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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Descriviamo un sistema 3D di coltura extracellulare extracellulare umana-adipocito in vitro che permette la dissezione dei ruoli della matrice e adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo.

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo centrale nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti, impegnandosi in crosstalk con le cellule e regolando molteplici aspetti della funzione cellulare. L'ECM svolge un ruolo particolarmente importante nella funzione adiposa del tessuto nell'obesità e le alterazioni nella deposizione e nella composizione eM del tessuto adiposo sono associate alla malattia metabolica nei topi e negli esseri umani. I modelli in vitro trattabili che consentono la dissezione dei ruoli dell'ECM e delle cellule nel contribuire al fenotipo dei tessuti globali sono scarsi. Descriviamo un nuovo modello 3D in vitro della coltura umana ECM-adipocite che permette di studiare i ruoli specifici dell'ECM e gli adipociti nella regolazione del fenotipo metabolico del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo umano viene decellularizzato per isolare l'ECM, che viene successivamente ripopolato con precari che vengono poi differenziati all'interno dell'ECM in adipociti maturi. Questo metodo crea costrutti ECM-adipocite che sono metabolicamente attivi e mantengono le caratteristiche dei tessuti e dei pazienti da cui derivano. Abbiamo usato questo sistema per dimostrare il crosstalk ECM-adipocite specifico della malattia nel tessuto adiposo umano. Questo modello di coltura fornisce uno strumento per sezionare i ruoli dell'ECM e degli adipociti nel contribuire al fenotipo metabolico del tessuto adiposo globale e permette di studiare il ruolo dell'ECM nella regolazione dell'omeostasi dei tessuti adisposti.

Introduzione

La matrice extracellulare (ECM) non solo fornisce uno scaffold meccanico per i tessuti, ma si impegna anche in complesse interazioni incrociate con cellule che risiedono al suo interno, regolando i diversi processi necessari per l'omeostasi dei tessuti, compresa la proliferazione cellulare, differenziazione, segnalazione e metabolismo1. Mentre l'ECM sano svolge un ruolo essenziale nel mantenimento della normale funzione tissutale, l'ECM disfunzionale è stato implicato in più malattie2.

Il tessuto adiposo svolge un ruolo importante nella patogenesi della malattia metabolica. L'obesità è associata a ipertrofia eccessiva adipocite e ipossidi cellulare, difetti nel metabolismo cellulare adipocitico, e reticolato endoplasmico del tessuto adiposo e stress ossidativo e infiammazione. Anche se poco compresi, questi processi complessi cospirano per compromettere la capacità di tamponamento dei nutrienti del tessuto adiposo, portando a overflow dei nutrienti dal tessuto adiposo, tossicità nei tessuti multipli e malattia metabolica sistemica3,4 ,5. La sequenza di eventi e meccanismi specifici che sono alla base dell'insufficienza del tessuto adiposo sono poco conosciuti, ma sono state implicate alterazioni nel tessuto adiposo ECM. La composizione ECM è alterata all'interno del tessuto adiposo nell'obesità umana e murina, con una maggiore deposizione di proteine ECM insieme a differenze biochimiche e strutturali qualitative nel tessuto adiposo associato alla malattia metabolica umana, tra cui diabete di tipo 2 e iperlipidemia6,7,8,9,10,11.

Nonostante queste osservazioni, il ruolo del tessuto adiposo ECM nella mediazione della disfunzione del tessuto adiposo non è ben definito. Ciò è in parte dovuto alla mancanza di modelli sperimentali trattabili che consentono la dissezione dei ruoli specifici dell'ECM e degli adipociti nella regolazione della funzione adiposa finale dei tessuti. La coltura ECM-adipocite simula meglio l'ambiente in vivo del tessuto nativo adiposo in almeno due aspetti. In primo luogo, la coltura ECM fornisce un ambiente molecolare simile al tessuto adiposo nativo, tra cui collageni nativi, elastine e altre proteine matriciali assenti nella coltura 2D standard. In secondo luogo, la coltura sulla plastica 2D ha dimostrato di alterare il metabolismo degli adipociti attraverso effetti meccanici a causa della diminuzione dell'elasticità del substratoplastico 12, che ECM-cultura elimina.

