Um modelo de cultura de matriz-adipócito extracelular humano para estudar crosstalk metabólico de matriz e células

Resumo

Descrevemos um sistema de cultura in vitro de matriz extracelular em 3D que permite a dissecação dos papéis da matriz e dos adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo.

Resumo

A matriz extracelular (ECM) desempenha um papel central na regulação da homeostase dos tecidos, envolvendo-se em crosstalk com as células e regulando múltiplos aspectos da função celular. O ECM desempenha um papel particularmente importante na função do tecido adiposo na obesidade, e alterações na deposição e composição de ECM do tecido adipoto estão associadas à doença metabólica em camundongos e humanos. Modelos in vitro tratáveis que permitem a dissecação dos papéis do ECM e células em contribuir para o fenótipo global de tecidos são escassos. Descrevemos um novo modelo 3D in vitro da cultura humana ECM-adipócito que permite o estudo dos papéis específicos do ECM e adipócitos na regulação do fenótipo metabólico do tecido adiposo. O tecido adiposo humano é decelularizado para isolar o ECM, que é posteriormente repovoado com preadipócitos que são então diferenciados dentro do ECM em adipócitos maduros. Este método cria construções de ECM-adipócitoque são metabolicamente ativas e retêm características dos tecidos e pacientes dos quais são derivados. Usamos este sistema para demonstrar o crosstalk ecm-adipócito específico da doença no tecido adiposo humano. Este modelo de cultura fornece uma ferramenta para dissecar os papéis do ECM e adipócitos em contribuir para o fenótipo metabólico do tecido adiposo global e permite o estudo do papel do ECM na regulação da homeostase do tecido adiposo.

Introdução

A matriz extracelular (ECM) não só fornece um andaime mecânico para os tecidos, mas também se envolve em crosstalk complexo com células que residem dentro dela, regulando diversos processos necessários para a homeostase de tecidos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, sinalização e metabolismo^1. Enquanto ECM saudável desempenha um papel essencial na manutenção da função normal do tecido, ECM disfuncional tem sido implicado em múltiplas doenças².

O tecido adiposo desempenha um papel importante na patogênese da doença metabólica. A obesidade está associada à hipertrofia adipócito excessiva e hipóxia celular, defeitos no metabolismo celular adipócito e reticulum endoplasmico do tecido adiposco e estresse oxidativo e inflamação. Embora mal compreendidos, esses processos complexos conspiram para prejudicar a capacidade de amortecimento de nutrientes do tecido adiposo, levando ao transbordamento de nutrientes do tecido adiposo, toxicidade em vários tecidos e doença metabólica sistêmica^{3,4 5.} A seqüência de eventos e mecanismos específicos subjacentes à falha do tecido adiposo são mal compreendidas, mas alterações no tecido adipolado foram implicadas. A composição de ECM é alterada dentro do tecido adiposo na obesidade humana e murina, com maior deposição de proteína ECM, juntamente com diferenças bioquímicas qualitativas e estruturais no tecido adipoado associado à doença metabólica humana, incluindo diabetes tipo 2 e hiperlipidemia^{6,7,8,9,10,11.}

Apesar dessas observações, o papel do tecido adipoto na mediação da disfunção do tecido adiposo não é bem definido. Isto é em parte devido à falta de modelos experimentais tratáveis que permitem a dissecação dos papéis específicos da ECM e adipócitos na regulação da função final do tecido adiposo. A cultura ECM-adipócito simula melhor o ambiente in vivo do tecido adiposo nativo em pelo menos dois aspectos. Em primeiro lugar, a cultura ECM fornece um ambiente molecular semelhante ao tecido adiposo nativo, incluindo collagens nativas, elastinas e outras proteínas matrias ausentes na cultura 2D padrão. Em segundo lugar, a cultura em plástico 2D tem sido mostrado para alterar o metabolismo adipócito através de efeitos mecânicos devido à diminuição da elasticidade do substrato plástico¹², que ECM-cultura elimina.

