocia con hipertrofia excesiva de adipocitos e hipoxia celular, defectos en el metabolismo celular de los adipocitos, y el retículo endoplasmático del tejido adiposo y el estrés oxidativo y la inflamación. Si bien no se entienden bien, estos procesos complejos conspiran para afectar la capacidad de amortiguación de nutrientes del tejido adiposo, lo que conduce al desbordamiento de nutrientes del tejido adiposo, toxicidad en múltiples tejidos y enfermedad metabólica sistémica3,4 ,5. La secuencia de eventos y mecanismos específicos que subyacen a la insuficiencia del tejido adiposo se entienden mal, pero se han implicado alteraciones en el tejido adiposo ECM. La composición de ECM se altera dentro del tejido adiposo en la obesidad humana y murina, con una mayor deposición de la proteína ECM junto con diferencias bioquímicas y estructurales cualitativas en el tejido adiposo ECM asociado con la enfermedad metabólica humana, incluyendo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia6,7,8,9,10,11.

A pesar de estas observaciones, el papel del ECM del tejido adiposo en la mediación de la disfunción del tejido adiposo no está bien definido. Esto se debe en parte a la falta de modelos experimentales tractables que permiten la disección de las funciones específicas de ECM y adipocitos en la regulación de la función final del tejido adiposo. El cultivo de ECM-adipocyte simula mejor el entorno in vivo del tejido adiposo nativo en al menos dos aspectos. En primer lugar, el cultivo ECM proporciona un entorno molecular similar al tejido adiposo nativo, incluyendo colágenos nativos, elastinas y otras proteínas de matriz ausentes en el cultivo 2D estándar. En segundo lugar, se ha demostrado que el cultivo en plástico 2D altera el metabolismo de los adipocitos a través de efectos mecánicos debido a la disminución de la elasticidad del sustrato plástico12,que elimina el cultivo ECM.

Se han estudiado métodos para diseñar andamios biológicos mediante el aislamiento de ECM de la adiposa descelularizada y otros tejidos en el contexto de la medicina regenerativa y reconstructiva y la ingeniería de tejidos13,14, 15,16,17,18. Hemos publicado previamente una metodología en la que adaptamos estos métodos para desarrollar un modelo 3D in vitro del cultivo humano de ECM-adipocitos, utilizando ECM y células madre de adipocitos (preadipocitos) derivadas de tejidos adiposos viscerales humanos11. En el presente artículo, describimos estos métodos en detalle. El procedimiento de descelularización para el tejido adiposo humano es un proceso de cuatro días que implica tratamientos mecánicos y enzimáticos para eliminar células y lípidos, dejando un andamio biológico que mantiene las características del tejido del que se deriva. El ECM descelularizado apoya la diferenciación adipogénica de los preadipocitos humanos, y cuando se reconstituye con adipocitos, mantiene la microarquitectura y las características bioquímicas y específicas de la enfermedad del tejido adiposo intacto y participa en características del tejido adiposo nativo. Esta matriz se puede estudiar sola o resembrada con células, permitiendo el estudio de interacciones y interrelación entre los componentes celulares y extracelulares del tejido adiposo.

Protocolo

Los tejidos adiposos se obtienen de sujetos humanos sometidos a cirugía bariátrica electiva bajo la aprobación de la junta de revisión institucional.

1. Aislamiento de preadipocitos y preparación de reactivos de cultivo

  1. Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en 1 solución salina tamponada de fosfato (PBS). Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.
  2. Preparar la colagenasa tipo II: 2 mg/ml en 2% de BSA en 1x PBS. Prepárese inmediatamente antes de usar.
  3. Preparar red blood cell (RBC) Lysing Solution: 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodium EDTA in deionized EDTA (DI/H2O). Conservar a 4oC. Preparar 1 solución de lising RBC a partir de una solución de stock 10x en DI/H2O inmediatamente antes de su uso.
  4. Preparar medios de crecimiento: 15% suero bovino fetal (FBS), 1% solución antibiótica-antimicótica (ABAM) en el medio de águila modificado de Dulbecco:Mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.
  5. Preparar la solución de congelación de preadipocitos: 10% Sulfóxido de dimetil, 15% FBS en medios DMEM/F12. Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.
  6. Preparar medios de diferenciación: 10 mg/L de transferrina, biotina de 33 m, solución de insulina humana de 0,5 m, sal hemicáltica de ácido D-pantoténico de 17 m, 100 nM de xametasona, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironina sal sódica (T3), 1 m de ciglitizona, 540M 3- 3- Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX),1% ABAM en DMEM/F12. Filtrar esterilizar y almacenar a 4oC.

