尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

要約

記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。

要約

転移は癌関連死の主な原因であり、転移性疾患患者の治療選択肢は限られている。転移性疾患のより良い治療法の開発を促進する新規治療標的の同定および検査は、生体内モデルにおける前臨床を必要とする。ここで実証された乳癌転移性コロニー形成とその後の増殖をアッジャーするための同系マウスモデルである。転移性癌細胞は、ホタルルシフェラーゼおよびZsGreenタンパク質をコードするウイルスベクターを安定して形質転換される。候補遺伝子は、ルシフェラーゼ/ZsGreen発現癌細胞で安定して操作され、その後、細胞は転移性コロニー形成および増殖をアッセイするために横尾静脈を介してマウスに注入される。その後、生体内イメージング装置を使用して、生きている動物の腫瘍細胞の生物発光または蛍光を測定し、時間の経過に続く転移性の変化を定量化する。蛍光タンパク質の発現により、断面染色や組織染色を必要とせずに、実験終了時に肺の転移の数と大きさを定量することができます。このアプローチは、転移性コロニー形成および増殖における候補遺伝子の役割をテストする比較的迅速かつ容易な方法を提供し、従来の尾静脈転移アッセイよりもはるかに多くの情報を提供する。このアプローチを用いて、乳癌細胞におけるPDZ結合モチーフ(TAZ)を用いたYes関連タンパク質(YAP)と転写共活性化剤の同時ノックダウンは、肺における転移性負担の軽減につながり、転移性コロニー形成の著しい低下と転移の増殖の減少の結果であることを示す。

概要

癌は世界第2位の死因¹であり、転移はこれらの死亡の大部分を担っている^2,3.しかし、転移性コロニー形成とその後の増殖を支配する分子機構の理解が限られており、転移性疾患に対する有効な治療法の開発を妨げている。新規治療標的の同定には、候補遺伝子の発現または機能が転移の形成と増殖にどのような影響を与えるかを試験するためのアッセイが必要である。オートクトンマウスモデルには利点がありますが、生成には時間とコストがかかり、ターゲット検出ではなくターゲット検証に適しています。候補遺伝子がインビトロの癌細胞で摂動し、転移電位に及ぼす影響が生体内で評価される移植モデルシステムは、オートクトンモデルよりも安価でスループットが高い。さらに、RNAi、CRISPR/CAS9、およびトランスジーンを安定的に送達するためのウイルスベクターが広く利用可能であり、癌細胞株に存在する遺伝子や遺伝子を比較的容易に摂動させることが容易です。このアプローチは、細胞を免疫不全またはヒト化マウスに移植することによってヒト癌細胞株における転移性コロニー形成および増殖における候補遺伝子の役割をアッセイするためにも使用できる。

生体内の移植癌細胞による転移形成を検査するために用いられる2種類のアッセイは、自発的転移アッセイと実験的転移アッセイである。自発的転移アッセイ^4,5では、癌細胞をマウスに注入し、原発腫瘍を形成させ、次いで自発的転移形成およびその後の増殖がアッセイされる。このモデルの強みは、転移性腫瘍を形成するために細胞が転移過程のすべてのステップを完了しなければならないことである。しかしながら、多くの癌細胞株は自発的転移モデルでは効率的に転移せず、原発性腫瘍増殖に影響を与える細胞の操作は転移アッセイの結果を混乱させることができる。がん細胞を循環に直接注射する実験的転移アッセイは、これらの落とし穴を避けるために用いられる。一般的な実験的転移アッセイは、尾静脈注射^6、7、8(およびここで実証)、心内注射^9、および門脈注射¹⁰を含む。