I metodi per progettare scaffold biologici isolando l'ECM dall'adiposi decellularizzato e da altri tessuti sono stati studiati nel contesto della medicina rigenerativa e ricostruttiva e dell'ingegneria tissutale13,14, 15,16,17,18. Abbiamo precedentemente pubblicato una metodologia in cui abbiamo adattato questi metodi per sviluppare un modello in vitro 3D di coltura umana ECM-adipocyte, utilizzando ECM e cellule staminali adipocite (preadipociti) derivate da tessuti adipose viscerali umani11. Nel presente articolo vengono descritti questi metodi in dettaglio. La procedura di decellularizzazione per il tessuto adiposo umano è un processo di quattro giorni che prevede trattamenti meccanici ed enzimatici per rimuovere cellule e lipidi, lasciando uno scaffold biologico che mantiene le caratteristiche del tessuto da cui è derivato. L'ECM decellularizzato supporta la differenziazione adipogenica dei preadipociti umani e, se ricostituita con adipociti, mantiene la microarchitettura e le caratteristiche biochimiche e specifiche della malattia del tessuto adiposo intatto e si impegna in funzioni caratteristiche del tessuto adiposo nativo. Questa matrice può essere studiata da sola o reseeded con le cellule, permettendo lo studio delle interazioni e crosstalk tra i componenti cellulari ed extracellulari del tessuto adiposo.

Protocollo

Tessuti adiposi sono acquistati da soggetti umani sottoposti a chirurgia bariatrica elettiva sotto l'approvazione del comitato di revisione istituzionale.

1. Isolamento dei preadipociti e preparazione del reagente culturale

  1. Preparare il 2% di albumina di siero bovino (BSA) in 1x soluzione salina tamponata da fosfato (PBS). Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.
  2. Preparare collagenasi di tipo II: 2 mg/mL nel 2% BSA in 1x PBS. Preparare immediatamente prima dell'uso.
  3. Preparare la soluzione di lisiera deionizzata del Red Blood Cell (RBC): 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM disodium EDTA in acqua deionizzata (DI/H2O). Conservare a 4 gradi centigradi. Preparare 1x RBC Lysing Solution da 10x soluzione stock in DI/H2O immediatamente prima dell'uso.
  4. Preparare growth Media: 15% siero bovino fetale (FBS), 1% soluzione antibiotico-antimicotico (ABAM) nell'Aquila media modificata di Dulbecco: miscela nutritiva F-12 (DMEM/F12). Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.
  5. Preparare la soluzione di congelamento preadipocito: 10% di zolfo dimetile, 15% FBS nei media DMEM/F12. Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.
  6. Preparare i supporti di differenziazione: 10 mg/L transferrin, 33 - soluzione di biotina M, 0,5 M soluzione di insulina umana, 17 sale acido acido pantotnico di emicalcio, 100 nM dexamethasone, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tironine sale di sodio (T3), 1M ciglitizone, 540- Isobutyl-1-metilxanthine (IBMX), 1% ABAM in DMEM/F12. Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi.

2. Preparazione del reagente ECM

  1. Preparare la soluzione del buffer di congelamento: 10 mM Tris base, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% fenilmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) in DI/H2O. Stir soluzione per sciogliere EDTA. Regolare il pH a 8,0 con HCl o NaOH.Store a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
  2. Preparare la soluzione ezimatica #1: 1% ABAM in 0.25% trypsin-EDTA. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
  3. Preparare la soluzione del buffer di risciacquo: 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 1% ABAM, 1% PMSF in died/H2O. Stir per sciogliere i sali. Regolare pH a 8.0 con HCl o NaOH. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.
  4. Preparare la soluzione enzymatic#2: 55 mM Na2HPO4, 17 mM KH2PO4, 4,9 mM MgSO4x 7H2O, 1% ABAM, 1% PMSF in DI/H2O. Memorizzare 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi. Mescolare per sciogliere i sali. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere 80 lipasi U/mL dal pancreas di porcina, tipo VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I dal pancreas bovino, tipo II-S; e 100 ribonuclease A g/mL dal pancreas bovino, tipo III-A.
  5. Preparare la soluzione di estrazione del solvente polare: 1% ABAM, 1% PMSF in isopropanolo.
    AVVISO: l'isopropanolo è infiammabile; intratto relerabile in un armadietto a 25 gradi centigradi e smaltire i rifiuti infiammabili.
  6. Preparare 70% etanolo, 1% ABAM, 1% PMSF in DI/H2O. Aggiungere ABAM e PMSF appena prima dell'uso.
    AVVISO: l'etanolo è infiammabile; intratto relerabile in un armadietto a 25 gradi centigradi e smaltire i rifiuti infiammabili.
  7. Preparare la soluzione di storage: 1% ABAM, 1% PMSF in 1x PBS. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi.