2. Preparación de reactivos ECM

  1. Preparar la solución tampón de congelación: 10 mM Tris base, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% flúor fenilmetilsulfonil (PMSF) en DI / H2O. Agitar la solución para disolver EDTA. Ajuste el pH a 8,0 con HCl o NaOH.Store a 4 oC durante un máximo de 3 meses.
  2. Preparar la solución enzimática #1: 1% ABAM en 0.25% trypsin-EDTA. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.
  3. Preparar solución tampón de entrada: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4,1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. esterilizado O. Revuelva para disolver sales. Ajuste el pH a 8.0 con HCl o NaOH. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.
  4. Preparar la solución enzimática #2: 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO4x 7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. Almacenar 4 oC durante un máximo de 3 meses. Revuelve para disolver las sales. Inmediatamente antes de su uso, añadir 80 U/ml de lipasa de páncreas porcino, tipo VI-S; 160 U/ml desoxirribonucleasa I de páncreas bovino, tipo II-S; y 100 g/ml ribonucleasa A del páncreas bovino, tipo III-A.
  5. Preparar solución de extracción de disolvente polar: 1% ABAM, 1% PMSF en isopropanol.
    ADVERTENCIA: El isopropanol es inflamable; almacenar en un armario inflamable a 25 oC y desechar en residuos inflamables.
  6. Preparar 70% etanol, 1% ABAM, 1% PMSF en DI/H2O. Añadir ABAM y PMSF justo antes de su uso.
    ADVERTENCIA: El etanol es inflamable; almacenar en un armario inflamable a 25 oC y desechar en residuos inflamables.
  7. Preparar la solución de almacenamiento: 1% ABAM, 1% PMSF en 1x PBS. Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses.

3. Preparación de reactivos de fenotipado metabólico

  1. Toma de glucosa
    1. Preparar medios de hambre sérica: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtrar esterilizar y almacenar a 4 oC
    2. Preparar 200 nM solución de insulina humana en 1x PBS inmediatamente antes de su uso.
    3. Preparar 200 nM de insulina humana, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glucosa, 1 ci/bien Deoxy-D-glucosa, 2-[1,2-3H(N)]-, en 1x PBS. Prepárese inmediatamente antes de usar.
  2. Lipolisis
    1. Preparar el isoproterenol diluido en PBS: solución de stock de 3 mM. Diluir a una concentración de trabajo de 3 m para el ensayo.
  3. Tinción de petróleo rojo-O
    1. Preparar 4% de formalina en DI/H2O. Almacenar a temperatura ambiente.
    2. Prepare la solución de trabajo de Oil Red-O. Diluir aceite Rojo-O Solución (ORO) con DI/H2O en una relación de 3:2 (ORO:DI/H2O). Prepárese inmediatamente antes de usar. Filtrar por papel de filtro(Tabla de materiales).

4. Adquisición de tejido adiposo

NOTA: El tejido adiposo visceral (IVA) se recoge del mayor omento al comienzo de la operación por el cirujano y se transporta de vuelta al laboratorio sobre hielo para su procesamiento inmediato. Se deben tomar precauciones universales al manipular todos los tejidos humanos y reactivos cáusticos, incluida la realización de todo el trabajo en una campana de flujo laminar, el uso de un desgaste de seguridad de laboratorio completo y la no recapitulación de agujas.

  1. Añadir 5-10 g de IVA intacto a 15-25 mL de solución de tampón de congelación en un tubo cónico de 50 ml para sumergir la muestra de tejido. Almacene las muestras a -80 oC hasta la descelularización, hasta 1 mes.
  2. Utilice una muestra nueva separada del IVA para el aislamiento de los preadipocitos, tal como se describe en la sección 5.

