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Resumen

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Resumen

La metástasis es la principal causa de muertes relacionadas con el cáncer y hay opciones terapéuticas limitadas para los pacientes con enfermedad metastásica. La identificación y prueba de nuevas dianas terapéuticas que faciliten el desarrollo de mejores tratamientos para la enfermedad metastásica requiere modelos preclínicos in vivo. Aquí se muestra un modelo de ratón singérico para decir la colonización metastásica del cáncer de mama y el crecimiento posterior. Las células cancerosas metastásicas se transduelen de forma estable con vectores virales que codifican la luciferasa de las luciérnagas y las proteínas ZsGreen. Los genes candidatos son manipulados de forma estable en células cancerosas que expresan luciferase/ZsGreen y luego las células se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola para analizar la colonización y el crecimiento metastásicos. A continuación, se utiliza un dispositivo de imágenes in vivo para medir la bioluminiscencia o fluorescencia de las células tumorales en los animales vivos para cuantificar los cambios en la carga metastásica con el tiempo. La expresión de la proteína fluorescente permite cuantificar el número y el tamaño de las metástasis en los pulmones al final del experimento sin necesidad de seccionar o tinción histológica. Este enfoque ofrece una manera relativamente rápida y fácil de probar el papel de los genes candidatos en la colonización y el crecimiento metastásicos, y proporciona mucha más información que los ensayos tradicionales de metástasis venosa de cola. Con este enfoque, mostramos que la reducción de la reducción de la carga metastásica en los pulmones y el desenlace simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y del activador transcripcional con un motivo de unión a la PDZ (TAZ) en las células de cáncer de mama reduce la carga metastásica en los pulmones y que esta carga reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente deteriorada y un crecimiento reducido de metástasis.

Introducción

El cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en todo el mundo1 y la metástasis es responsable de la mayoría de estas muertes2,3. Sin embargo, una comprensión limitada de los mecanismos moleculares que rigen la colonización metastásica y el crecimiento posterior ha obstaculizado el desarrollo de tratamientos eficaces para la enfermedad metastásica. La identificación de nuevas dianas terapéuticas requiere un ensayo para probar cómo la expresión o función perturbada de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. Mientras que los modelos de ratón autóctonos tienen sus ventajas, consumen mucho tiempo y son costosos de generar, lo que los hace más adecuados para la validación de destino en lugar de la detección de objetivos. Los sistemas modelo de trasplante en los que el gen candidato se perturba en las células cancerosas in vitro y luego se evalúan in vivo los efectos sobre el potencial metastásico, son menos costosos y de mayor rendimiento que los modelos autóctonos. Además, los vectores virales para la administración estable de ARNi, CRISPR/CAS9 y transgenes están ampliamente disponibles, por lo que es relativamente fácil perturbar prácticamente cualquier gen o genes de interés en las líneas celulares de una célula cancerosa. Este enfoque también se puede utilizar para analizar el papel de los genes candidatos en la colonización metastásica y el crecimiento en las líneas celulares de cáncer humano trasplantando las células en ratones inmunocomprometidos o humanizados.

Los dos tipos de ensayos utilizados para probar la formación de metástasis por células cancerosas trasplantadas in vivo son ensayos de metástasis espontáneas y ensayos experimentales de metástasis. En los ensayos espontáneos de metástasis4,5, las células cancerosas se inyectan en ratones, se les permite formar un tumor primario, y luego se analiza la formación espontánea de metástasis y el crecimiento posterior. La fuerza de este modelo es que las células deben completar todos los pasos del proceso metastásico para formar tumores metastásicos. Sin embargo, muchas líneas celulares cancerosas no hacen metástasis eficientemente en modelos de metástasis espontánea, y cualquier manipulación de las células que afecta el crecimiento del tumor primario puede confundir los resultados del ensayo de metástasis. Los ensayos experimentales de metástasis, en los que las células cancerosas se inyectan directamente en la circulación, se utilizan para evitar estos escollos. Los ensayos de metástasis experimentales comunes incluyen la inyección de vena de cola6,7,8 (y se demuestra aquí), inyección intracardiaca9,y la inyección de vena porta10.