ここで提示されるプロトコルの目的は、研究者が転移の形成と成長をリアルタイムで監視し、同じマウスの肺における終点転移数と大きさを定量化することを可能にする生体内実験転移アッセイを提供することです。これを達成するために、従来の実験的な尾静脈転移アッセイ^6、7、8は、生体内撮像装置^{9、11、12、13、14}を用いて生体イメージングと組み合わされる。ルシフェラーゼと蛍光タンパク質の両方を安定して発現する腫瘍細胞を横尾静脈を介してマウスに注入し、その後、インビボイメージング装置を使用して、経時の肺の転移性負担の変化を測定する(図1)。しかしながら、生体内生きている動物イメージング装置は、個々の転移の大きさを区別または測定することができない。したがって、実験の終わりに、蛍光立体顕微鏡を使用して、断面化や組織学または免疫組織化学を必要とせずに、肺内の蛍光転移の数をカウントし、サイズを測定する(図1)。このプロトコルは、候補遺伝子の発現または機能を変更することが転移の形成および増殖にどのように影響するかをテストするために使用することができる。小分子または機能遮断抗体などの潜在的な治療化合物も試験することができる。

このアプローチを実証するために、まず、必須の複製因子である複製タンパク質A3(RPA3)が転移性マウス乳癌細胞でノックダウンされる概念実証実験を行いました。我々は、RPA3ノックダウン細胞を注射したマウスは、対照細胞を注射したマウスと比較して、毎回有意に転移性の負担が少ないことを示している。転移を含む肺の分析は、この転移性負担の減少は、転移性コロニー形成を著しく減少させ、形成する転移の増殖を損なった結果であることを示している。さらにこの技術を実証するために、PDZ結合モチーフ(TAZ)を用いたYes関連タンパク質(YAP)と転写共活性化剤の同時ノックダウンが転移性コロニー形成またはその後の増殖を損なうかどうかを試験した。YAPとTAZは、カバ経路の重要な下流エフェクターである2つの関連する転写共活性化剤である。我々^15、16および他のは転移にYAPおよびTAZを関与させ^{(17、18、19}で検討)、これらのタンパク質が良好な治療標的であることを示唆している。一貫して、YAP/TAZノックダウン細胞を注射したマウスは転移性負担を有意に軽減していることがわかりました。肺の分析は、YAP/TAZノックダウン細胞が多くのより少ない転移を形成し、形成した転移が小さいことを示した。これらの実験は、実験的な転移アッセイが、転移の形成と増殖における候補遺伝子の役割を迅速かつ安価にテストすることを可能にする方法を実証する。さらに、肺全体の転移の生きた動物イメージングと蛍光定量を組み合わせることで、転移性コロニー形成中の工程をよりよく理解する方法を示す。

プロトコル

このプロトコルは、マウスやバイオ危険物の使用を含み、適切な機関安全委員会の承認を必要とします。ここで説明されている生体内の仕事のすべては、アルバニー医科大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

注: プロトコルの概要については、図1の概略を参照してください。

1. 必要なレトロウイルスとレンチウイルスをすべて包装する

注:記載されたプロトコルは、ルシフェラーゼ酵素および蛍光タンパク質を安定して発現し、候補遺伝子の発現を操作するためにレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する。これらのウイルスは、以下に説明するようにHEK-293FT細胞にパッケージ化される。