3. Preparazione del reagente di fenotipizzazione metabolica

  1. Assorbimento del glucosio
    1. Preparare siero starvation Media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtrare sterilizzare, e conservare a 4 gradi centigradi
    2. Preparare 200 nM soluzione di insulina umana in 1x PBS immediatamente prima dell'uso.
    3. Preparare 200 nM di insulina umana, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glucose, 1 -Ci/well Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3 H(N)]-, in 1x PBS. Preparare immediatamente prima dell'uso.
  2. Lipolisi
    1. Preparare Isoproterenol diluito in PBS: soluzione di 3 mM. Diluire fino a lavorare la concentrazione di 3 M per il saggio.
  3. Colorazione olio rosso-o
    1. Preparare il 4% di formalina in DI/H2O. Conservare a temperatura ambiente.
    2. Preparare la soluzione di lavoro dell'olio Red-O. Diluire Olio Red-O Solution (ORO) con DI/H2O in un rapporto 3:2 (ORO:DI/H2O). Preparare immediatamente prima dell'uso. Filtrare la carta filtro (Tabella dei materiali).

4. Adiposo acquisto di tessuti

NOTA: Il tessuto adiposo viscerale (IVA) viene raccolto dal maggiore omentum all'inizio dell'operazione dal chirurgo e trasportato al laboratorio sul ghiaccio per la lavorazione immediata. Precauzioni universali devono essere utilizzate quando si maneggiano tutti i tessuti umani e reagenti caustici, compresa l'esecuzione di tutto il lavoro in una cappa a flusso laminare, utilizzando l'usura completa di sicurezza di laboratorio e nessuna ricapitolazione degli aghi.

  1. Aggiungere 5-10 g di IVA intatta a 15-25 mL di Soluzione buffer di congelamento in un tubo conico da 50 mL per immergere il campione di tessuto. Conservare i campioni a -80 gradi centigradi fino alla decellularizzazione, fino a 1 mese.
  2. Utilizzare un campione fresco separato di IVA per l'isolamento preadipocito come descritto nella sezione 5.