El propósito del protocolo presentado aquí es proporcionar un ensayo experimental de metástasis in vivo que permita a un investigador monitorear la formación y el crecimiento de metástasis en tiempo real, así como cuantificar el número y el tamaño de la metástasis del punto final en los pulmones del mismo ratón. Para ello, los ensayos tradicionales de metástasis de la cola experimental6,7,8 se combinan con imágenes de animales vivos, utilizando un dispositivo de imagen in vivo9,11,12,13,14. Las células tumorales que expresan establemente tanto la luciferasa como una proteína fluorescente se inyectan en ratones a través de la vena lateral de la cola y luego el dispositivo de imágenes in vivo se utiliza para medir los cambios en la carga metastásica en los pulmones a lo largo del tiempo(Figura 1). Sin embargo, el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo no puede distinguir ni medir el tamaño de las metástasis individuales. Por lo tanto, al final del experimento, se utiliza un estereomicroscopio fluorescente para contar el número y medir el tamaño de las metástasis fluorescentes en los pulmones sin necesidad de seccionamiento e histología o inmunohistoquímica(Figura 1). Este protocolo se puede utilizar para probar cómo la alteración de la expresión o función de un gen candidato influye en la formación y el crecimiento de la metástasis. También se pueden probar posibles compuestos terapéuticos como moléculas pequeñas o anticuerpos de bloqueo de funciones.

Para demostrar este enfoque, primero realizamos un experimento de prueba de concepto en el que el factor de replicación esencial, la proteína de replicación A3 (RPA3) se derriba en las células de cáncer de mama de ratón metastásico. Mostramos que los ratones inyectados con células de derribo de RPA3 tienen una carga metastásica significativamente menor en cada punto de tiempo en comparación con los ratones inyectados con células de control. El análisis de los pulmones que contienen metástasis muestra que esta carga metastásica reducida es el resultado de una colonización metastásica significativamente reducida y un crecimiento deteriorado de las metástasis que se forman. Para demostrar aún más esta técnica, probamos si el derribo simultáneo de proteína asociada al Sí (YAP) y coactivador transcripcional con un motivo de unión a pdZ (TAZ) afecta la colonización metastásica o el crecimiento posterior. YAP y TAZ son dos coactivadores transcripcionales relacionados que son los efectores descendentes críticos de Hippo Pathway. Nosotros15,16 y otros hemos implicado YAP y TAZ en metástasis (revisado en17,18,19), lo que sugiere que estas proteínas son buenas dianas terapéuticas. Consistentemente, encontramos que los ratones inyectados con células de derribo YAP/TAZ habían reducido significativamente la carga metastásica. El análisis de los pulmones mostró que las células de derribo YAP/TAZ formaban muchas menos metástasis y que las metástasis que se formaban eran más pequeñas. Estos experimentos demuestran cómo los ensayos experimentales de metástasis permiten a un investigador probar rápida y económicamente el papel de un gen candidato en la formación y el crecimiento de metástasis. Además, muestran cómo el uso combinado de imágenes de animales vivos y la cuantificación fluorescente de metástasis en pulmones enteros permite al investigador comprender mejor los pasos durante la colonización metastásica.

Protocolo

Este protocolo implica el uso de ratones y materiales biopeligrosos y requiere la aprobación de los comités de seguridad institucionales apropiados. Todo el trabajo in vivo descrito aquí es aprobado por el Comité Institucional de cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) por sus dados).

NOTA: Para obtener información general sobre el protocolo, consulte el esquema en la Figura 1.

1. Empaquetado de todos los retrovirus y lentivirus necesarios

NOTA: El protocolo descrito utiliza vectores lentivirales o retrovirales para expresar establemente una enzima luciferasa y una proteína fluorescente, así como para manipular la expresión de un gen candidato. Estos virus se empaquetan en células HEK-293FT como se describe a continuación.

