JoVE Logo
저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

우리는 지방 조직 신진 대사 표현형에 기여에 매트릭스 및 지방 세포의 역할의 해부를 허용하는 시험관 내 3D 인간 세포 외 매트릭스 -adipocyte를 설명합니다.

초록

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직 항상성을 조절하고 세포와의 크로스 토크에 참여하고 세포 기능의 여러 측면을 조절하는 데 핵심적인 역할을합니다. ECM은 비만에서 지방 조직 기능에 특히 중요한 역할을 하며, 지방 조직 ECM 증착 및 조성물의 변화는 마우스 및 인간에서 대사 질환과 관련이 있다. 글로벌 조직 표현형에 기여하는 ECM 및 세포의 역할의 해부를 허용하는 견인성 체외 모델은 희소하다. 우리는 지방 조직 신진 대사 표현형을 조절에 ECM 및 지방세포의 특정 역할의 연구를 허용하는 인간 ECM-지방세포 문화의 새로운 3D 체외 모형을 기술합니다. 인간 지방 조직은 ECM을 분리하기 위해 탈세포화되며, 이는 이후에 ECM 내에서 성숙한 지방세포로 분화되는 preadipocytes로 다시 채워집니다. 이 방법은 대사적으로 활성화되어 있는 ECM-adipocyte 구조를 생성하고 조직과 환자가 파생되는 특성을 유지합니다. 우리는 인간 지방 조직에서 질병 특이적 ECM-지방 세포 누토크를 입증하기 위해이 시스템을 사용했습니다. 이러한 배양 모델은 글로벌 지방 조직 대사 표현형에 기여하는 ECM 및 지방세포의 역할을 해부하는 도구를 제공하고 지방 조직 항상성을 조절하는 ECM의 역할에 대한 연구를 허용한다.

서문

세포외 매트릭스 (ECM)는 조직에 대한 기계적 스캐폴드를 제공 할뿐만 아니라 그 안에 있는 세포와 복잡한 크로스 토크에 종사하여 세포 증식을 포함한 조직 항상성에 필요한 다양한 과정을 조절합니다. 차별화, 신호 및 신진 대사1. 건강한 ECM은 정상적인 조직 기능의 유지에 필수적인 역할을하지만, 기능 장애 ECM은 여러 질병에 연루되어있다2.

지방 조직은 신진 대사 질환의 발병기전에 중요한 역할을합니다. 비만은 과도한 지방세포 비대 및 세포 저산소증, 지방세포 세포 대사의 결함, 지방 조직 산후 염기 및 산화 스트레스 및 염증과 관련이 있습니다. 제대로 이해하는 동안, 이러한 복잡한 과정은 지방 조직 영양소 버퍼링 용량을 손상공모, 지방 조직에서 영양 오버플로로 이어지는, 여러 조직의 독성, 및 전신 대사 질환3,4 ,5. 지방 조직 실패의 기초가 되는 사건 그리고 특정 기계장치의 순서는 제대로 이해되지 않습니다, 그러나 지방 조직 ECM에 있는 변경은 연루되었습니다. ECM 조성물은 인간 및 뮤린 비만에서 지방 조직 내에서 변경되며, ECM 단백질의 증착이 증가하고, 인간 대사 질환과 관련된 지방 조직 ECM의 질적 생화학적 및 구조적 차이와 함께 타입-2 당뇨병과 고지혈증6,7,8,9,10,11.

이러한 관찰에도 불구하고, 지방 조직 기능 장애를 중재하는 지방 조직 ECM의 역할은 잘 정의되지 않는다. 이것은 부분적으로 궁극적인 지방 조직 기능을 조절에 ECM및 지방세포의 특정 역할의 해부를 허용하는 견인 가능한 실험 모형의 부족 때문이. ECM-지방세포 배양은 적어도 2개의 측면에서 네이티브 지방 조직의 생체 내 환경을 더 잘 시뮬레이션한다. 첫째, ECM 배양은 표준 2D 배양에 없는 네이티브 콜라겐, 엘라스틴 및 기타 매트릭스 단백질을 포함한 네이티브 지방 조직과 유사한 분자 환경을 제공합니다. 둘째, 2D 플라스틱에 대한 배양은 ECM 배양이 제거되는 플라스틱기판(12)의탄성 감소로 인한 기계적 효과를 통해 지방세포 대사를 변화시키는 것으로 나타났다.