Métodos para engendrar andaimes biológicos por isolamento de ECM de adiposo descelularizado e outros tecidos têm sido estudados no contexto da medicina regenerativa e reconstrutiva e engenharia de tecidos^{13,14, 15,16,17,18.} Publicamos anteriormente uma metodologia na qual adaptamos esses métodos para desenvolver um modelo 3D in vitro da cultura humana de ECM-adipócito, usando células-tronco ecm e adipócitos (preadipócitos) derivadas de tecidos adiposos viscerais humanos¹¹. No presente artigo, descrevemos esses métodos em detalhes. O procedimento de descelularização para o tecido adiposo humano é um processo de quatro dias que envolve tratamentos mecânicos e enzimáticos para remover células e lipídios, deixando um andaime biológico que mantém características do tecido a partir do qual é derivado. O ECM descelularizado suporta a diferenciação adipogênica de preadipócitos humanos, e quando reconstituído com adipócitos, mantém microarquitetura e características bioquímicas e específicas da doença do tecido adiposo intacto e se envolve em funções características do tecido adiposo nativo. Esta matriz pode ser estudada isoladamente ou resemada com células, permitindo o estudo das interações e a transação cruzada entre os componentes celulares e extracelulares do tecido adiposo.

Protocolo

Os tecidos adiposos são adquiridos de seres humanos submetidos a cirurgia bariátrica eletiva aprovação do conselho de revisão institucional.

1. Isolamento preadipocito e preparação de reagente cultural

1. Prepare 2% de albumina séxo bovina (BSA) em solução soro sino-amortecida de fosfato 1x (PBS). Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.
2. Prepare a colagem tipo II: 2 mg/mL em 2% BSA em 1x PBS. Prepare-se imediatamente antes de usar.
3. Prepare o Glóbulo Vermelho (RBC) Solução de resquação: 1,5 M NH₄Cl, 100 mM NaHCO_3,10 mM disodium EDTA em água desionizada (DI/H₂O). Guarde a 4°C. Prepare a solução de lysing 1x RBC a partir da solução de ações 10x em DI/H₂O imediatamente antes do uso.
4. Prepare a Growth Media: 15% de soro bovino fetal (FBS), 1% de solução antimicotica antibiótico (ABAM) no Modificado Meio águia de Dulbecco: Mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F12). Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.
5. Prepare a solução de congelamento de preadipocito: 10% de Dimetil Sulfoxide, 15% FBS na mídia DMEM/F12. Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.
6. Prepare a Mídia de Diferenciação: 10 mg/L transferrina, 33 μM biotina, 0,5 μM solução de insulina humana, 17 μM D-pantotênico ácido hemicálcio sal, 100 nM dexametasona, 2 nM 3,3',5-Triiodo-L-tionina sal de sódio (T3), 1 μM ciglitizona, 54μM 3- Isobutyl-1-metilxantina (IBMX), 1% ABAM no DMEM/F12. Filtrar esterilizar, e armazenar a 4 °C.

2. Preparação do reagente de ECM

1. Prepare a solução de tampão de congelamento: base de 10 mM Tris, 5 mM EDTA, 1% Bam, 1% flúor fenilmetilsulfonil (PMSF) na solução DI/H₂O. Stir para dissolver a EDTA. Ajuste o pH para 8,0 com HCl ou NaOH.Store em 4 °C por até 3 meses.
2. Prepare a #1 enzimática da solução: 1% ABAM em 0,25% de tripsina-EDTA. Guarde a 4°C por até 3 meses.
3. Prepare a solução tampão de enxaguamento: 137 mM NaCl, 2.68 mM KCl, 7 mM Na₂HPO_4,1.5 mM KH₂PO_4,1% ABAM, 1% PMSF em DI/H₂O. Esterilizado Mexa para dissolver sais. Ajuste o pH para 8,0 com HCl ou NaOH. Guarde a 4°C por até 3 meses.
4. Prepare #2 enzimática solução: 55 mM Na₂HPO₄, 17 mM KH₂PO₄, 4,9 mM MgSO_4º7H₂O, 1% ABAM, 1% PMSF em DI/H₂O. Store 4 °C por até 3 meses. Mexa para dissolver os sais. Imediatamente antes do uso, adicione 80 u/mL lipase do pâncreas suíno, tipo VI-S; 160 U/mL deoxyribonuclease I do pâncreas bovino, tipo II-S; e 100 μg/mL ribonuclease A do pâncreas bovino, tipo III-A.
5. Prepare a solução de extração de solvente polar: 1% ABAM, 1% PMSF em isopropanol.
   CUIDADO: Isopropanol é inflamável; armazenar em um armário inflamável em 25 °C e dispor em resíduos inflamáveis.
6. Prepare 70% de etanol, 1% ABAM, 1% pmsf em DI/H₂O. Adicionar Bam e PMSF pouco antes do uso.
   CUIDADO: O etanol é inflamável; armazenar em um armário inflamável em 25 °C e dispor em resíduos inflamáveis.
7. Prepare a solução de armazenamento: 1% ABAM, 1% PMSF em 1x PBS. Guarde a 4°C por até 3 meses.