1. 1日目:完全増殖媒体の2mL(ペニシリン/ストレプトマイシン1%と2mM L-グルタミンを有するDMEMの10%FBS)の6ウェルプレート上のプレートHEK-293FT細胞は、2日目に40〜60%のコンフルエントになるようにする。37°でインキュベートし、5%CO2を一晩で行う。
2. 2日目:各ウイルスベクターを包装するために、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターとウイルスコートおよび包装タンパク質をコードする適切なベクターを有するHEK-293FT細胞の40〜60%のコンフルエントウェルをトランスフェクトする。
   注:このプロトコルは、コートタンパク質としてVSVG、レンチウイルス包装のためのpsPAX2、およびレトロウイルス包装のためのgag-polを使用します(ベクターリストの補足表1を参照)。
3. 次のように、それぞれのウェルのコトランスフェクション混合物を作成します。
   1. トランスフェクション用の脂質溶液4μL(材料表参照)と96°Lのトランスフェクションバッファを組み合わせ、5分間インキュベートします。
   2. ウイルスベクター1μg、コートタンパク質ベクター(VSVG)0.5μg、包装タンパク質ベクター(psPAX2またはgag-pol)を0.5μg加え、20分間インキュベートします。
   3. ステップ1.3.2のコトランスフェクション混合物をステップ1.1でめっきしたHEK-293FT細胞に軽く加え、37°、5%CO2で一晩インキュベートします。
4. 3日目:トランスフェクション含有媒体を各ウェルから取り出し、各ウェルに2mLの完全成長媒体をそっと加えます。37°Cでインキュベートし、約_{24時間5%CO2。}
5. 4日目:3 mLシリンジを使用して各ウェルからウイルス上清を収集し、0.45μmフィルターを通して2mLマイクロ遠心管にフィルターを入れます。
6. オプション: ウイルスの2番目のバッチの収集が必要な場合は、各ウェルに2mLの完全な成長媒体を穏やかに追加し、37°でインキュベートし、約₂₄時間5%CO2をインキュベートします。
7. 5日目(オプション):ステップ1.5のようにウイルス上清の第2ラウンドを収集します。
   メモ:プロトコルは、ウイルス上清を凍結することによって一時停止され得る。

2. ルシフェラーゼと蛍光タンパク質を安定発現する癌細胞の生成

注:以下のプロトコルは、ユニークな選択遺伝子を持つ2つのベクターを使用して、ホタルルシフェラーゼと蛍光タンパク質(ZsGreen)で4T1細胞を安定的に標識する方法を説明しています。次いで、第3^のウイルスベクターを使用して、候補遺伝子の発現を操作する。しかしながら、蛍光タンパク質と遺伝子操作を同時に送り出すウイルスベクターは、代替手段としても用いることができる(以下の代表的な実験のように)。他の癌細胞も使用できますが、細胞番号はステップ2.1および2.7.1に最適化する必要があります。