탈세포화된 지방 및 기타 조직에서 ECM을 분리하여 생물학적 스캐폴드를 설계하는 방법은 재생 및 재생 의학 및 조직 공학 13,14, 15,16,17,18. 우리는 이전에 인간 내장 지방 조직으로부터 유래된 ECM 및 지방세포 줄기세포(preadipocytes)를 사용하여 인간 ECM-지방세포 배양의 체외 3D 모델을 개발하기 위해 이러한 방법을 적용한 방법론을 공표했다11. 본 기사에서는 이러한 방법을 자세히 설명합니다. 인간 지방 조직에 대한 탈세포화 절차는 세포와 지질을 제거하기 위한 기계적 및 효소 적 치료를 수반하는 4 일 간의 과정으로, 유래되는 조직의 특성을 유지하는 생물학적 스캐폴드를 남깁니다. 탈세포화된 ECM은 인간 preadipocytes의 지방 분화를 지원하고, 지방세포로 재구성될 때, 그대로 지방 조직의 미세 건축 및 생화학 및 질병 특이적 특성을 유지하고 대사에 관여합니다. 네이티브 지방 조직의 특징. 이 매트릭스는 단독으로 공부하거나 세포로 다시 시드 할 수 있습니다, 지방 조직의 세포와 세포 외 구성 요소 사이의 상호 작용과 누화의 연구를 허용.

프로토콜

지방 조직은 기관 검토 위원회 승인하에 선택적인 bariatric 수술을 받고 인간 과목에서 조달됩니다.

1. Preadipocyte 격리 및 배양 시약 준비

  1. 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 2% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다. 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.
  2. 타입 II 콜라게나아제 준비: 1x PBS에서 2% BSA에서 2 mg/mL. 사용하기 직전에 준비하십시오.
  3. 적혈구 (RBC) 용해 용액을 준비 : 1.5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3,탈이온수에서 10 mM 디 소듐 EDTA (DI / H2O). 4 °C에서 보관하십시오. 사용 직전에 DI/H2O의 10x 스톡 솔루션에서 1x RBC 용해 솔루션을 준비합니다.
  4. 성장 매체 준비: 15% 태아 소 혈 청 (FBS), 1% 항생제 항 균제 용액 (ABAM) 덜베코의 수정 된 독수리 매체에: 영양 혼합물 F-12 (DMEM/F12). 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.
  5. Preadipocyte 동결 솔루션을 준비 : 10 % 디메틸 설폭사이드, DMEM / F12 미디어에서 15 % FBS. 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.
  6. 분화 매체 준비: 10 mg/L 트랜스페린, 33 μM 비오틴, 0.5 μM 인간 인슐린 용액, 17 μM D-판토텐산 헤미칼슘산 염, 100 nM 덱사메타손, 2 nM 3,3,5-트리오도-L-티로닌 나트륨 염(T3), 1 μM 시글리티존 이소부틸-1-메틸산틴(IBMX),DMEM/F12의 1% ABAM. 필터 멸균, 4 °C에서 저장합니다.

2. ECM 시약 제제

  1. 동결 버퍼 용액 준비: 10 mM Tris 염기, 5 mM EDTA, 1% ABAM, 1% 페닐메틸설포닐 불소(PMSF)를 DI/H2O. 증빙 용액에 넣고 EDTA를 용해시다. 최대 3개월 동안 HCl 또는 NaOH.Store를 4°C에서 8.0으로 조절합니다.
  2. 효소 용액 #1 준비 : 0.25 % 트립신 - EDTA에서 1 % ABAM. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.
  3. 헹구는 완충액 준비: 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 7 mM Na2HPO4,1.5 mM KH2PO4,1% ABAM, 1% PMSF를 멸균 된 DI / H2O. 소금을 용해시키기 위해 저어줍니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조정합니다. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.
  4. #2 효소 용액을 준비 : 55 mM Na2HPO4,17 mM KH2PO4,4.9 mM MgSO4∙7H2O, 1 % ABAM, DI / H2O. 스토어에서 1 % PMSF 최대 3 개월 동안. 소금을 녹이도록 저어주세요. 사용하기 직전에, 돼지 췌장에서 80 U /mL 리파아제, 유형 VI-S를 추가하십시오. 160 U/mL 디옥시리보누클리스 I로부터 소 췌장, 타입 II-S; 및 소 췌장에서 100 μg / mL 리보누클아전A, 타입 III-A.
  5. 극성 용매 추출 용액 준비 : 1 % ABAM, 이소 프로판 올에서 1 % PMSF.
    주의: 이소프로판올은 인화성; 인화성 캐비닛을 25°C에 보관하고 인화성 폐기물에 폐기하십시오.
  6. 70% 에탄올, 1% ABAM, DI/H2O에서 1% PMSF를 준비하십시오.
    주의: 에탄올은 인화성; 인화성 캐비닛을 25°C에 보관하고 인화성 폐기물에 폐기하십시오.
  7. 스토리지 솔루션 준비: 1% ABAM, 1x PBS에서 1% PMSF. 4°C에서 최대 3개월간 보관하십시오.