5. Aislamiento de preadipocitos

  1. Colocar 2 g de IVA intacto en 20 ml de la colagenasa, tipo II, solución en un tubo cónico de 50 ml. A continuación, picar a fondo insertando tijeras estériles en el tubo cónico y picando el tejido dentro del tubo. Una vez completamente picado a una lodos finas, incubar el tejido en la solución de colagenasa en un agitador orbital a 130 rpm y 37 oC durante 60 min.
  2. Filtrar el digestato resultante a través de una malla de nylon de 100 m en un tubo cónico fresco de 50 ml vertiendo el digestato desde un tubo cónico a través de un pedazo de malla doblada sobre la parte superior de un tubo cónico fresco. El digestato en este punto debe ser un líquido amarillo-naranja con viscosidad moderada, con pequeñas cantidades de hebras residuales de tejido fibroso no digerido. La malla debe capturar trozos más grandes de tejido no digerido, que se descartan.
  3. Centrifugar la muestra a 270 x g durante 10 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 2 ml de 1 solución de lising RBC con una pipeta.
    1. Incubar durante 1 min a 25oC y añadir 10 mL de 15% FBS-DMEM/F12. Centrífuga a 270 x g durante 10 min.
  4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 10 ml de 15% de FBS-DMEM/F12 con una pipeta. Transfiera la suspensión celular a una placa Petri de 100 mm con una pipeta e incubar a 37 oC y 5% de CO2,hasta que las células alcancen una confluencia del 80-100%, normalmente 2-6 días. Cambie el medio cada 2-3 días.
  5. Separe y lave las células.
    1. Retire los medios con una pipeta y aplique 4 ml de trippsina-EDTA al 0,25% de trippsina-EDTA a las células adherentes. Incubar a 37oC durante 10 min, girando periódicamente la placa suavemente para separar las células.
    2. Agregue 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12 y vuelva a suspender las células separadas en este medio con una pipeta. A continuación, transfiera a un tubo cónico fresco de 50 ml y centrífuga 270 x g durante 10 min.
    3. Retire el sobrenadante y deseche. Lavar el pellet celular una vez en 1x PBS, y luego resuspender el pellet celular en 20 ml de fresco 15% FBS-DMEM/F12 con una pipeta. Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo T-150.
  6. Células de cultivo a 37oC y 5% CO2. Divida y amplíe las células cada 2-3 días a medida que alcanzan una confluencia del 80-100% aplicando 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25%, expandiéndose de un matraz a 8 matraces.
    NOTA: Esto normalmente requiere 3-4 pasajes, lo que permite la expansión adecuada y conserva el potencial adipogénico y fenotipos metabólicos celulares específicos del paciente y del depósito. El paso de preadipocitos por encima de 4-5 pasajes conduce a la pérdida de potencial adipogénico.
  7. Separe las células en 8 matraces con 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25% por matraz como se ha descrito anteriormente, e incubar a 37 oC durante 10 min.
  8. Añadir 8 ml de 15% FBS-DMEM/F12 por matraz y resuspender las células separadas con una pipeta. Transfiera toda la suspensión celular dividida uniformemente en tres tubos cónicos de 50 ml y centrífuga a 270 x g durante 10 min.
  9. Resuspender los gránulos de células resultantes en 5 ml de 15% DE FBS-DMEM/F12 en un tubo cónico de 15 ml y células de recuento utilizando contador de celdas y azul Trypan.
  10. Centrifugar la suspensión celular a 270 x g durante 10 min. A continuación, resuspenda el pellet celular en Preadipocyte Freezing Solution a una concentración celular final de 1 x 106/mL, y alícuota 1 mL de suspensión celular por tubo criovial de 1,5 ml.
  11. Conservar las células en crioviales durante 1 día a -80oC. A continuación, transfiera crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo durante 3-6 meses.
  12. Cuando esté listo para su uso, descongelar un criovial en un baño de agua de 37 oC durante 3-5 min. Resuspender las células en 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12, y centrifugar a 270 x g durante 10 min.
  13. Resuspender el pellet celular en 20 ml de 15% FBS-DMEM/F12, pipeta en un solo matraz T-150, y luego crecer a 80% de confluencia durante 2-3 días a 37 oC y 5% CO2.
  14. Separe las células con 7 ml de trippsina-EDTA al 0,25% por matraz como se describe anteriormente en el paso 5.6. Resuspenda a 3 millones de células por ml (es decir, 6 x 104 células por 20 ?L) en 15% FBS-DMEM/F12, y utilícelo como se describe a continuación (sección 7, paso 7.4).