3. Preparação metabólica do reagente da faisão

1. Captação de glicose
   1. Prepare sero Starvation Media: DMEM/F12, 1% ABAM. Filtrar esterilizar e armazenar a 4 °C
   2. Prepare 200 nM solução de insulina humana em 1x PBS imediatamente antes do uso.
   3. Prepare 200 nM insulina humana, 0,1 mM 2-Deoxy-D-glicose, 1 μCi/bem Deoxy-D-glicose, 2-[1,[1,[1,2-³H (N)]-, em 1x PBS. Prepare-se imediatamente antes de usar.
2. Lipólise
   1. Prepare isoproterenol diluído em PBS: 3 mM solução de ações. Diluir a concentração de trabalho de 3 μM para ensaio.
3. Óleo Red-O Mancha
   1. Prepare 4% formalina na loja DI/H₂O. à temperatura ambiente.
   2. Prepare óleo red-o solução de trabalho. Solução óleo diluído red-o (ORO) com DI/H₂O em uma proporção de 3:2 (ORO:DI/H₂O). Prepare-se imediatamente antes de usar. Filtrar através de papel de filtro(Mesa de Materiais).

4. Aquisição de tecidos adiposos

NOTA: O tecido adiposo visceral (IVA) é coletado do maior omento no início da operação pelo cirurgião e transportado de volta para o laboratório no gelo para processamento imediato. As precauções universais devem ser usadas ao segurar todos os tecidos humanos e reagents cáusticos, incluindo executar todo o trabalho em uma capa de fluxo laminar, usando o desgaste completo da segurança do laboratório, e nenhum recapping das agulhas.

1. Adicione 5-10 g de IVA intacto a 15-25 mL de solução de tampão de congelamento em um tubo cônico de 50 mL para mergulhar a amostra de tecido. Armazenar amostras em -80 °C até a descelularização, por até 1 mês.
2. Use uma amostra fresca separada do VAT para a isolação do preadipocyte como descrito na seção 5.