5. Isolamento dei preadipociti

  1. Mettere 2 g di IVA intatta in 20 mL del collagenasi, tipo II, soluzione in un tubo conico da 50 mL. Quindi macinare accuratamente inserendo forbici sterili nel tubo conico e macinando il tessuto all'interno del tubo. Una volta completamente ammattato a un liquame fine, incubare il tessuto nella soluzione di collagenae su uno shaker orbitale a 130 giri/m e 37 gradi centigradi per 60 min.
  2. Filtrare il digerito risultante attraverso una rete di nylon da 100 m in un nuovo tubo conico da 50 mL versando il digestate da un tubo conico attraverso un pezzo di rete piegato sopra la parte superiore di un tubo conico fresco. Il digeststate a questo punto dovrebbe essere un liquido giallo-arancio con viscosità moderata, con piccole quantità di fili residui di tessuto fibroso non digerito. La mesh dovrebbe catturare pezzi più grandi di tessuto non digerito, che vengono scartati.
  3. Centrifugare il campione a 270 x g per 10 min. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di 1x RBC Lysing Solution con una pipetta.
    1. Incubare per 1 min a 25 gradi centigradi e quindi aggiungere 10 mL del 15% FBS-DMEM/F12. Centrifuga a 270 x g per 10 min.
  4. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL del 15% FBS-DMEM/F12 con una pipetta. Trasferire la sospensione cellulare a 100 mm piatto Petri con una pipetta e incubare a 37 c e 5% CO2, fino a quando le cellule raggiungono 80-100% confluenza, in genere 2-6 giorni. Cambiare i media ogni 2-3 giorni.
  5. Staccare e lavare le cellule.
    1. Rimuovere i supporti con una pipetta e applicare 4 mL di 0,25% trypsin-EDTA alle cellule aderenti. Incubare a 37 gradi centigradi per 10 min, ruotando periodicamente la piastra delicatamente per staccare le cellule.
    2. Aggiungere 20 mL di 15% FBS-DMEM/F12 e risospendere le celle staccate in questo supporto con una pipetta. Quindi trasferire in un tubo conico fresco 50 mL e centrifugare 270 x g per 10 min.
    3. Rimuovere il super-atuante e scartare. Lavare il pellet cellulare una volta in 1x PBS, quindi risospendere il pellet cellulare in 20 mL di fresco 15% FBS-DMEM/F12 con una pipetta. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone di coltura T-150.
  6. Cellule di coltura a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. Suddividere ed espandere le cellule ogni 2-3 giorni mentre raggiungono l'80-100% di confluenza applicando 7 mL di 0,25% trypsin-EDTA, espandendosi da un flacone a 8 fiasche.
    NOTA: Questo richiede in genere 3-4 passaggi, che consente un'espansione appropriata e mantiene il potenziale adipogenico e i fenotipi metabolici cellulari specifici del paziente e del deposito. Il passaggio dei preadipociti superiori a 4-5 passaggi porta alla perdita del potenziale adipogenico.
  7. Staccare le cellule in 8 flaconi con 7 mL di 0,25% trypsin-EDTA per fiaschetta come descritto sopra, e incubare a 37 gradi centigradi per 10 min.
  8. Aggiungere 8 mL di 15% FBS-DMEM/F12 per fiaschetta e rimettere in sospensione le celle staccate con una pipetta. Trasferire l'intera sospensione cellulare divisa uniformemente in tre tubi conici da 50 mL e centrifugare a 270 x g per 10 min.
  9. Risospendere i pellet cellulari risultanti in 5 mL di 15% FBS-DMEM/F12 in un tubo conico da 15 mL e celle di conteggio utilizzando il contatore cellulare e Trypan blu.
  10. Centrifugare la sospensione cellulare a 270 x g per 10 min. Quindi risospendere quindi il pellet cellulare in Preadipocyte Freezing Solution a una concentrazione finale di cellule di 1 x 106/ mL e 1 mL di sospensione cellulare per tubo crioviale da 1,5 mL.
  11. Conservare le cellule in criovial per 1 giorni a -80 gradi centigradi. Quindi trasferire i crioviali in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine per 3-6 mesi.
  12. Quando è pronto per l'uso, scongelare un crioviale in un bagno d'acqua a 37 gradi per 3-5 min. Risospendere le cellule in 20 mL del 15% FBS-DMEM/F12 e centrifugare a 270 x g per 10 min.
  13. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL del 15% FBS-DMEM/F12, pipetta in un singolo flacone T-150, per poi crescere fino all'80% di confluenza in 2-3 giorni a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
  14. Scollegare le cellule con 7 mL di 0,25% trypsin-EDTA per fiaschetta come descritto sopra nel passaggio 5.6. Risospendere a 3 milioni di celle per mL (ad esempio, 6 x 104 celle per 20 - L) nel 15% FBS-DMEM/F12 e utilizzarla come descritto di seguito (sezione 7, passaggio 7.4).

6. Preparazione ECM del tessuto adiposo

  1. Giorno 1: digestione congelata ed ezimatica #1
    1. Congelare i campioni di IVA precedentemente congelati (passaggio 4.2) memorizzati nella Soluzione buffer di congelamento in tubi conici da 50 mL da -80 a 37 gradi in un bagno d'acqua preriscaldato, incubando 20 min con delicata agitazione manuale periodica. Una volta scongelato, ritrasferirsi a -80 gradi centigradi e incubare 20 min. Ripetere il congelo 3x, terminando con lo scongelamento dei campioni in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
    2. Utilizzando pinze sterili, trasferire i campioni di IVA a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di soluzione enzimatica #1, assicurando che i campioni di IVA siano completamente immersi. Poi incubare durante la notte su uno shaker orbitale (130 giri/min, 37 gradi centigradi).
  2. Giorno 2: digestione ezimatica #2
    1. Lavare i campioni 3x con 15-25 mL di Rinsing Buffer Solution su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, 20 min ogni lavaggio). Versare la soluzione Rinsing Buffer dopo ogni lavaggio.
    2. Trasferire campioni a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di soluzione enzimatica #2 e incubare su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, durante la notte).
  3. Giorno 3: Delipidazione
    1. Lavare i campioni 3x con 15-25 mL di Rinsing Buffer Solution su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, 20 min ogni lavaggio). Versare la soluzione Rinsing Buffer dopo ogni lavaggio.
    2. Trasferire campioni a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di Polar Solvent Extraction Solution e incubare su uno shaker orbitale (130 giri/m, 25 gradi centigradi, durante la notte). Dopo questo passaggio, la maggior parte del lipido deve essere rimosso e i campioni devono essere di colore bianco o traslucido.
      AVVISO: La soluzione di estrazione dei solventi polari è infiammabile e deve essere immagazzinata e utilizzata a 25 gradi centigradi.
  4. Giorno 4: Lavaggio e stoccaggio
    1. Trasferire i campioni a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di Rinsing Buffer Solution. Lavare i campioni 3x su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, 20 min ogni lavaggio).
    2. Lavare i campioni 3x con 15-25 mL di 70% di etanolo su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 c, 20 min ogni lavaggio) versando la soluzione di etanolo del 70% dopo ogni lavaggio.
    3. Lavare i campioni una volta con Storage Solution su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 gradi centigradi, 20 min ogni lavaggio).
    4. Utilizzando pinze sterili, trasferire i campioni a tubi conici freschi da 50 mL contenenti 15-25 mL di Storage Solution. Assicurarsi che venga utilizzata una soluzione di archiviazione sufficiente per immergere completamente i campioni. Conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.