  1. Día 1: Células de placa HEK-293FT en placas de 6 pocillos en 2 ml de medios de crecimiento completos (10% FBS en DMEM con 1% penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina) para que sean un 40-60% de fluidez en el día 2. Incubar a 37oC, 5%CO2 durante la noche.
  2. Día 2: Para cada vector viral que se va a embalar, transfectar un 40-60% de conservación de células HEK-293FT con el vector retroviral o lentiviral y los vectores apropiados que codifican la capa viral y las proteínas de envasado.
    NOTA: Este protocolo utiliza VSVG como proteína de capa, psPAX2 para envases lentivirales y gag-pol para envases retrovirales (ver Tabla Suplementaria 1 para la lista de vectores).
  3. Haga una mezcla de co-transfección para cada uno de los siguientes productos:
    1. Combinar 4 l de solución lipídica para transfecciones (ver Tabla de Materiales)y 96 l de tampón de transfección e incubar durante 5 minutos.
    2. Añadir 1 g de vector viral, 0,5 g de vector de proteína de capa (VSVG) y 0,5 g de vector de proteína de envasado (psPAX2 o gag-pol) e incubar durante 20 minutos.
    3. Agregue suavemente la mezcla de co-transfección del paso 1.3.2 a las células HEK-293FT chapadas en el paso 1.1 e incuban a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
  4. Día 3: Retire los medios que contienen transfección de cada pocal y agregue suavemente 2 ml de medios de crecimiento completos a cada pocal. Incubar a 37oC, 5%CO2 durante aproximadamente 24 horas.
  5. Día 4: Recoger el sobrenadante viral de cada pocal utilizando una jeringa de 3 ml y filtrar a través de un filtro de 0,45 m en un tubo de microcentrífuga de 2 ml.
  6. Opcional: Si se desea la recolección de un segundo lote de virus, agregue suavemente 2 ml de medios de crecimiento completos a cada poca e incubaa a 37 oC, 5% co2 durante aproximadamente 24 horas.
  7. Día 5 (Opcional): Recoge una segunda ronda de sobrenadante viral como en el paso 1.5.
    NOTA: El protocolo puede estar en pausa congelando el sobrenadante viral.

2. Generación de células cancerosas expresando establemente la luciferasa y una proteína fluorescente

NOTA: El siguiente protocolo describe cómo etiquetar primero las células 4T1 con luciferasa de luciérnaga y una proteína fluorescente (ZsGreen) utilizando dos vectores con genes de selección únicos. A continuación, se utiliza un vectorviral 3 rd para manipular la expresión de un gen candidato. Sin embargo, los vectores virales que simultáneamente entregan una proteína fluorescente y una manipulación genética también se pueden utilizar como alternativa (como en los experimentos representativos a continuación). Se pueden utilizar otras células cancerosas, pero los números celulares deben optimizarse para los pasos 2.1 y 2.7.1.