5. Isolamento preadipocito

1. Coloque 2 g de IVA intacto em 20 mL da solução de colagem, tipo II, em um tubo cônico de 50 mL. Em seguida, pique bem, inserindo tesouras estéreis no tubo cônico e picar o tecido dentro do tubo. Uma vez totalmente picada a uma pasta fina, incubar o tecido na solução de colagem em uma coqueteleira orbital em 130 rpm e 37 °C para 60 min.
2. Filtre o digestate resultante através de uma malha de nylon de 100 μm em um tubo cônico fresco de 50 mL derramando o digestate de um tubo cônico através de um pedaço de malha dobrado por cima de um tubo cônico fresco. O digestate neste momento deve ser um líquido amarelo-alaranjado com viscosidade moderada, com pequenas quantidades de costas residuais do tecido fibroso não digerido. A malha deve capturar pedaços maiores de tecido não digerido, que são descartados.
3. Centrífuga a amostra em 270 x g por 10 min. Retire o supernatant e resuspender a pelota de célula em 2 mL de 1x RBC Lysing Solution com uma pipeta.
   1. Incubar por 1 min a 25 °C e, em seguida, adicione 10 mL de 15% FBS-DMEM/F12. Centrífuga a 270 x g por 10 min.
4. Retire o supernatant e resuspender a pelota celular em 10 mL de 15% FBS-DMEM/F12 com uma pipeta. Transfira a suspensão celular para 100 mm de placa de Petri com uma pipeta e incubar a 37 °C e 5% CO₂, até que as células atinjam 80-100% de confluência, normalmente 2-6 dias. Mude a mídia a cada 2 a 3 dias.
5. Separar e lavar as células.
   1. Remover a mídia com uma pipeta e aplicar 4 mL de 0,25% trypsin-EDTA para células aderentes. Incubar a 37 °C por 10 min, periodicamente rodando a placa suavemente para separar as células.
   2. Adicione 20 mL de 15% FBS-DMEM/F12 e resuspenda as células destacadas nesta mídia com uma pipeta. Em seguida, transfira para um tubo cônico fresco de 50 mL e centrífuga 270 x g por 10 min.
   3. Retire o supernatant e descarte. Lave a pelota de célulauma vez em 1x PBS, e depois resuspender a pelota celular em 20 mL de 15% fresco FBS-DMEM/F12 com uma pipeta. Transfira a suspensão celular para um frasco de cultura T-150.
6. Células culturais a 37 °C e 5% DE CO₂. Dividir e expandir as células a cada 2-3 dias como eles atingem 80-100% de confluência, aplicando 7 mL de 0,25% trypsin-EDTA, expandindo-se de um frasco para 8 frascos.
   NOTA: Isso normalmente requer 3-4 passagens, o que permite a expansão adequada e mantém o potencial adipogênico e fenótipos metabólicos celulares específicos do paciente e do depósito. Preadipocitos passantes superiores a 4-5 passagens leva à perda de potencial adipogênico.
7. Desaque as células em 8 frascos com 7 mL de 0,25% de trippsina-EDTA por frasco, conforme descrito acima, e incubam a 37 °C por 10 min.
8. Adicione 8 mL de 15% FBS-DMEM/F12 por frasco e resuspenda as células destacadas com uma pipeta. Transfira toda a suspensão celular dividida uniformemente em três tubos cônicos de 50 mL e centrífuga a 270 x g por 10 minutos.
9. Resuspenda as pelotas de células resultantes em 5 mL de 15% FBS-DMEM/F12 em um tubo cônico de 15 mL e células de contagem usando contador de células e trypan azul.
10. Centrífuga a suspensão celular em 270 x g por 10 min. Em seguida, resuspender a pelota celular em Preadipocito Freezing Solution para uma concentração de células finais de 1 x 10⁶/mL, e alíquota 1 mL de suspensão celular por tubo criovial 1.5 mL.
11. Armazenar células em crioviais por 1 dias a -80 °C. Em seguida, transfira crioviais para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo por 3-6 meses.
12. Quando estiver pronto para uso, descongele um criovial em um banho de água de 37 °C por 3-5 min. Resuspende as células em 20 mL de 15% FBS-DMEM/F12, e centrífuga a 270 x g por 10 min.
13. Resuspender a pelota celular em 20 mL de 15% FBS-DMEM/F12, pipeta em um único frasco T-150, e depois crescer para 80% de confluência ao longo de 2-3 dias em 37 ° C e 5% CO₂.
14. Desaque as células com 7 mL de 0,25% de trippsina-EDTA por frasco, conforme descrito acima na etapa 5.6. Resuspenda em 3 milhões de células por mL (ou seja, 6 x 10⁴ células por 20 μL) em 15% FBS-DMEM/F12, e use conforme descrito abaixo (seção 7, passo 7,4).