7. Preparazione ECM-adipocyit

  1. Trasferire i frammenti ECM immagazzinati su singoli pozzi di piastra di 24 pozzetti utilizzando pinze sterili. Aggiungere tutti i frammenti ECM in altrettanti pozzi necessari per il test a valle pianificato (ad esempio, assorbimento del glucosio o lipolisi, vedi sotto), compresi i duplicati o triplicati. Lavare con 500 luna di 70% di etanolo 3x su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 c, 20 min ogni lavaggio).
  2. Reidratare l'ECM lavando 3x in sterile 1x PBS su uno shaker orbitale (130 giri/m, 37 , 20 min ogni lavaggio).
  3. Utilizzando forbici sterili, tagliare e pesare ECM in 100 frammenti di mg. Utilizzando pinze sterili, posizionare un frammento di 100 mg in ogni pozzo di una piastra di 24 pozzetti. Incubare a 25 gradi centigradi per 15 min per consentire l'estrusione di PBS in eccesso dai frammenti. Rimuovere con cautela l'eventualità in eccesso di PBS con una pipetta.
  4. Seme ogni 100 mg frammento ECM con 20 litri di sospensione cellulare preadipocito (3 milioni di cellule per mL, 6 x 104 celle per 20 l, in 15% FBS-DMEM/F12, dal passo 5.10). Pipette le cellule direttamente nell'ECM posizionando la punta della pipetta nell'ECM ed espellendo delicatamente la sospensione cellulare al centro della matrice, facendo attenzione che la sospensione cellulare non si trasripare e finisca sul fondo del pozzo.
    1. Se la sospensione cellulare sta traboccando dall'ECM in cui è stata posizionata la punta della pipetta, rimuovere la punta da tale posizione e inserirla in un altro punto dell'ECM. Incubare semi ECM per 40 min a 37 .
      NOTA: per l'estrazione dell'RNA per qrtPCR, si estorcere ogni 500 mg di frammenti ECM con 3 x 105 celle in 100 (3 milioni di cellule per mL, vale a dire 3 x 105 cellule per 100L, in 15% FBS-DMEM/F12).
  5. Riempire ogni pozzetto della piastra di 24 pozzetti con 500 gradi di supporti di crescita per coprire i frammenti ECM di semi. Coltura a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 72 h.
  6. Dopo 72 h, aspirare con attenzione 15% FBS-DMEM/F12, inclinando leggermente la piastra per consentire al supporto di poolsotto frammento, e posizionando la punta pipetta appena adiacente al frammento ECM senza disturbarlo. Dopo aver aspirato, aggiungere 500 l of Differentiation Media, cambiando i media ogni 2-3 giorni utilizzando una tecnica simile, per un periodo culturale totale di 14 giorni.
    1. Verificare la differenziazione con microscopia leggera: le cellule accumuleranno lipidi, diventeranno di colore giallo-marrone e di forma più sferica.
      NOTA: Matrici di semi possono essere utilizzate per test metabolici (ad esempio, analisi dell'assorbimento del glucosio, analisi della lipolisi, ORO), istologica o immunohistochimica (IHC) o imaging di tessuto standard. Per la colorazione e l'imaging ORO a tessuto fisso, congelare i campioni ECM-adipocyte in azoto liquido.