  1. Células de placa 4T1 a 1,5 x 105 células/bien en una placa de 12 pocillos en medios de crecimiento completos (10% FBS en DMEM con 1% penicilina/estreptomicina y 2 mM de L-glutamina) e incuban a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
  2. Infectar las células 4T1 con el sobrenadante viral generado en el paso 1 de la siguiente manera.
    1. Aspirar los medios de crecimiento de las células y añadir 500 l de sobrenadante viral luciferasa y 500 l de sobrenadante viral de proteína fluorescente para infectar simultáneamente las células con los supernatantes virales de proteína slucifera y fluorescente.
    2. Añadir 1 bromuro de hexadimetrina de 8 mg/ml (ver Tabla de Materiales).
    3. Incubar las células a 37 oC, 5% hasta 75-90% de confluente (normalmente 24-48 horas).
  3. Intente probar las células 4T1 con 500 ml de trippsina durante 2-5 minutos (las células deben enjuagar libremente la parte inferior del pozo). Transfiera todas las células a un plato de 6 cm en 4 ml de medios de selección (medios de crecimiento completos que contengan los antibióticos adecuados) que así se quemca la trippsina. Placa rlavar un plato de 6 cm de células de control no infectadas en el mismo medio de selección.
    NOTA: La concentración adecuada de antibióticos debe determinarse con antelación mediante la prueba de varias dosis. Además, la clasificación celular activada por fluorescencia también se puede utilizar para seleccionar las células etiquetadas fluorescentemente en lugar de la selección de fármacos.
  4. Incubar las células a 37 oC, 5%co2 en medios de selección y dividir las células cuando sea necesario hasta que todas las células de control no infectadas estén muertas (dependiendo del gen de selección y la línea celular).
  5. Confirme que las células 4T1 infectadas están expresando la proteína fluorescente ZsGreen utilizando una excitación verde (450-490 nm)/emisión (500-550 nm) filtro establecido en un microscopio fluorescente invertido en aumento de 50-100x.
  6. Confirme que las células 4T1 infectadas están expresando luciferasa utilizando un kit de actividad luciferasa disponible comercialmente de la siguiente manera.
    1. Utilice un volumen mínimo de 1 x tampón de lisis pasiva para lyse luciferase-expressing 4T1 células y controlar 4T1 células que no expresan luciferasa, agitando suavemente durante 30 minutos.
    2. Añadir 20 l de lisado celular a una placa de 96 pocillos de fondo blanco y luego 50 l de la luciferasa de ensayo reactivo del kit de actividad de la luciferasa.
    3. Utilice un lector de placas para medir la luminiscencia de las celdas en todas las longitudes de onda del espectro mediante el ajuste de luminiscencia.
      NOTA: El protocolo puede estar en pausa congelando las celdas transducidas de forma estable.
  7. Manipule la expresión del gen candidato de la siguiente manera:
    1. Placa 6 x 105 células 4T1 etiquetadas del paso 2.6 en un plato de 60 mm en 4 ml de medios de crecimiento completos e incubar a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
    2. Aspirar los medios de crecimiento de cada pocal y añadir 2 ml de medios de crecimiento completos que contengan 4 ml de bromuro de hexadimetrina de 8 mg/ml.
    3. Añadir 2 ml de sobrenadante viral desde el paso 1 a las células chapadas desde el paso 2.7.2 e incubar a 37oC, 5% CO2 durante la noche.
    4. Intente probar las células 4T1 con 500 ml de trippsina durante 2-5 minutos (las células deben enjuagar libremente la parte inferior del pozo). Transfiera todas las células a un plato de 10 cm en 10 ml de medios de selección (medios de crecimiento completos que contengan los antibióticos adecuados) que así se quemca la trippsina. Placa algunas células 4T1 de control no infectadas en el mismo medio de selección.
    5. Incubar las células a 37 oC, 5%co2 en medios de selección y dividir las células cuando sea necesario hasta que todas las células no infectadas estén muertas.
    6. Confirmar que la expresión del gen candidato se altera utilizando un enfoque estándar como western blot20 o qPCR21.
    7. Ensayo de luminiscencia y fluorescencia como en los pasos 2.5-2.6 para determinar cuán similares son en las células de control y derribo, ya que esto puede cambiar (ver Discusión).
      NOTA: El protocolo puede estar en pausa congelando las celdas transducidas de forma estable.

3. Optimización del diseño experimental in vivo

  1. Optimice el número de celda adecuado y la duración del experimento para la carga metastásica deseada de la siguiente manera.
    1. Expanda las células fluorescentes y bioluminiscentes 4T1 del paso 2.6 en medios de crecimiento completos para que el exceso de células esté disponible en el día deseado de inyección.
    2. Prepare las células para las inyecciones de vena de cola como se describe en el paso 4.2. Para determinar el número de celda óptimo para las inyecciones, resuspenda las células en varias concentraciones diferentes en 100 s de 1x PBS.
      NOTA: Recomendamos probar un rango de números de celda/ratón de 25.000 a 500.000.
    3. Mantenga las suspensiones celulares en hielo hasta la inyección.
    4. Inyectar cada dilución de células 4T1 del paso 3.1.2 en ratones 3-4 a través de la vena lateral de la cola descrita en el paso 4.3 (ver más abajo).
    5. Devuelva el ratón a su jaula y monitor durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa. Se debe revisar a los ratones en busca de signos de dolor o angustia 3 veces por semana.
    6. Monitoree a los ratones para la formación y el crecimiento de metástasis durante 3-6 semanas (dependiendo de la línea celular y de la tensión del ratón) utilizando un dispositivo de imágenes animal vivo in vivo (ver pasos 5 y 6).
      1. Euthanizar ratones 3-6 semanas después de la inyección de la vena de cola de acuerdo con las pautas institucionales estándar.
      2. Prepare los pulmones y evalúe el tamaño y el número de metástasis descritos en el paso 7.
      3. Elija el período de tiempo adecuado para que las metástasis crezcan para la carga metastásica deseada (ver discusión).