6. Preparação do eCM do tecido adipoto

1. Dia 1: Congelamento-degelo e digestão enzimática #1
   1. Amostras de IVA congeladas anteriormente congeladas (passo 4,2) armazenadas na Solução de Tampão de Congelamento em tubos cônicos de 50 mL de -80 °C a 37 °C em um banho de água pré-aquecido, incubando 20 min com agitação manual periódica suave. Uma vez descongelado, transfira de volta para -80 °C e incubar 20 min. Repita o congelamento-descongele 3x, terminando descongelando amostras em um banho de água de 37 °C.
   2. Usando fórceps estéreis, transfira as amostras de IVA para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de #1 enzimáticas da Solução, garantindo que as amostras de IVA estejam totalmente imersas. Em seguida, incubar durante a noite em um shaker orbital (130 rpm, 37 °C).
2. Dia 2: Digestão enzimática #2
   1. Lave amostras 3x com 15-25 mL de enxaguamento buffer solução em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem). Despeje a solução de enxaguamento tampão após cada lavagem.
   2. Transfira amostras para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de solução enzimática #2 e incubar em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, durante a noite).
3. Dia 3: Delipiação
   1. Lave amostras 3x com 15-25 mL de enxaguamento buffer solução em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem). Despeje a solução de enxaguamento tampão após cada lavagem.
   2. Transfira amostras para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de Solução de Extração de Solvente Polar e incubar em uma coqueteleira orbital (130 rpm, 25 °C, durante a noite). Após esta etapa, a maioria do lipídio deve ser removida, e as amostras devem ser brancas ou translúcidas na cor.
      CUIDADO: A solução de extração de solvente polar é inflamável e deve ser armazenada e usada a 25 °C.
4. Dia 4: Lavagem e armazenamento
   1. Transfira amostras para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de Solução tampão de lavagem. Lave amostras 3x em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem).
   2. Lave amostras 3x com 15-25 mL de 70% de etanol em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem) derramando a solução de etanol de 70% após cada lavagem.
   3. Lave amostras uma vez com solução de armazenamento em uma coqueteleira orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem).
   4. Usando fórceps estéreis, transfira amostras para tubos cônicos frescos de 50 mL contendo 15-25 mL de Solução de Armazenamento. Certifique-se de que a solução de armazenamento suficiente é usada para mergulhar totalmente as amostras. Guarde a 4 °C por até 1 mês.

7. Preparação ECM-adipócito

1. Transfira fragmentos armazenados de ECM para poços individuais de placa de 24 poços usando fórceps estéreis. Adicione tantos fragmentos de ECM em tantos poços quanto necessário para o ensaio a jusante planejado (por exemplo, captação de glicose ou lipólise, veja abaixo), incluindo duplicatas ou triplicados. Lave com 500 μL de 70% etanol 3x em um agitador orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem).
2. Reidratar ECM lavando 3x em estéril 1x PBS em um shaker orbital (130 rpm, 37 °C, 20 min cada lavagem).
3. Usando tesoura sérstéril, corte e pese ECM em fragmentos de 100 mg. Usando fórceps estéreis, coloque um fragmento de 100 mg em cada poço de uma placa de 24 poços. Incubar a 25 °C por 15 min para permitir que o excesso de PBS para extrude de fragmentos. Retire cuidadosamente qualquer excesso de PBS com uma pipeta.
4. Semente cada fragmento de ECM de 100 mg com 20 μL de suspensão celular pré-adipócito (3 milhões de células por mL, 6 x 10⁴ células por 20 μL, em 15% FBS-DMEM/F12, a partir do passo 5.10). Pipetas as células diretamente para o ECM, colocando a ponta da pipeta no ECM e gentilmente expelindo a suspensão celular no centro da matriz, tomando cuidado para que a suspensão celular não transborde e acabar na parte inferior do poço.
   1. Se a suspensão celular estiver transbordando do ECM, onde a ponta da pipeta foi colocada, retire a ponta desse local e insira em outro lugar no ECM. Incubate ecm semeado por 40 min a 37 °C.
      NOTA: Para a extração de RNA para qrtPCR, sementes de cada 500 mg fragmentos de ECM com 3 x 10⁵ células em 100 μL (3 milhões de células por mL, ou seja, 3 x 10⁵ células por 100 μL, em 15% FBS-DMEM/F12).
5. Preencha cada poço da placa de 24 poços com 500 μL de mídia de crescimento para cobrir os fragmentos de ECM semeados. Cultura a 37 °C e 5% CO₂ para 72 h.
6. Após 72 h, cuidadosamente aspirar 15% FBS-DMEM/F12, inclinando a placa ligeiramente para permitir que a mídia para piscina abaixo fragmento, e colocando a ponta pipette apenas ao lado do fragmento ECM sem perturbá-lo. Após o aspiramento, adicione 500 μL de Meios de Diferenciação, mudando a mídia a cada 2-3 dias usando uma técnica semelhante, por um período cultural total de 14 dias.
   1. Verifique se há diferenciação usando microscopia de luz: as células acumularão lipídios, ficarão de cor marrom-amarela e mais esféricas em forma.
      NOTA: Matrizes sem eoutras podem ser usadas para testes metabólicos (por exemplo, ensaio de captação de glicose, ensaio de lipólise, ORO), histologia ou imunohistoquímica (IHC) ou imagens de tecido padrão. Para coloração e imagem oro de tecido fixo, congele amostras de ECM-adipócito em nitrogênio líquido.