3. 신진 대사 자형질 시약 준비

  1. 포도당 장악
    1. 세럼 기아 미디어 준비: DMEM/F12, 1% ABAM. 필터 멸균 및 4 °C에서 보관
    2. 사용 직전에 1x PBS에 200 nM 인간 인슐린 용액을 준비하십시오.
    3. 200 nM 인간 인슐린, 0.1 mM 2-Deoxy-D-포도당, 1 μCi/well Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3 H(N)]-, 1x PBS에 준비합니다. 사용하기 직전에 준비하십시오.
  2. Lipolysis
    1. PBS에서 희석 된 이소 프로 테레놀을 준비하십시오 : 3 mM 스톡 솔루션. 분석에 대 한 3 μM의 작업 농도 희석.
  3. 오일 레드-O 스테인딩
    1. DI/H2O. 매장에서 4% 포르말린을 실온에서 준비합니다.
    2. 오일 레드-O 작업 솔루션을 준비합니다. 3:2 비율(ORO:DI/H2O)에서 DI/H2O로 오일 적색-O 용액(ORO)을 희석합니다. 사용하기 직전에 준비하십시오. 필터용지(재료 표)를통해 필터링합니다.

4. 지방 조직 조달

참고 : 내장 지방 조직 (VAT)은 외과 의사에 의해 수술 시작 부분에 큰 omentum에서 수집즉시 처리를 위해 얼음에 실험실로 다시 수송된다. 모든 인체 조직 및 부식성 시약을 취급할 때는 완전한 실험실 안전 마모를 사용하고 바늘을 교정하지 않는 등 모든 인체 조직 및 부식성 시약을 취급할 때 보편적인 예방 조치를 사용해야 합니다.

  1. 50 mL 원추형 튜브에 15-25 mL의 동결 버퍼 용액에 5-10 g의 기본 부가가치세를 추가하여 조직 샘플을 담급니다. 세포가 탈셀화될 때까지 샘플을 -80°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
  2. 섹션 5에 설명된 대로 preadipocyte 격리를 위해 별도의 새로운 VAT 샘플을 사용합니다.