6. Preparación de ECM de tejido adiposo

  1. Día 1: Congelación-descongelación y digestión enzimática #1
    1. Congelación-descongelación previamente congelada (paso 4.2) Muestras de IVA almacenadas en La solución de tampón de congelación en tubos cónicos de 50 ml de -80 oC a 37 oC en un baño de agua precalentado, incubando 20 min con agitación manual suave. Una vez descongelado, transfiera de nuevo a -80 oC e incubar 20 min. Repita la congelación-descongelación 3x, terminando por descongelar las muestras en un baño de agua de 37 oC.
    2. Con fórceps estériles, transfiera las muestras de IVA a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de Solución Enzimática #1, asegurando que las muestras de IVA estén completamente sumergidas. A continuación, incubar durante la noche en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC).
  2. Día 2: Digestión enzimática #2
    1. Las muestras de lavado 3x con 15-25 ml de Solución tampón de enjuague en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado). Vierta la solución de tampón de enjuague después de cada lavado.
    2. Transfiera las muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de Solución Enzimática #2 e incubar en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, durante la noche).
  3. Día 3: Delipidación
    1. Las muestras de lavado 3x con 15-25 ml de Solución tampón de enjuague en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado). Vierta la solución de tampón de enjuague después de cada lavado.
    2. Transfiera las muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de extracción de disolventepolar e incubar en un agitador orbital (130 rpm, 25 oC, durante la noche). Después de este paso, se debe eliminar la mayoría de los lípidos, y las muestras deben ser de color blanco o translúcido.
      ADVERTENCIA: La solución de extracción de disolvente polar es inflamable y debe almacenarse y utilizarse a 25 oC.
  4. Día 4: Lavado y almacenamiento
    1. Transfiera muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de tampón de entrada. Las muestras de lavado 3 x en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos por lavado).
    2. Enjuague las muestras 3 veces con 15-25 ml de etanol al 70% en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos cada lavado) vertiendo la solución de etanol al 70% después de cada lavado.
    3. Lave las muestras una vez con la solución de almacenamiento en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 minutos por lavado).
    4. Usando fórceps estériles, transfiera muestras a tubos cónicos frescos de 50 ml que contengan 15-25 ml de solución de almacenamiento. Asegúrese de que se utiliza suficiente solución de almacenamiento para sumergir completamente las muestras. Conservar a 4oC durante un máximo de 1 mes.

7. Preparación de ECM-adipocyte

  1. Transfiera fragmentos de ECM almacenados a pozos individuales de placa de 24 pocillos utilizando fórceps estériles. Agregue tantos fragmentos de ECM en tantos pozos como sea necesario para el ensayo descendente planificado (por ejemplo, la acumulación de glucosa o la lipólisis, ver más abajo), incluidos duplicados o triplicados. Lavar con 500 oL de 70% de etanol 3 veces en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado).
  2. Rehidratar el ECM lavando 3 veces en 1x PBS estéril en un agitador orbital (130 rpm, 37 oC, 20 min cada lavado).
  3. Usando tijeras estériles, corte y pese ECM en fragmentos de 100 mg. Usando fórceps estériles, coloque un fragmento de 100 mg en cada pocal de una placa de 24 pocillos. Incubar a 25oC durante 15 min para permitir que el exceso de PBS extruya de fragmentos. Retire con cuidado cualquier exceso de PBS con una pipeta.
  4. Semilla cada fragmento de ECM de 100 mg con 20 ml de suspensión celular de preadipocitos (3 millones de células por ml, 6 x 104 células por 20 l, en 15% FBS-DMEM/F12, del paso 5.10). Pipetear las células directamente en el ECM colocando la punta de la pipeta en el ECM y expulsando suavemente la suspensión celular en el centro de la matriz, teniendo cuidado de que la suspensión celular no se desborde y termine en la parte inferior del pozo.
    1. Si la suspensión celular está desbordada del ECM donde se ha colocado la punta de la pipeta, retire la punta de esa ubicación e insértela en otro lugar del ECM. ECM sembrado por 40 min a 37oC.
      NOTA: Para la extracción de ARN para qrtPCR, semilla cada 500 mg de fragmentos de ECM con 3 x 105 células en 100 l (3 millones de células por ml, es decir, 3 x 105 células por 100 l, en 15% FBS-DMEM/F12).
  5. Llene cada pocal de la placa de 24 pocillos con 500 ml de medios de crecimiento para cubrir los fragmentos de ECM sembrados. Cultivo a 37oC y 5%CO2 durante 72 h.
  6. Después de 72 h, aspirar cuidadosamente 15% FBS-DMEM/F12, inclinando ligeramente la placa para permitir que los medios se agrupen debajo del fragmento, y colocando la punta de la pipeta justo adyacente al fragmento de ECM sin molestarla. Después de aspirar, añadir 500 l de medios de diferenciación, cambiando los medios cada 2-3 días utilizando una técnica similar, durante un período de cultivo total de 14 días.
    1. Compruebe la diferenciación mediante microscopía ligera: las células acumularán lípidos, se volverán de color marrón-amarillo y más esféricas en forma.
      NOTA: Las matrices sembradas se pueden utilizar para pruebas metabólicas (por ejemplo, ensayo de admisión de glucosa, ensayo de lipólisis, ORO), histología o inmunohistoquímica (IHC) o imágenes de tejido estándar. Para la tinción e imágenes de ORO de tejido fijo, congele muestras de ECM-adipocitos en nitrógeno líquido.