1. プレート4T1細胞を1.5 x 10⁵細胞/ウェルで12ウェルプレート内の完全成長媒体(1%ペニシリン/ストレプトマイシンと2mM L-グルタミンを有するDMEMの10%FBS)で、37°、5%CO2で一晩インキュベートする。
2. 4T1細胞を、ステップ1で生成したウイルス上清に次のように感染させる。
   1. 細胞から増殖媒体を吸引し、ルシフェラーゼウイルス上清500μLと蛍光タンパク質ウイルス上清500μLを加え、ルシフェラーゼと蛍光タンパク質ウイルス上清の両方で細胞に同時に感染させる。
   2. 臭化ヘキサジダジメトリンを1μL加える(材料表を参照)。
   3. 細胞を37°Cでインキュベートし、75〜90%のコンフルエント(典型的には24〜48時間)まで5%である。
3. トリプシンの500 μLで4T1細胞を2〜5分間トリプシン化します(細胞は井戸の底から自由にすすぐるする必要があります)。すべての細胞を4mLの選択媒体(適切な抗生物質を含む完全な増殖媒体)で6cm皿に移し、それによってトリプシンをクエンチする。同じ選択媒体で非感染対照細胞の6cm皿をプレートする。
   注:適切な抗生物質濃度は、いくつかの用量をテストすることによって、事前に決定する必要があります。さらに、蛍光活性化細胞選別は、薬物選択の代わりに蛍光標識細胞を選択するためにも使用することができる。
4. 細胞を37°C、5%CO2で選択媒体にインキュベートし、感染していないすべてのコントロール細胞が死ぬまで必要に応じて細胞を分割する(選択遺伝子および細胞株に依存する)。
5. 感染した4T1細胞が、50~100倍の倍率で反転蛍光顕微鏡に設定された緑色励起(450~490nm)/放出(500~550nm)フィルターを用いてZsGreen蛍光タンパク質を発現していることを確認します。
6. 感染した4T1細胞が市販のルシフェラーゼ活性キットを用いてルシフェラーゼを発現していることを以下のように確認する。
   1. 1xパッシブリシスバッファーの最小ボリュームを使用して、ルシフェラーゼ発現4T1細胞をリゼし、ルシフェラーゼを発現しない4T1細胞を制御し、30分間穏やかに振とうします。
   2. 白底96ウェルプレートに20μLの細胞リサートを加え、ルシフェラーゼ活性キットからルシフェラーゼアッセイ試薬を50°L添加します。
   3. プレートリーダーを使用して、発光設定を使用してスペクトル内のすべての波長の細胞からの発光を測定します。
      メモ:プロトコルは、安定して転写された細胞を凍結することによって一時停止することができます。
7. 候補遺伝子の発現を次のように操作する。
   1. プレート6 x 10⁵は、ステップ2.6から4T1細胞を4mLの完全成長媒体で60mm皿に標識し、37°でインキュベートし、一晩で5%CO2を行う。
   2. 各ウェルから成長媒体を吸引し、8 mg/mLヘキサジデメトリン臭化物の4 μLを含む完全な成長媒体の2 mLを追加します。
   3. ステップ2.7.2からめっきした細胞にステップ1から2mLのウイルス上清を加え、37°でインキュベートし、一晩_5%CO2でインキュベートする。
   4. トリプシンの500 μLで4T1細胞を2〜5分間トリプシン化します(細胞は井戸の底から自由にすすぐるする必要があります)。すべての細胞を10mLの選択媒体(適切な抗生物質を含む完全な増殖媒体)で10cm皿に移し、それによってトリプシンをクエンチンする。同じ選択媒体内の4T1細胞とラベル付けされたいくつかの非感染制御をプレートする。
   5. 細胞を37°C、5%CO2で選択媒体にインキュベートし、感染していない細胞がすべて死ぬまで必要に応じて細胞を分割する。
   6. 候補遺伝子の発現がウェスタンブロット²⁰またはqPCR²¹などの標準的なアプローチを用いて改変されることを確認する。
   7. ステップ2.5~2.6のようにアッセイ発光と蛍光は、それらが制御細胞とノックダウン細胞にどれだけ類似しているかを判断します(ディスカッションを参照)。
      メモ:プロトコルは、安定して転写された細胞を凍結することによって一時停止することができます。

3. 生体内実験計画の最適化

1. 所望の転移負担に対して適切な細胞数と実験期間を次のように最適化します。
   1. 完全な増殖媒体のステップ2.6から蛍光および生物発光4T1細胞を拡張し、注射の希望日に余分な細胞が利用可能になるようにします。
   2. ステップ4.2の説明に従って、尾静脈注射用の細胞を準備します。注射に最適な細胞数を決定するには、1x PBSの100 μLでいくつかの異なる濃度で細胞を再中断します。
      注: 25,000 から 500,000 までのセル番号/マウスの範囲をテストすることをお勧めします。
   3. 注射まで細胞懸濁液を氷の上に置く。
   4. ステップ3.1.2から4T1細胞の各希釈を、ステップ4.3で説明した横尾静脈を介して3〜4匹のマウスに注入する(下記参照)。
   5. マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を確認します。マウスは、痛みや苦痛の兆候を毎週3倍チェックする必要があります。
   6. 生体内生動物イメージング装置を用いて3〜6週間の転移形成および増殖(細胞株およびマウス株依存性)のマウスを監視する(ステップ5および6を参照)。
      1. 標準的な制度ガイドラインに従って尾静脈注射の3〜6週間後にマウスを安楽死させる。
      2. 肺を準備し、ステップ7で説明した転移のサイズと数を評価する。
      3. 望ましい転移負担に対して転移が大きくなるのに適切な時間の長さを選択します(議論を参照)。

4. 標識癌細胞の尾静脈注射

注:ステップ4.2.4は、同種BALB/cマウスで増殖する4T1細胞用に最適化されています。他の癌細胞株およびマウス株を使用する場合、注入される細胞の数、およびアッセイの長さはまず最適化されるべきである。