5. 프레드포시테 격리

  1. 콜라게나아제, 타입 II, 용액을 50 mL 원점 튜브에 20 mL에 그대로 VAT 2g을 놓습니다. 그런 다음 멸균 가위를 원뿔형 튜브에 삽입하고 튜브 내의 조직을 다듬어 철저히 다듬습니다. 일단 미세 슬러리에 완전히 다진 후, 60 분 동안 130 rpm 및 37 °C에서 궤도 셰이커에 콜라게나제 용액의 조직을 배양합니다.
  2. 100 μm 나일론 메쉬를 통해 결과 굴착된 디지를 신선한 원뿔형 튜브 의 상단에 접힌 메쉬 조각을 통해 하나의 원뿔 튜브에서 파기된 굴착체를 부어 신선한 50 mL 원뿔 형 튜브로 필터링합니다. 이 시점에서 발굴은 소화되지 않은 섬유 조직의 잔류 가닥이 적은 적당한 점도를 가진 노란색 - 주황색 액체여야합니다. 메쉬는 폐기되는 소화되지 않은 조직의 더 큰 조각을 캡처해야합니다.
  3. 샘플을 270 x g에서 10 분 동안 원심 분리. 상급체를 제거하고 파이펫으로 1 x RBC 용해액의 2 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오.
    1. 25 °C에서 1 분 동안 배양 한 다음 15 % FBS-DMEM / F12의 10 mL를 추가합니다. 원심분리기는 270 x g에서 10분.
  4. 상판을 제거하고 파이펫으로 15% FBS-DMEM/F12의 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 세포 현탁액을 파이펫으로 100 mm 페트리 접시로 옮기고 세포가 80-100 % 합류에 도달 할 때까지 37 °C 및 5 %CO2에서배양하고 일반적으로 2-6 일. 2-3일마다 미디어를 변경합니다.
  5. 세포를 분리하고 세척하십시오.
    1. 파이펫으로 매체를 제거하고 부착 셀에 0.25% 트립신-EDTA 의 4 mL를 적용합니다. 37°C에서 10분간 배양하고, 주기적으로 플레이트를 부드럽게 소용돌이치며 세포를 분리합니다.
    2. 15% FBS-DMEM/F12의 20mL를 추가하고 파이펫으로 이 매체의 분리된 셀을 다시 일시 중단합니다. 그런 다음 신선한 50 mL 원두 튜브및 원심 분리기 270 x g을 10 분 동안 옮긴다.
    3. 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 1x PBS에 세포 펠릿을 한 번 세척한 다음 파이펫으로 신선한 15% FBS-DMEM/F12의 20 mL에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다. 세포 현탁액을 T-150 배양 플라스크로 옮김을 전달한다.
  6. 37°C 및 5%CO2에서배양 세포. 분할 및 확장 세포 2-3 일 그들은 에 도달 80-100% 합류 7 mL의 적용 하 여 0.25% 트립신-EDTA, 1 플라스크에서 확장 8 플라스크.
    참고 : 이것은 전형적으로 적당한 확장을 허용하고 지방 생성 잠재력 및 환자 및 depot 특정 세포 신진 대사 표현형을 유지하는 3-4 개의 통로를 요구합니다. 4-5 구절을 초과하는 preadipocytes를 통과하는 것은 지중 증식 잠재력의 손실로 이끌어 냅니다.
  7. 상술한 바와 같이 플라스크당 트립신-EDTA 당 7 mL의 7 mL로 8플라스크에서 세포를 분리하고, 10분 동안 37°C에서 배양한다.
  8. 플라스크당 15% FBS-DMEM/F12의 8mL를 추가하고 피펫으로 분리된 셀을 다시 일시 중단합니다. 전체 세포 현탁액을 3개의 50 mL 원점 튜브및 원심분리기를 270 x g에서 10분 동안 고르게 옮긴다.
  9. 15 mL 원뿔형 튜브에서 15% FBS-DMEM/F12의 5 mL에서 결과 세포 펠릿을 다시 중단하고 셀 카운터와 트라이판 블루를 사용하여 셀셀을 카운트합니다.
  10. 세포 현탁액을 270 x g에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 이어서 Preadipocyte 동결 용액에서 세포 펠릿을 1 x 10 6/mL의 최종 세포 농도로 재중단하고, 1.5 mL 극저온 튜브 당 세포 현탁액의 1 mL을 aliquot.
  11. 세포를 -80°C에서 1일 동안 극저온에 보관합니다. 그런 다음 3-6 개월 동안 장기 보관을 위해 액체 질소로 극저온을 옮깁니다.
  12. 사용 준비가 되면 3-5분 동안 37°C 수조에서 1개의 저온 제거물을 해동합니다. 15% FBS-DMEM/F12의 20 mL에서 세포를 다시 중단하고, 원심분리기를 270 x g에서 10분 동안 재혼합니다.
  13. 15% FBS-DMEM/F12의 20 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단하고, 단일 T-150 플라스크에 피펫을 넣고, 37°C 및 5%CO2에서2-3일 동안 80% 합류로 성장한다.
  14. 5.6단계에서 전술한 바와 같이 플라스크당 트립신-EDTA당 0.25% 트립신-EDTA의 7 mL로 세포를 분리한다. 15% FBS-DMEM/F12에서 mL당 3백만 개의 셀(즉, 20 μL당 6 x 104 셀)에서 다시 중단하고 아래에 설명된 대로 사용하십시오(섹션 7, 단계 7.4).