8. Fenotipizzazione metabolica

  1. Microscopia elettronica a scansione
    1. Fissare i campioni in glutaraldeide 2,5% nel buffer di fosfato di Sorensen a 25 gradi centigradi per 12 h. Postfix in 1% di tetrossido di osmio nel buffer fosfato di Sorensen a 4 gradi centigradi per 1 h.
    2. Campioni disidratati serialmente in etanolo. Lavare in hexamethyldisalizane e asciugare all'aria. Quindi montare su uno stub di microscopia elettronica a scansione con grafite colloidale. Secco, e sputter-coat con oro.
    3. Acquisire immagini con un microscopio elettronico a scansione.
  2. Colorazione olio rosso-o
    1. Tessuto vivo: soluzione oil Red-O
      1. Aspirare con cura i media dai pozzi con una pipetta. Quindi lavare i campioni una volta con 500 , l.l di 1x PBS per pozzo.
      2. Fissare i campioni con 200 - L del 4% di formalina in sterile deionizzato H2O a 25 gradi centigradi per 15 min.
      3. Aggiungete 200 di 60% di campioni di isopropanolo a 25 gradi centigradi per 5 min. Aspirate 60% isopropanolo con una pipetta.
      4. Campioni di macchia con soluzione di lavoro Olio Red-O a 25 gradi centigradi per 5 min. Aspirate Oolio con una pipetta e quindi lavare i campioni 3x con 1x PBS (500 . Quindi immagine con un microscopio ottico.
    2. Tessuto fisso: Kit macchia oil Red-O
      1. Campioni ECM-adipociti congelano in flash-congelare il composto e la sezione (5 m) su un criostato.
      2. Posizionare il vetrino in glicole propilene dell'85% in DI/H2O per 2 min.
      3. Posizionare la diapositiva nell'Ematossialina di Modified Mayer dal kit di colorazione Oil Red-O per 1 min. Sciacquare due volte con DI/H2O.
      4. Montare la vela utilizzando un supporto di montaggio acquoso e l'immagine su un microscopio.
    3. Estrazione di RNA da ECM per qrtPCR
      NOTA: Per massimizzare la resa dell'RNA, utilizzare 500 mg frammenti ECM seminato con 3 x 105 preadipociti in 100 L e differenziare come sopra in 6-well piastre in 3 mL di supporti di differenziazione per bene.
      1. Una volta differenziato, trasferire ogni singolo campione di ECM-adipocyte in un tubo conico da 50 mL sul ghiaccio utilizzando pinze sterili.
      2. Lavare bene vuoto con 500 l di Buffer RLT. Aggiungere buffer RLT a 50 mL tubo conico con il campione ECM-adipocyte corrispondente.
      3. Utilizzando forbici sterili, tritare finemente ogni campione di ECM-adipocyte all'interno del tubo conico da 50 mL, tenendo il tubo sul ghiaccio, inserendo le forbici nel tubo conico per tritare il tessuto.
      4. Congelare e scongelare completamente i tubi conici da -80 a 37 c 3x.
      5. Centrifuga tubi conici a 500 x g e 4 gradi centigradi per 10 min.
      6. Rimuovere con attenzione il supernatante con una pipetta e utilizzare per l'estrazione dell'RNA con un kit di estrazione RNA del tessuto fibroso (Tabella dei materiali).
  3. Saggio di assorbimento del glucosio
    1. Differenziare 6 x 104 preadipociti in frammenti ECM da 100 mg in 0,5 mL di mezzo di differenziazione in piastre 24-well come descritto sopra (sezione 5).
    2. Dopo 14 giorni di differenziazione, rimuovere il mezzo e lavare ECM-adipociti una volta con 1x PBS. Aggiungere 0,5 mL/pozzo Serum Starvation Medium e cultura a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 12 h.
    3. Rimuovere le cellule medie e di lavaggio due volte con 1x PBS. Aggiungere 0,5 mL/po' 2% BSA in PBS e cultura a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 2 h.
    4. Lavare le cellule una volta con 1x PBS, aggiungere 0,5 mL/po1x PBS con o senza 200 nM di insulina e incubare a 37 gradi centigradi per 40 min.
    5. Aspirati 1x PBS, aggiungere 0,5 mL/po1X PBS con 0,1 mM 2-deossiosa-D-glucosio, 2 s.l.ml deossiosa-D-glucosio, 2- [1,2-3H(N)], con o senza 200 nM di insulina, e incubare a 37 C e 5% CO2 per 40 m. reagenti radioattivi e rifiuti, come richiesto dagli statuti normativi istituzionali locali.
    6. Rimuovere il mezzo con una pipetta e lavare le cellule 3x con 1x PBS. Aggiungere 420 -L di 1% soluzione SDS in DI/H2O, e le cellule di lise con pipettaggio vigoroso. Incubare 25 gradi centigradi per 10 min.
    7. Raccogliere 5 l da ogni pozzo per l'andetto proteico di Bradford. Trasferire 400 luna di lisa cellulare rimanente in 2 mL di liquido scintillante in una fiala scintillante. Contare 3Attività H-2DG sul contatore scintillazione. Analizzare i dati come conteggi al minuto normalizzati alle proteine, mg/mL.
  4. Saggio di Lipolisi
    1. Differenziare 6 x 104 preadipociti in frammenti ECM da 100 mg in 0,5 mL di mezzo di differenziazione umana in piastre 24-well come descritto sopra (sezione 5).
    2. Dopo 14 giorni di differenziazione, rimuovere le cellule medie e di lavaggio due volte con 1x PBS caldo. Aggiungere 0,5 mL di mezzo di fame del siero (senza insulina) con o senza 3 isoproterenolo, e adipociti della coltura a 37 e 5% di CO2 per 72 h.
    3. Raccogliere i supernatanti di coltura, che possono essere conservati a -80 gradi centigradi fino a quando non sono pronti per il saggio. Raccogliere l'ECM in tubi di microcentrismo per la quantificazione del DNA per la normalizzazione dei dati.
    4. Pipet 2 - L di ogni supernatant in una micropiastra da 96 pozzetti. Riserva pozzi per spazi vuoti (distillato H2O) e soluzione standard glicerolo fornita in Trigliceride Determination Kit.
    5. Aggiungere 270 ll di reagente di glicerolo libero dal Kit di determinazione del triglicerido ad ogni pozzo, pipetta da mescolare. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per 5 min.
    6. Misurare l'assorbimento a 540 nm su uno spettrometro a microplacca.
    7. Calcolare la concentrazione di glicerolo e normalizzare con il DNA di ECM:

figure-protocol-22445

Risultati

Preparazione del tessuto adiposo, semina con preadipociti e differenziazione in vitro in adipociti maturi provocano chiari cambiamenti morfologici sequenziali nel tessuto che consente la valutazione visiva del progresso in tutto il protocollo (Figura 1) . I preadipociti utilizzati per il seeding dell'ECM sono isolati utilizzando la digestione del collagene e da campioni separati di IVA (Figura 2). La microscopia elettronica a sca...

Discussione

Il modello di coltura ECM-adipocyte fornisce uno strumento prezioso per sezionare i singoli ruoli dell'ECM e delle cellule nella dettatura del fenotipo tissutale finale. Il protocollo di isolamento ECM è abbastanza riproducibile, ma si può osservare la variabilità nel processo di decellularizzazione. La fase di delipidazione del Giorno 3 è un punto critico del protocollo. Al termine dell'estrazione notturna, la deilpidazione della matrice dovrebbe essere evidenziata dalla Polar Solvent Solution che diventa gialla, me...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi contrastanti.

Riconoscimenti

Ringraziamo Danielle Berger, Marilyn Woodruff, Simone Correa e Retha Geiss per l'assistenza con il coordinamento dello studio. SEM è stata eseguita dalla University of Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. Questo progetto è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), Veterans Affairs Merit Grant I01CX001811 (RWO), Pilot e Feasibility Grant del Michigan Diabetes Research Center (NIH Grant P30-DK020572) (RWO), Amministrazione veterani VISN 10 SPARK Pilot Grant (RWO). Microscopia elettronica a scansione eseguita dall'Università del Michigan Microscopy & Image Analysis Laboratory Biomedical Research Core Facility. La figura 4 di questo manoscritto è stata originariamente pubblicata in Baker et al., J Clin Endo Metab 2017; Mar 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, ed è stato riprodotto su autorizzazione della Oxford University Press [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. Per il permesso di riutilizzare questo materiale, si prega di visitare http://global.oup.com/academic/rights.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Flammable, caustic
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Caustic
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Flammable, caustic
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Flammable
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Flammable
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube HomogenizerBenchmark ScientificCat#D1030
TransferrinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Triglyceride Determination KitSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Type II collagenaseGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150

Riferimenti

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

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