4. Inyección de vena de cola de células cancerosas etiquetadas

NOTA: El paso 4.2.4 se ha optimizado para células 4T1 que crecen en ratones singéricos de BALB/c. Si se utilizan otras líneas celulares cancerosas y cepas de ratón, primero se debe optimizar el número de células inyectadas y la longitud del ensayo.

  1. Expanda las líneas celulares 4T1 generadas en el paso 2 en dos platos de 15 cm en medios de crecimiento completos para que el exceso de células estén disponibles el día de la inyección.
  2. Prepare las células para la inyección de la vena de cola de la siguiente manera:
    1. Aspirar el medio y enjuagar las placas celulares con 1x PBS.
    2. Trippsinizar las células con 5 ml de tripsina por placa de 15 cm durante 2-5 minutos (las células deben enjuagar libremente la parte inferior del pozo). Transfiera todas las células a un tubo cónico. Lave las células restantes del plato de cultivo de tejido con suficientes medios de crecimiento completos para saciar la trippsina y agregar el lavado al mismo tubo cónico.
    3. Cuente las celdas usando un contador de celdas automatizado para determinar el número de celda total.
    4. Centrifugar las células a 122 x g durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 1x PBS a la concentración deseada. Aquí, 2.5 x 104 células se inyectan en cada ratón en 100 l de PBS, por lo que las células resuspend a 2.5 x 105 células/ml. Mantenga las suspensiones celulares en hielo hasta la inyección.
      NOTA: es importante limitar la cantidad de tiempo entre la trippsinización de las células y la inyección de la vena de la cola a aproximadamente 1 hora.
  3. Inyectar células 4T1 del paso 4.2.5 en ratones a través de la vena lateral de la cola de la siguiente manera:
    1. Trabajando en una capucha en la instalación animal, mezcle suavemente pero completamente las células invirtiendo el tubo o usando una jeringa de 1 ml para asegurarse de que se resuspenden uniformemente. Asegúrese siempre de que las células se resuspenden antes de cargar la jeringa.
    2. Cargue una jeringa Luer-lock de 1 ml con suspensión celular y expulse el exceso de burbujas de aire. Coloque una aguja de calibre 30 de pulgada y media en la jeringa con el bisel hacia arriba y expulse las burbujas de aire.
    3. Coloque suavemente el ratón en un restrainer de roedores.
    4. Las venas laterales de la cola deben ser visibles y dilatadas. Si no es así, pellizca suavemente la base de la cola y sumerge la cola en agua tibia del grifo para dilatar las venas.
      NOTA: La dilatación de las venas también se puede lograr colocando la jaula del ratón debajo de una lámpara de calentamiento y/o encima de una almohadilla de calentamiento.
    5. Use una toallita con alcohol para limpiar la cola. Inserte la aguja en la vena de la cola, bisele hacia arriba e inyecte 100 ml de suspensión celular.
      NOTA: Si la aguja se inserta correctamente en la vena, debe deslizarse fácilmente ligeramente hacia adelante y hacia atrás, y no debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo. Las inyecciones exitosas también deben dar lugar a un "flush" en el que el color azul de la vena se vuelve blanco durante unos segundos después de la inyección.
  4. Retire lentamente la aguja y con una gasa estéril, aplique presión en el lugar de la inyección para detener cualquier sangrado.
  5. Devuelva el ratón a su jaula y monitor durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa. Se debe revisar a los ratones en busca de signos de dolor o angustia 3 veces por semana.
  6. Monitoree a los ratones para la formación y el crecimiento de metástasis durante 3-6 semanas (dependiendo de la línea celular y de la tensión del ratón) utilizando un dispositivo de imágenes animal vivo in vivo (ver pasos 5 y 6).

5. Monitoreo de la carga metastásica por fluorescencia con un dispositivo de imagen animal vivo in vivo

NOTA: No ilumine animales para fluorescencia con señal luminiscente activa.