6. 지방 조직 ECM 준비

  1. 1일차: 동결해동 및 효소 소화 #1
    1. 동결 해동 이전에 동결 (단계 4.2) 사전 가열 된 수조에서 -80 ° C ~ 37 °C에서 50 mL 원추형 튜브에 동결 버퍼 솔루션에 저장된 VAT 샘플을, 부드러운 주기적인 수동 교반으로 20 분 배양. 해동되면 다시 -80 °C로 옮기고 20 분 간 인큐베이션합니다. 37 °C 수조에서 샘플을 해동하여 끝나는 3x를 반복하십시오.
    2. 멸균 집게를 사용하여 VAT 샘플을 효소 용액 #1 15-25mL가 들어있는 신선한 50mL 원추형 튜브로 전송하여 VAT 샘플이 완전히 침지되도록 합니다. 그런 다음 궤도 셰이커(130 rpm, 37°C)에서 밤새 배양합니다.
  2. 일 2: 효소 소화 #2
    1. 궤도 셰이커에 헹구는 완충액 15-25 mL로 3x 세척하십시오 (130 rpm, 37 °C, 각 세척 20 분). 세척 후 헹구는 완충액을 붓습니다.
    2. #2 15-25 mL의 효소 용액을 함유한 신선한 50 mL 원엽 튜브로 샘플을 옮기고 궤도 셰이커 (130 rpm, 37 °C, 하룻밤)에 배양하십시오.
  3. 3일: 삭제
    1. 궤도 셰이커에 헹구는 완충액 15-25 mL로 3x 세척하십시오 (130 rpm, 37 °C, 각 세척 20 분). 세척 후 헹구는 완충액을 붓습니다.
    2. 샘플을 15-25 mL의 극성 용매 추출 용액을 포함하는 신선한 50 mL 원엽 튜브로 옮기고 궤도 셰이커 (130 rpm, 25 °C, 하룻밤)에 배양하십시오. 이 단계 후, 지질의 대부분은 제거되어야하며, 샘플은 흰색 또는 반투명 색상이어야합니다.
      주의: 극성 용매 추출 용액은 가연성이며 25 °C에서 보관하고 사용해야 합니다.
  4. 4일: 세척 및 보관
    1. 헹구는 버퍼 용액의 15-25 mL를 포함하는 신선한 50 mL 원엽 튜브로 샘플을 옮김. 궤도 셰이커에 3x 시료를 세척하십시오 (130 rpm, 37 °C, 각 세척 20 분).
    2. 시료를 궤도 셰이커에 70% 에탄올 15-25 mL로 3x 세척(130 rpm, 37°C, 각 세척 20분)하여 세척 후 70% 에탄올 용액을 붓습니다.
    3. 오비탈 셰이커에 보관 용액으로 시료를 한 번 세척하십시오(130rpm, 37°C, 각 세척 시간 당 20분).
    4. 멸균 집게를 사용하여 샘플을 15-25mL의 저장 용액을 포함하는 신선한 50 mL 원추형 튜브로 옮김. 충분한 스토리지 솔루션이 샘플을 완전히 침지하는 데 사용되었는지 확인합니다. 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.

7. ECM-지방 세포 준비

  1. 저장된 ECM 단편을 멸균 집게를 사용하여 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮김을 전달합니다. 계획된 다운스트림 분석(예: 포도당 섭취 또는 lipolysis, 아래 참조)에 필요한 만큼의 우물에 많은 ECM 단편을 추가하여 중복 또는 삼중항을 포함합니다. 궤도 셰이커에 70 % 에탄올 3 배의 500 μL로 씻어 주세요 (130 rpm, 37 ° C, 각 세척 20 분).
  2. 궤도 셰이커에 멸균 1x PBS로 3x세척하여 ECM을 재수화합니다(130 rpm, 37°C, 각 세척 20분).
  3. 멸균 가위를 사용하여 ECM을 100 mg 조각으로 자르고 무게를 측정하십시오. 멸균 집게를 사용하여 24 웰 플레이트의 각 우물에 100 mg 조각을 놓습니다. 25°C에서 15분 동안 배양하여 과도한 PBS가 조각에서 돌출될 수 있도록 합니다. 파이펫으로 여분의 PBS를 조심스럽게 제거하십시오.
  4. 각 100 mg ECM 단편을 20 μL의 preadipocyte 세포 현탁액 (mL 당 3백만 세포, 20 μL 당 6 x 104 세포, 15% FBS-DMEM/F12, 단계 5.10에서). ECM에 파이펫 팁을 배치하고 셀 서스펜션을 매트릭스 의 중심으로 부드럽게 배출하여 셀 서스펜션이 오버플로되지 않고 웰의 바닥에 끝나는 것을 주의하여 ECM에 직접 셀을 피펫.
    1. 피펫 팁이 배치된 ECM에서 셀 서스펜션이 오버플로되는 경우 해당 위치에서 팁을 제거하고 ECM의 다른 곳에 삽입합니다. 37°C에서 40분 동안 ECM을 배양하였다.
      참고: 쿼트PCR용 RNA 추출의 경우, 각 500 mg ECM 단편을 100 μL에 3 x 105 세포(즉, 100 μL당 3x 105세포, 15% FBS-DMEM/F12)에 시드합니다.
  5. 24웰 플레이트의 각 웰을 500 μL의 성장 매체로 채우고 시드된 ECM 단편을 덮습니다. 72시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 배양한다.
  6. 72시간 후, 조심스럽게 15% FBS-DMEM/F12를 흡인하고, 플레이트를 약간 기울여 미디어가 조각 아래로 풀링되도록 하고, 이를 방해하지 않고 ECM 조각에 인접한 파이펫 팁을 배치합니다. 흡입 후, 500 μL의 분화 매체를 추가하고, 유사한 기술을 사용하여 2-3일마다 배지를 14일의 총 배양 기간 동안 변경한다.
    1. 가벼운 현미경 검사를 사용하여 분화를 확인하십시오 : 세포는 지질을 축적하고 갈색 - 노란색으로 변하고 모양이 더 구형입니다.
      참고: 시드 매트릭스는 대사 검사(예를 들어, 포도당 섭취 분석, 탈분해 분석, ORO), 조직학 또는 면역 조직화학(IHC) 또는 표준 조직 이미징에 사용될 수 있다. 고정 조직 ORO 염색 및 이미징을 위해 액체 질소에서 ECM-지방 세포 샘플을 동결하십시오.