8. Fenotipado metabólico

  1. Microscopía electrónica de barrido
    1. Fijar muestras en 2.5% glutaraldehído en tampón de fosfato de Sorensen a 25 oC durante 12 h. Postfijo en 1% tetróxido de osmio en tampón de fosfato de Sorensen a 4 oC durante 1 h.
    2. Deshidratar en serie muestras en etanol. Lavar en hexamethyldisalizane y secar al aire. A continuación, montar en un talón de microscopía electrónica de barrido con grafito coloidal. Seca, y esputo-capa con oro.
    3. Capture imágenes con un microscopio electrónico de barrido.
  2. Tinción de petróleo rojo-O
    1. Tejido vivo: Solución de aceite Rojo-O
      1. Aspirar con cuidado los medios de los pozos con una pipeta. A continuación, lave las muestras una vez con 500 ml de 1 pbS por poca.
      2. Fijar muestras con 200 ml de formalina al 4% en H2O desionizado estéril a 25 oC durante 15 minutos. Aspirar formal con una pipeta, lavar las muestras dos veces con 1 x PBS (500 ol cada lavado).
      3. Añadir 200 s de muestras de isopropanol al 60% a 25 oC durante 5 min. Aspirar 60% isopropanol con una pipeta.
      4. Muestras de manchas con solución de trabajo Oil Red-O a 25oC durante 5 min. Aspirate Oil Red-O con una pipeta y luego lave las muestras 3 veces con 1pbS (500 ml cada lavado). A continuación, la imagen con un microscopio óptico.
    2. Tejido fijo: Kit de manchas de aceite rojo-o
      1. Muestras de ECM-adipocitos de congelación de flash en compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y sección (5 m) en un criostato.
      2. Colocar el portaobjetos en 85% propilenglicol en DI/H2O durante 2 min. Coloque la corredera en la mancha ORO a 60 oC durante 6 min. Coloque el lide dela estega en 85% de propilenglicol en DI/H2O durante 1 min.
      3. Coloque la corredera en Hematoxilina modificada de La hematoxilina de aceite rojo-o kit de tinción durante 1 min. Enjuague la diapositiva dos veces con agua del grifo. Enjuague el portaobjetos dos veces con DI/H2O.
      4. Monte el cubreobjetos con un medio de montaje acuoso y una imagen en un microscopio.
    3. Extracción de ARN de ECM para qrtPCR
      NOTA: Para maximizar el rendimiento del ARN, utilice 500 mg de fragmentos de ECM sembrados con 3 x 105 preadipocitos en 100 l y diferencie como se indica anteriormente en placas de 6 pocillos en medios de diferenciación de 3 ml por poca.
      1. Una vez diferenciada, transfiera cada muestra individual de ECM-adipocyte a un tubo cónico de 50 ml sobre hielo utilizando fórceps estériles.
      2. Lavar bien con 500 l de Tampón RLT. Añadir Tampón RLT a tubo cónico de 50 ml con muestra de ECM-adipocitos coincidentes.
      3. Usando tijeras estériles, picar finamente cada muestra de ECM-adipocyte dentro del tubo cónico de 50 ml, mientras sostiene el tubo en hielo, insertando las tijeras en el tubo cónico para picar el tejido.
      4. Congele y descongele completamente los tubos cónicos de -80 oC a 37 oC 3x.
      5. Centrífuga tubos cónicos a 500 x g y 4oC durante 10 min.
      6. Retire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta y utilícelo para la extracción de ARN con un kit de extracción de ARN de tejido fibroso(Tabla de materiales).
  3. Ensayo de acumulación de glucosa
    1. Diferenciar 6 x 104 preadipocitos en fragmentos de ECM de 100 mg en 0,5 ml de medio de diferenciación en placas de 24 pocillos como se ha descrito anteriormente (sección 5).
    2. Después de 14 días de diferenciación, retire el medio y lave los ECM-adipocitos una vez con 1x PBS. Añadir 0,5 ml/bien Medio de hambre sérica y cultivo a 37oC y 5%CO2 durante 12 h.
    3. Retire las células medianas y lave las células dos veces con 1 pbS. Añadir 0,5 mL/pozo 2% BSA en PBS y cultivo a 37oC y 5%co2 durante 2 h.
    4. Lavar las células una vez con 1x PBS, añadir 0,5 ml/bien 1x PBS con o sin 200 nM de insulina e incubar a 37 oC durante 40 min.
    5. Aspirar 1x PBS, añadir 0,5 mL/bien 1X PBS con 0,1 mM 2-desoxigen-D-glucosa, 2 ci/mL desoxi-D-glucosa, 2- [1,2-3H(N)], con o sin 200 nM de insulina, e incubar a 37 oC y 5% co2 durante 40 min. reactivos y residuos radiactivos, según lo manenten las leyes reguladoras institucionales locales.
    6. Retire el medio con una pipeta y lave las células 3 veces con 1 PBS. Añadir 420 sl de solución SDS al 1% en DI/H2O, y alas con pipeteo vigoroso. Incubar 25oC durante 10 min.
    7. Recoger 5 l de cada pocto para el ensayo de proteína Bradford. Transfiera 400 ml de lisado de célularestante restante a 2 ml de líquido centelleo en un vial de centelleo. Cuente 3actividades H-2DG en el contador de centelleo. Analizar los datos como recuentos por minuto normalizados a proteína, mg/ml.
  4. Ensayo de lipólisis
    1. Diferenciar 6 x 104 preadipocitos en fragmentos de ECM de 100 mg en 0,5 ml de medio de diferenciación humana en placas de 24 pocillos como se ha descrito anteriormente (sección 5).
    2. Después de 14 días de diferenciación, retire las células medianas y lave dos veces con 1 pbS caliente. Añadir 0,5 ml de medio de inanición sérica (sin insulina) con o sin isoproterenol de 3 m, y cultivo de adipocitos a 37 oC y 5% de CO2 durante 72 h.
    3. Recoger los supernatantes de cultivo, que pueden almacenarse a -80 oC hasta que estén listos para el ensayo. Recopile el ECM en tubos de microcentrífuga para la cuantificación del ADN para la normalización de datos.
    4. Pipet2 l de cada sobrenadante en una microplaca de 96 pocillos. Conservar pozos para espacios en blanco (destilados H2O) y solución estándar de glicerol proporcionada en el kit de determinación de triglicéridos.
    5. Añadir 270 ml de reactivo de glicerol libre del kit de determinación de triglicéridos a cada pocto, pipeta para mezclar. Incubar placa a 37oC durante 5 min.
    6. Mida la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro de microplacas.
    7. Calcular la concentración de glicerol y normalizar con el ADN de ECM:

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Resultados

La preparación de ECM de tejido adiposo, la sembración con preadipocitos y la diferenciación in vitro en adipocitos maduros dan lugar a claros cambios morfológicos secuenciales en el tejido que permiten la evaluación visual del progreso a lo largo del protocolo(Figura 1) . Los preadipocitos utilizados para la semilla del ECM se aíslan mediante la digestión de la colagenasa de muestras de IVA separadas(Figura 2). La microsc...

Discusión

El modelo de cultivo de ECM-adipocitos proporciona una herramienta valiosa para disección de las funciones individuales de ECM y células en dictar fenotipo de tejido final. El protocolo de aislamiento ECM es bastante reproducible, pero se puede observar la variabilidad en el proceso de descelularización. El paso de deslipidación del Día 3 es un punto crítico en el protocolo. Al finalizar la extracción durante la noche, la solución de disolvente polar debe evidenciar la deslipidación de la matriz que se vuelve am...

Divulgaciones

Los autores no declaran intereses contradictorios.

Agradecimientos

Agradecemos a Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa y Retha Geiss por su ayuda en la coordinación del estudio. SeM fue realizado por University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Este proyecto fue apoyado por niH grants R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot and Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) Administración de Veteranos VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopía electrónica de escaneo realizada por la Universidad de Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La Figura 4 de este manuscrito fue publicada originalmente en Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, y ha sido reproducido con permiso de Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Para obtener permiso para reutilizar este material, visite http://global.oup.com/academic/rights.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Flammable, caustic
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Caustic
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Flammable, caustic
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Flammable
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Flammable
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube HomogenizerBenchmark ScientificCat#D1030
TransferrinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Triglyceride Determination KitSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Type II collagenaseGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150

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