8. Faisão metabólica

1. Microscopia eletrônica de varredura
   1. Corrigir amostras em 2,5% de glutaraldeído no tampão de fosfato de Sorensen em 25 °C por 12 h. Postfix em 1% de tetróxido de osmium no tampão de fosfato de Sorensen em 4 °C por 1 h.
   2. Amostras de desidratação em série em etanol. Lave em hexatildisalizane, e secar o ar. Em seguida, monte em um coto de microscopia eletrônica de varredura com grafite coloidal. Seco, e sputter-coat com ouro.
   3. Capturar imagens com um microscópio eletrônico de varredura.
2. Óleo Red-O Mancha
   1. Tecido vivo: Solução de óleo vermelho-o
      1. Cuidadosamente aspirar mídia de poços com uma pipeta. Em seguida, lave amostras uma vez com 500 μL de 1x PBS por poço.
      2. Corrigir amostras com 200 μL de 4% formalina em H₂O deionizado estéril a 25 °C por 15 min. Formalin aspirata com uma pipeta, lave amostras duas vezes com 1x PBS (500 μL cada lavagem).
      3. Adicione 200 μL de 60% amostras de isopropanol a 25 °C por 5 min. Aspirate 60% isopropanol com uma pipeta.
      4. Mancha amostras com óleo Red-O solução de trabalho em 25 °C para 5 min. Óleo Aspirate Red-O com uma pipeta e, em seguida, lavar amostras 3x com 1x PBS (500 μL cada lavagem). Em seguida, imagem com um microscópio óptico.
   2. Tecido fixo: Óleo Vermelho-O Kit mancha
      1. Amostras de ECM-adipócito de congelamento flash em um composto e seção de temperatura de corte ideal (OCT) em um criostat.
      2. Coloque o slide em 85% de propilenoglicol em DI/H₂O para 2 min. Coloque o slide na mancha ORO a 60 °C por 6 min. Coloque o lide steh em 85% de propilenoglicol em DI/H₂O por 1 min. Enxaguar o slide duas vezes com DI/H₂O.
      3. Coloque o slide na Hematoxilina de Mayer Modificado do kit de coloração Oil Red-O por 1 min. Enxague o escorregador duas vezes com água da torneira. Enxágue slide duas vezes com DI/H₂O.
      4. Monte o coverslip usando o meio de montagem aquoso e a imagem em um microscópio.
   3. Extração de RNA de ECM para qrtPCR
      NOTA: Para maximizar o rendimento de RNA, use fragmentos de ECM de 500 mg semeados com 3 x 10⁵ preadipócitos em 100 μL e diferencie como acima em placas de 6 poços em 3 mL de mídia de diferenciação por poço.
      1. Uma vez diferenciada, transfira cada amostra individual de ECM-adipócito para um tubo cônico de 50 mL no gelo usando fórceps estéreis.
      2. Lave bem vazio com 500 μL de Buffer RLT. Adicione O Buffer RLT a 50 mL tubo cônico com a amostra de ecm-adipócito correspondente.
      3. Usando tesoura sértica, pique finamente cada amostra de ecm-adipócito dentro do tubo cônico de 50 mL, enquanto segura o tubo no gelo, inserindo a tesoura no tubo cônico para picar o tecido.
      4. Congele e descongele completamente os tubos cônicos de -80 °C a 37 °C 3x.
      5. Tubos cônicos centrífugas a 500 x g e 4 °C por 10 min.
      6. Retire cuidadosamente o supernatant com uma pipeta e uso para extração de RNA com um kit de extração de RNA de Tecido Fibroso(Mesa de Materiais).
3. Ensaio de captação de glicose
   1. Diferencie 6 x 10⁴ preadipócitos em fragmentos de 100 mg de ECM em 0,5 mL de meio de diferenciação em placas de 24 poços, conforme descrito acima (seção 5).