8. 신진 대사 자형질

  1. 주사 전자 현미경 검사법
    1. 소렌센의 인산 완충액에서 2.5% 글루타랄데히드에 있는 샘플을 25°C에서 12시간 동안 12시간 동안 소렌슨의 인산 완충액에서 4°C에서 1시간 동안 4°C에서 오스뮴 테트옥사이드에 붙입니다.
    2. 에탄올에서 샘플을 연속적으로 탈수합니다. 헥사메틸리살리잔으로 씻고 공기건조로 씻어내십시오. 그런 다음 콜로이드 흑연으로 주사 전자 현미경 스텁에 장착하십시오. 골드가 있는 스퍼터 코트.
    3. 주사 전자 현미경으로 이미지를 캡처합니다.
  2. 오일 레드-O 스테인딩
    1. 살아있는 조직: 오일 레드-O 솔루션
      1. 조심스럽게 파이펫 우물에서 미디어를 흡인. 그런 다음 잘 당 1 x PBS의 500 μL로 한 번 샘플을 씻어.
      2. 200 μL의 4% 포르말린을 멸균 된D2O에서 15 분 동안 25 °C에서 수정하십시오. 피펫으로 포르말린을 흡기, 1 x PBS (각 세척 500 μL)로 시료를 두 번 세척하십시오.
      3. 25°C에서 60% 이소프로판올 시료 200 μL을 5분 동안 첨가합니다.
      4. 오일 레드-O 작업 용액을 25°C에서 5분 동안 얼룩시고, 파이펫을 사용하여 오일 레드-O를 흡입한 다음 1x PBS(각 세척시 500 μL)로 샘플을 3x 세척합니다. 그런 다음 광학 현미경으로 이미지.
    2. 고정 조직 : 오일 레드 O 얼룩 키트
      1. 최적 절삭 온도 (OCT) 화합물 및 저온 저온 에 섹션 (5 μm)에서 플래시 동결 ECM -adipocyte 샘플.
      2. 슬라이드를 DI/H2O에 85% 프로필렌 글리콜을 2분 동안 2분 동안 놓고 60°C에서 ORO 얼룩에 슬라이드를 놓습니다.
      3. 오일 레드-O 염색 키트에서 수정된 메이어의 헤마톡실린에 슬라이드를 1분 동안 놓고 수돗물로 슬라이드를 두 번 헹굽습니다. DI/H2O로 슬라이드를 두 번 헹구십시오.
      4. 현미경에 수성 장착 매체와 이미지를 사용하여 커버 슬립을 장착합니다.
    3. 쿼트PCR용 ECM에서 RNA 추출
      참고: RNA 수율을 최대화하려면 100 μL에 3 x 105 preadipocytes로 시드된 500 mg ECM 조각을 사용하고 웰당 3 mL의 분화 매체에서 위와 같이 분화하십시오.
      1. 일단 분화되면, 멸균 집게를 사용하여 얼음에 50 mL 원추형 튜브로 각 개별 ECM-adipocyte 샘플을 전송합니다.
      2. 완충RLT 500 μL로 잘 비워주세요. 일치하는 ECM-지방세포 샘플로 버퍼 RLT를 50 mL 원점 튜브에 추가합니다.
      3. 멸균 가위를 사용하여 50 mL 원뿔 튜브 내에서 각 ECM-adipote 샘플을 미세하게 다진 후 튜브를 얼음 위에 유지하면서 가위를 원뿔 튜브에 삽입하여 조직을 다듬습니다.
      4. 원원관을 -80°C에서 37°C로 완전히 동결 및 해동합니다.
      5. 원심분리기 원유관은 500 x g, 4°C에서 10분 동안.
      6. 조심스럽게 피펫으로 상류를 제거하고 섬유 조직 RNA 추출 키트(재료 표)로RNA 추출에 사용하십시오.