  1. Si solo se toma imágenes de bioluminiscencia, vaya al paso 6.
  2. Encienda el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo.
  3. Configure el sistema de anestesia por imágenes de animales vivos in vivo de acuerdo con las directrices del fabricante para entregar entre 1,5% y 2% isoflurano a la cámara de anestesia y la cámara de imágenes.
  4. Anestetiza ratones con metástasis etiquetadas fluorescentemente del paso 4 colocándolos en una cámara de anestesia y entregando 1.5-2.5% isoflurano.
  5. Abra el software de imagen (consulte Tabla de materiales)e inicie sesión.
  6. Haga clic en el botón Inicializar y espere a que se inicialice el equipo.
  7. Cambie el Campo de visión a D.
    NOTA: El campo de visión C también se puede utilizar si se requiere una vista más cercana de un ratón, pero esto limita el número de ratones que se pueden crear imágenes simultáneamente.
  8. Una vez que el software ha indicado que la cámara ha alcanzado la temperatura adecuada, haga clic en el botón Asistente de imágenes, elija Fluorescencia y, a continuación, elija el par de filtros adecuado en el menú desplegable.
    NOTA: Si el fluoróforo que se está utilizando no es una opción, elija Entrada EX/EM y escriba la excitación y la emisión requeridas.
  9. Coloque el ratón en la cámara como se describe en el paso 3.2.4.
  10. Haga clic en Adquirir secuencia.
  11. Después de la toma de imágenes, devuelva el ratón a su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa.
  12. Repita los pasos 5.2 y 5.7-5.9 con al menos un ratón que no contenga metástasis. NOTA: Este ratón se utilizará para cuantificar y restar la señal de fondo durante el análisis (paso 8).
  13. Imagen 2-3 veces por semana durante el experimento.

6. Control de la carga metastásica por bioluminiscencia con un dispositivo de imagen animal vivo in vivo

  1. Encienda el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo y configure el programa de la siguiente manera.
    1. Abra el software de imagen (consulte Tabla de materiales)e inicie sesión. Haga clic en el botón Inicializar y espere a que se inicialice el equipo. Cambie el Campo de visión a D.
      NOTA: El campo de visión C se puede utilizar para una vista más cercana a la imagen del cuerpo completo del ratón; sin embargo, esto limita el número de ratones que se pueden crear imágenes a la vez.
    2. Para el uso por primera vez, edite la configuración de la exposición de la siguiente manera: haga clic en Editar . Preferencias ? Adquisición de la Exposición automática y cambie el tiempo máximo de exposición del valor predeterminado de 60 segundos a 300 segundos y haga clic en OK.
      NOTA: No cambie ningún otro parámetro en la pestaña de exposición automática.
  2. Configure el sistema de anestesia de acuerdo con las directrices del fabricante para entregar entre 1,5% y 2% isoflurano a la cámara de anestesia y la cámara de imágenes.
  3. Asegúrese de que la cámara ha alcanzado la temperatura adecuada antes de continuar con el paso 6.4.
  4. Anestetiza los ratones que contienen metástasis del paso 4 colocándolos en una cámara de anestesia y entregando 1.5-2.5% de isoflurano.
  5. Prepare ratones para la imagen de bioluminiscencia de la siguiente manera.
    1. Cargue una jeringa de 1 ml con D-luciferina (30 mg/ml en D-PBS) y luego agregue una aguja de calibre 30 de pulgada a la jeringa y expulse burbujas de aire.
    2. Mida y registre la masa del ratón anestesiado.
    3. Sujete el ratón pellizcando el escote de su cuello usando el pulgar y los dedos del puntero y agarrando la cola entre el dedo meñique y la base de la mano. Invierta el ratón en un ángulo de 45 grados, con la cabeza apuntando hacia abajo.
    4. Inserte la aguja, el lado bisel hacia arriba, en el espacio intraperitoneal izquierdo (IP) del ratón. Confirme la entrada en el espacio IP devolviendo un volumen pequeño. No debe haber color en la base de la aguja al dibujar de nuevo en el espacio IP.
    5. Inyectar el volumen adecuado de D-luciferina para una dosis de 150 mg/kg.
    6. Inmediatamente después de la administración de D-luciferin, inicie un temporizador y coloque el ratón plano sobre su espalda en el dispositivo de imágenes con la nariz en el cono nasal y asegúrese de que se está administrando 1.5-2.5% isoflurano. Coloque divisores entre cada ratón si toma imágenes de varios ratones. Asegúrese de que los ratones estén lo más planos posible (es decir, no se inclinen hacia un lado).
    7. Haga clic en los cuadros Luminiscente y Fotografía y, a continuación, haga clic en Adquirir en el Panel de control de adquisición.
  6. Adquiera continuamente imágenes bioluminiscentes hasta que se alcance la señal máxima y utilice la imagen con la señal bioluminiscente máxima para el análisis.
  7. Después de la toma de imágenes, devuelva el ratón a su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa.
  8. Imagen 2-3 veces por semana durante el experimento.