   2. Após 14 dias de diferenciação, retire o meio e lave ECM-adipócitos uma vez com 1x PBS. Adicione 0,5 mL/bem Serum Starvation Médio e cultura em 37 °C e 5% CO₂ para 12 h.
   3. Retire as células médias e lave duas vezes com 1x PBS. Adicione 0,5 mL/bem 2% BSA em PBS e cultura em 37 °C e 5% CO₂ para 2 h.
   4. Lave as células uma vez com 1x PBS, adicione 0,5 mL/bem 1x PBS com ou sem insulina 200 nM, e incubar a 37 °C para 40 min.
   5. Aspirate 1x PBS, adicionar 0,5 mL/bem 1X PBS com 0,1 mM 2-deoxy-D-glicose, 2 μCi/mL deoxy-D-glucose, 2- [1,2-³H (N)], com ou sem 200 nM insulina, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precauções padrão para manipulação e eliminação de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precauções padrão para manuseio e descarte de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precauções padrão para manuseio e descarte de toda a manipulação e eliminação de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precaução padrão para manuseio e descarte de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO 2 para 40 min. Use precaução padrão para manuseio e descarte de toda a insulina nM, e incubar em 37 °C e 5% CO₂ para 40 min. reagentes radioativos e resíduos, como exigido pelos estatutos reguladores institucionais locais.
   6. Retire o meio com uma pipeta e lave as células 3x com 1x PBS. Adicione 420 μL de solução SDS de 1% em DI/H₂O e células de lyse com tubulação vigorosa. Incubar 25 °C por 10 min.
   7. Colete 5 μL de cada poço para o ensaio proteico de Bradford. Transfira 400 μL de lysate celular restante em 2 mL de fluido de cintilação em um frasco de cintilação. Contagem ³H-2DG atividade em contador de cintilação. Analise os dados como contagens por minuto normalizadas em proteínas, mg/mL.
4. Ensaio de lipólise
   1. Diferencie 6 x 10⁴ preadipócitos em fragmentos de 100 mg de ECM em 0,5 mL de meio de diferenciação humana em placas de 24 poços, conforme descrito acima (seção 5).
   2. Após 14 dias de diferenciação, retire as células médias e lave duas vezes com 1x PBS quente. Adicione 0,5 mL de meio de fome séoro (sem insulina) com ou sem 3 μM isoproterenol, e adipócitos culturais em 37 °C e 5% CO₂ para 72 h.
   3. Colete supernatantes culturais, que podem ser armazenados a -80 °C até que estejam prontos para ensaio. Coletar o ECM em tubos de microcentrífuga para a quantidade de DNA para normalização de dados.
   4. Pipet 2 μL de cada supernatant em um microplate de 96 poços. Reserve poços para espaços em branco (H₂O destilados) e solução padrão de glicerol fornecida no Kit de Determinação de Triglicerídeos.
   5. Adicione 270 μL de reagente de glicerol livre do Kit de Determinação de Triglicerídeos a cada poço, pipeta para misturar. Placa incubada em 37 °C para 5 min.
   6. Medir a absorção a 540 nm em um espectrômetro de microplaca.
   7. Calcule a concentração de glicerol e normalize com DNA do ECM:

Resultados

A preparação do tecido adipolado ECM, a semeade com preadipócitos e a diferenciação in vitro em adipócitos maduros resultam em claras mudanças morfológicas sequenciais no tecido que permitem a avaliação visual do progresso em todo o protocolo (Figura 1) . Preadipocitos usados para semeacar o ECM são isolados usando digestão colagem de amostras separadas de IVA (Figura 2). A microscopia eletrônica de varredura de cons...