  3. 포도당 섭취 분석
    1. 전술한 바와 같이 24-웰 플레이트에서 분화 배지의 0.5 mL에서 100 mg ECM 단편에서 6 x 104 프readipocytes를 분화한다(섹션 5).
    2. 분화 14일 후, 배지를 제거하고 1x PBS로 ECM-지방세포를 1회 세척하였다. 0.5 mL/웰 혈청 기아 배지와 배양액을 37°C에서, 12시간 동안 5%CO2를 첨가합니다.
    3. 중간 크기의 세포를 제거하고 1x PBS로 두 번 씻으소서. PBS 및 배양에 0.5 mL/well 2% BSA를 37°C, 2시간 동안 5%CO2를 추가합니다.
    4. 세포를 1x PBS로 한 번 씻고, 200 nM 인슐린의 유무에 관계없이 0.5 mL/well 1x PBS를 추가하고, 37°C에서 40분 동안 배양합니다.
    5. 흡기 1x PBS, 0.1 mMM/well 1X PBS를 0.1 mMM 2-데옥시-D-포도당, 2 μCi/mL데옥시-D-포도당, 2-[1,2-3 H(N]], 200 nM 인슐린 유무에 관계없이, 37°C 및 5%CO2에서 배양하고 40분 사용 규약에 대해 모든 사용 규격을 위해 40분 사용 규약 방사성 시약 및 폐기물, 지역 기관 규제 법령에 의해 위임.
    6. 파이펫으로 배지를 제거하고 1x PBS로 셀을 3x 세척합니다. DI/H2O에 1% SDS 용액 420 μL을 추가하고 활발한 파이펫팅으로 세포를 용해시합니다. 10 분 동안 25 °C를 배양하십시오.
    7. 브래드포드 단백질 분석에 대해 각 우물에서 5 μL을 수집합니다. 잔여 세포 의 400 μL을 2 mL의 침전 바이알에서 송신 액으로 옮김을 전달합니다. 번광 카운터에서 3H-2DG 활동을 계산합니다. 단백질, mg/mL로 정규화된 분당 카운트로 데이터를 분석합니다.
  4. Lipolysis 분석
    1. 전술한 바와 같이 24-웰 플레이트에서 인간 분화 배지의 0.5 mL에서 100 mg ECM 단편에서 6 x 104 프readipocytes를 분화한다(섹션 5).
    2. 분화 14 일 후, 배지를 제거하고 따뜻한 1x PBS로 세포를 두 번 씻으하십시오. 0.5 mL의 혈청 기아 배지(인슐린 제외)를 3 μM 이소프로테레놀 유무에 추가하고, 배양 지방세포는 37°C에서, 배양 지방세포는 72시간 동안 5%CO2를 첨가한다.
    3. -80°C에서 분석준비가 될 때까지 보관될 수 있는 배양 상피제를 수집한다. 데이터 정상화를 위한 DNA 정립을 위해 미세 원심분리기 튜브에서 ECM을 수집합니다.
    4. 96 웰 마이크로 플레이트에 각 상급의 파이펫 2 μL. 트리글리세라이드 측정 키트에 제공된 블랭크(증류H2O)및 글리세롤 표준 용액을 위한 유정을 예약하십시오.
    5. 트리글리세라이드 결단 키트에서 270 μL의 프리 글리세롤 시약을 각 우물에 넣고 파이펫을 섞어 보세요. 37°C에서 5분 동안 배양플레이트.
    6. 마이크로 플레이트 분광광도계에서 540 nm에서 흡광도를 측정합니다.
    7. 글리세롤의 농도를 계산하고 ECM에서 DNA로 정상화 :