7. Cuantificación del número y tamaño de metástasis

NOTA: El tiempo que se permite que crezcan las metástasis debe determinarse para cada línea celular y la tensión del ratón, y se verá influenciado por el número de células inyectadas.

  1. Eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices institucionales estándar.
  2. Aísle y retire los pulmones de cada ratón y enjuague en 1 x PBS para eliminar el exceso de sangre.
  3. Separe suavemente los pulmones en lóbulos.
  4. Adquiere imágenes de metástasis ZsGreen en los lóbulos a 10x en campo brillante y fluorescencia utilizando un estereoscopio fluorescente con un filtro de banda ancha GFP (excitación 470/40x).
    NOTA: Mantenga el mismo aumento y brillo para todas las muestras. La ampliación utilizada puede variar en función del tamaño, el número y el brillo de las metástasis, así como del campo de visión del microscopio utilizado.
  5. Utilice el software de análisis de imágenes para cuantificar el tamaño y el número de metástasis de las imágenes.
    NOTA: El protocolo para el análisis de imágenes depende del software y podría optimizarse con tumores del paso 3. Alternativamente, cuente el número de metástasis en cada pulmón manualmente usando el estereoscopio fluorescente. El protocolo se puede pausar aquí y el paso 8 se puede hacer en cualquier momento después de que se hayan recopilado todas las imágenes in vivo.

8. Procesamiento y análisis de los datos de las imágenes adquiridas con el dispositivo de imagen animal vivo in vivo

  1. Abra todos los archivos de imagen para cada ratón en el software de imagen.
    NOTA: Utilice la imagen con la señal bioluminiscente máxima para el análisis
  2. Asegúrese de que las unidades están en Radiance para datos bioluminiscentes y Eficiencia para datos fluorescentes haciendo clic en la flecha en la parte superior izquierda de la ventana de la imagen y cambiándola a la unidad adecuada.
  3. Utilice la imagen del último punto de tiempo para crear una región de interés (ROI) como se indica a continuación.
    1. Haga clic en Herramientas de ROI en la ventana Paleta de herramientas. Inserte un ROI haciendo clic en la flecha y seleccionando 1.
    2. Haga clic en el borde del ROI y muévalo sobre el pecho del ratón. Ajuste el tamaño del ROI para que cubra el pecho del ratón y no excluya la señal.
  4. Haga clic en medir ROI y copie o escriba el número sin procesar en una hoja de Excel.
    NOTA: Para los datos bioluminiscentes, seleccione el flujo total (fotones/segundo), que es la suma de todos los resplandores en el ROI. Dado que las metástasis no necesariamente crecen uniformemente, el flujo total se prefiere sobre el resplandor promedio porque mide la suma de la carga metastásica. Del mismo modo, en el caso de los datos fluorescentes, se debe utilizar el porcentaje de eficiencia total (luz de emisión (fotones/segundo)/luz de excitación (fotones/segundo)) en lugar de eficiencia media.
  5. Haga clic con el botón derecho en el archivo de imagen para copiar el ROI utilizado en el paso 8.3 y pegarlo en cada archivo de imagen.
    NOTA: Al cuantificar imágenes fluorescentes, cuantifique la misma región en un ratón que se ha introducido una imagen sin metástasis. Utilice esta señal como señal de fondo y reste de cada imagen de ratón fluorescente que contenga metástasis adquirida.
  6. Mueva los ROI pegados sobre la misma región seleccionada en el paso 8.3.4 para cada imagen y repita el paso 8.4.
  7. Trazar y analizar los datos sin procesar de la siguiente manera (véase el Cuadro Suplementario 2).
    1. Realice una transformación de registro10 de los datos sin procesar para cada ratón utilizando la fórmula indicada(Tabla suplementaria 2) y trace como en la Figura 2D y la Figura 4F. La transformación log10 linealiza la curva de crecimiento que tiende a ser geométrica y minimiza la heterocedasticidad.
    2. Mediante la regresión lineal, calcule la pendiente de la línea ajustada al registro10 datos transformados para cada ratón trazado en el paso 8.7.1 (Tabla suplementaria 2). Consulte la fórmula de la Tabla Suplementaria 2 para ajustar la línea y calcular la pendiente en un solo paso.
    3. Trazar los valores numéricos de las taludes como en la Figura 2E y la Figura 4G. Utilice la prueba t de un estudiante o la ANOVA unidireccional (para más de 2 grupos) en las pendientes para determinar la significancia estadística.