Discussão

O modelo de cultura ECM-adipócito fornece uma ferramenta valiosa para dissecar os papéis individuais de ECM e células na dictação fenótipo de tecido final. O protocolo de isolamento de ECM é bastante reproduzível, mas a variabilidade no processo de descelularização pode ser observada. A etapa de delipiação do Dia 3 é um ponto crítico no protocolo. Na conclusão da extração durante a noite, a delipiação da matriz deve ser evidenciada pela Solução de Solvente Polar que fica amarela, enquanto a matriz de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#25200056
1.5 mL cryovial tube	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#02-682-557
10% Neutral Buffered Formalin	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#89370-094
100 µm nylon mesh filter	Corning Inc., Corning, NY, USA	Cat#352360
2-Deoxy-D-glucose	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#D8375
2 nM 3,3’,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#T6397
24-well tissue culture plates	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#I5879
96-well tissue culture plates	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10861-666
Antibiotic-Antimycotic Solution (ABAM)	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#15240062
Biotin	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#B4639
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#A8806
Buffer RLT	Qiagen, Hilden, Germany	Cat#79216
Ciglitizone	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#C3974
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]-	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	Cat#NET328A250UC
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type II-S	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#D4513
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#D4902
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#BP231	Flammable, caustic
Disodium EDTA	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#BP118
D-pantothenic acid hemicalcium salt	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#21210
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#11320033
Ethanol	Decon Labs, Inc., King of Prussia, PA, USA	Cat#DSP-MD.43	Flammable
EVE Cell Counting Slides, NanoEnTek	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10027-446
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#10437028
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#G5882	Caustic
Hexamethyldisalizane	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#440191	Flammable, caustic
Human insulin solution	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#I9278
Isopropanol	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#A415	Flammable
Isoproterenol	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#I5627	Flammable
KCl	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S25484
KH2PO4	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#P5655
Lipase from porcine pancreas, type VI-S	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#L0382
MgSO4*7H2O	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#230391
Na2HPO4	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S5136
NaCl	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#S3014
NaHCO3	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#S233
NH4Cl	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#A661
Optimal cutting temperature (OCT) compound	Agar Scientific, Ltd., Stansted, Essex, UK	Cat# AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#O1391
Oil Red-O Stain Kit	American Master Tech Scientific Inc., Lodi, CA, USA	Cat#KTORO-G
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#201030	Caustic
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#93482	Caustic
Phosphate Buffered Saline Solution (PBS)	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#SH3025601
Ribonuclease A from bovine pancreas, type III-A	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#R5125
RNAEasy Fibrous Tissue MiniKit	Qiagen, Hilden, Germany	Cat#74704
Scintillation Fluid	Fisher Scientific, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#SX18
Scintillation Counter
Scissors, forceps, sterile
Sorensen's phosphate buffer	Thomas Scientific, Inc., Swedesboro, NJ	CAS #: 10049-21-5
T-150 culture flask	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10062-864
TaqMan Gene Expression Master Mix	ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA USA	Cat#4369016
Temperature-controlled orbital shaker
Tissue Homogenizer, BeadBug Microtube Homogenizer	Benchmark Scientific	Cat#D1030
Transferrin	Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO, USA	Cat#T3309
Triglyceride Determination Kit	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#TR0100
Trypan blue stain, 0.4%	VWR International LLC., Radnor, PA, USA	Cat#10027-446
Type II collagenase	Gibco, ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Cat#17101015
Whatman Reeve Angel filter paper, Grade 201, 150mm	Sigma-Aldrich, Inc., St Louis, MO, USA	Cat#WHA5201150