figure-protocol-12402

결과

지방 조직 ECM의 준비, preadipocytes와 파종, 성숙한 지방 세포로 시험관 내 분화는 프로토콜 전반에 걸쳐 진행의 시각적 평가를 허용하는 조직에 명확한 순차적 형태 변화를 초래(그림 1) . ECM을 종하는 데 사용되는 Preadipocytes는 별도의 VAT 샘플로부터 콜라게나아제 소화를 사용하여 분리됩니다(그림2). 처리의 각 단계에서 ECM-adipocyte...

토론

ECM-지방세포 배양 모델은 궁극적인 조직 표현형을 지시하는 ECM 및 세포의 개별적인 역할을 해부하기 위한 귀중한 공구를 제공합니다. ECM 격리 프로토콜은 매우 재현 가능하지만 탈세포화 과정의 가변성이 관찰될 수 있습니다. 3일째 삭제 단계는 프로토콜의 중요한 지점입니다. 하룻밤 추출이 완료되면 매트릭스는 노란색으로 변하는 극성 용매 용액에 의해 입증되어야하며, 매트릭스는 손상되지 ?...

공개

저자는 상충하는 이해관계를 선언하지 않습니다.

감사의 말

다니엘 버거, 마릴린 우드럽, 시몬 코레아, 레타 가이스에게 연구 조정에 도움을 주신 것에 감사드립니다. SEM은 미시간 대학 현미경 검사법 및 이미지 분석 실험실 생물 의학 연구 핵심 시설에 의해 수행되었습니다. 이 프로젝트는 NIH 보조금 R01DK097449 (RWO), R01DK115190 (RWO, CNL), R01DK090262 (CNL), 재향 군인 업무 공로 그랜트 I01CX001811 (RWO), 미시간 당뇨병 연구 센터 (NIH 그랜트 P30-DK020572)에서 파일럿 및 타당성 부여 (RWO), 재향 군인 관리 VISN 10 스파크 파일럿 그랜트 (RWO). 미시간 대학 현미경 검사법 및 이미지 분석 실험실 생물 의학 연구 핵심 시설에 의해 수행 된 주사 전자 현미경 검사법. 이 원고의 그림 4는 원래 베이커 외, J 클린 엔도 Metab 2017에 게시되었습니다; 3월 1;102 (3), 1032-1043. doi: 10.1210/jc.2016-2915, 옥스포드 대학 출판부 [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]의 허가에 의해 복제되었습니다. 이 자료를 재사용할 수 있는 권한을 받으려면 http://global.oup.com/academic/rights 방문하십시오.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTAGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#25200056
1.5 mL cryovial tubeFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#02-682-557
10% Neutral Buffered FormalinVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#89370-094
100 µm nylon mesh filterCorning Inc., Corning, NY, USACat#352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T6397
24-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I5879
96-well tissue culture platesVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#15240062
BiotinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#A8806
Buffer RLTQiagen, Hilden, GermanyCat#79216
CiglitizoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USACat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4513
DexamethasoneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#D4902
Dimethyl SulfoxideFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP231Flammable, caustic
Disodium EDTAFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium saltSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#11320033
EthanolDecon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USACat#DSP-MD.43Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTekVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#G5882Caustic
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#440191Flammable, caustic
Human insulin solutionSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#I9278
IsopropanolFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A415Flammable
IsoproterenolSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#I5627Flammable
KClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S25484
KH2PO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-SSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#L0382
MgSO4*7H2OSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#230391
Na2HPO4Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S5136
NaClSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#S3014
NaHCO3Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#S233
NH4ClFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compoundAgar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UKCat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#O1391
Oil Red-O Stain KitAmerican Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USACat#KTORO-G
Osmium tetroxideSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#201030Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#93482Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-ASigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKitQiagen, Hilden, GermanyCat#74704
Scintillation FluidFisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate bufferThomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJCAS #: 10049-21-5
T-150 culture flaskVWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USACat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube HomogenizerBenchmark ScientificCat#D1030
TransferrinSigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USACat#T3309
Triglyceride Determination KitSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%VWR International LLC., Radnor, PA, USACat#10027-446
Type II collagenaseGibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USACat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mmSigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USACat#WHA5201150

참고문헌

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4 (2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165 (2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유