Resultados

Para demostrar el enfoque anterior, realizamos un experimento de prueba de concepto en el que un factor de replicación crítico, RPA3 fue derribado en una línea celular de carcinoma mamario de ratón metastásico (4T122). Mientras que el protocolo describe la etiquetado de las células con luciferasa y proteínas fluorescentes antes de la manipulación genética, utilizamos un enfoque modificado porque los vectores RNAi también entregan ZsGreen(Figura 2A).<...

Discusión

Pasos críticos del método
Es fundamental optimizar el número de células inyectadas (paso 3) para una línea celular dada y la tensión del ratón, ya que esto puede influir en gran medida en el número de metástasis que se forman y la longitud del experimento. Si se inyectan demasiadas células o las metástasis crecen durante demasiado tiempo, las metástasis pueden ser difíciles de contar haciendo que los efectos de la manipulación genética sean difíciles de evaluar. Sin embargo, si se inye...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Emily Norton por ayudar con las infecciones virales y la lectura crítica del manuscrito. También damos las gracias a Ryan Kanai por ayudar con la adquisición de imágenes de los pulmones y Kate E. Tubbesing por la ayuda con el análisis de imágenes de las metástasis verdes en los pulmones. Agradecemos al personal de la instalación de investigación animal por su apoyo y por la ayuda en la preparación de este video. Este trabajo fue apoyado por una beca Susan G. Komen Career Catalyst que otorgó a J.M.L. (#CCR17477184).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE GelFor western blot
2.5% TrypsinGibco15090-046Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipesFor sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)TaconicBALB-FFor tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regularVWR Ameresco97061-416For western blot
Cell lysis bufferCell SignalingFor collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μmCelltreat40-229749-CSFor filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamberFor euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kitPromegaE1960For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered salineHimediaTS1006For PBS
EDTAVWR97061-406Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US originVWR97068-085Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imagerFujifilmFor western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAbCell Signaling2118For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugateThermo Scientific31460For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FTInvitrogenR70007Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucoseGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure GradeVWR Ameresco97064-810For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
ImagejUsed for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF MembraneBiorad1620177For western blot
IsofluraneFor mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)PerkinElmerCLS136340For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)Leica MicrosystemsMicroscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-GlutamineGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000Life technologiesL3000008For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program)PerkinElmerSoftware for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ et al.,1992Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0FujifilmSoftware for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer)Gibco31985-062For packaging virus and transfection
Penicillin StreptomycinGibco15140-122Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kitThermo Scientific23225For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32957Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32953Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide)Sigma-Aldrich45-H9268For infection
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainerFor restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running bufferFor western blot
TAZ (V3886) AntibodyCell Signaling4883For western blot
TBST bufferFor western blot
TC20 automated cell counterBio-RadFor counting cells
VectorsSee Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence MicroscopeVWR89404-464For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer bufferFor western blot
XenoLight D-Luciferin K+ SaltPerkinElmer122799Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)Roche6365787001For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074For western blot

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