1. 注射の日に余分な細胞が利用可能になるように、完全な成長媒体の2つの15cm皿のステップ2で生成された4T1細胞株を展開します。
2. 次のように尾静脈注射のための細胞を準備します。
   1. 媒体を吸引し、1x PBSで細胞プレートをすすすします。
   2. 15cmプレートあたり5mLのトリプシンで細胞を2〜5分間トリプシン化します(細胞は井戸の底から自由にすすいでください)。すべての細胞を円錐管に移します。トリプシンをクエンチし、同じ円錐形チューブに洗浄を追加するのに十分な完全な成長媒体で組織培養皿から残りの細胞を洗浄します。
   3. 自動セル カウンタを使用してセルをカウントし、セルの総数を調えます。
   4. 細胞を122xgで3分間遠心分離し、上清を吸引し、所望の濃度で1x PBSで細胞を再中断する。ここでは、2.5 x 10⁴個の細胞を100μLのPBSで各マウスに注入するので、2.5 x 10⁵セル/mLで細胞を再サスペンドします。注射まで細胞懸濁液を氷の上に置く。
      注:細胞のトリプシン化と尾静脈注射の間の時間を約1時間に制限することが重要です。
3. 次のように、ステップ 4.2.5 から 4T1 細胞を横尾静脈を介してマウスに注入します。
   1. 動物施設でフードで作業し、チューブを反転するか、1 mLの注射器を使用して細胞を穏やかに混合し、それらが均一に再懸濁されるようにします。シリンジをロードする前に、必ず細胞が再懸濁していることを確認してください。
   2. セルサスペンションで1 mLルアーロックシリンジをロードし、余分な気泡を排出します。ベベルを上にした注射器に1インチ、30ゲージの針を置き、気泡を排出します。
   3. げっ歯類の拘束器にマウスをそっと置きます。
   4. 横尾静脈は目に見え、拡張されるべきである。そうでない場合は、尾のベースを軽くつまみ、暖かい水道水に尾を浸して静脈を拡張します。
      注:静脈の拡張は、マウスケージを加熱ランプの下や加熱パッドの上に置くことによっても達成され得る。
   5. アルコールワイプを使用して尾を掃除します。針を尾静脈に差し込み、ベベル側を上にして、100μLの細胞懸濁液を注入します。
      メモ:針が静脈に正しく挿入されている場合は、わずかに前後にスライドしやすく、プランジャーを押しても抵抗があってはならない。注射が成功すると、静脈の青色が注射後数秒間白くなる「フラッシュ」も生じるはずです。
4. 針をゆっくりと取り出し、滅菌ガーゼを使用して、注射部位に圧力をかけて出血を止めます。
5. マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を保証します。マウスは、痛みや苦痛の兆候を毎週3倍チェックする必要があります。
6. 生体内生動物イメージング装置を用いて3〜6週間の転移形成および増殖(細胞株およびマウス株依存性)のマウスを監視する(ステップ5および6を参照)。

5. 生体内生動物イメージング装置による蛍光による転移負担のモニタリング

メモ:活性発光信号で蛍光のために動物を画像化しないでください。

1. イメージング生物発光のみの場合は、ステップ6に進みます。
2. インビボ生きている動物のイメージング装置をオンにします。
3. in vivo生きている動物イメージング麻酔システムを、麻酔室とイメージングチャンバーに1.5%から2%のイソフルランを送り出すためのメーカーのガイドラインに従って設定します。
4. ステップ4から蛍光標識転移を有するマウスを麻酔室に入れ、1.5〜2.5%のイソフルランを送出することにより、マウスを麻酔する。
5. イメージ ソフトウェアを開き (マテリアルの表を参照)、ログインします。
6. [初期化] ボタンをクリックし、コンピューターが初期化されるのを待ちます。
7. [視野]をDに変更します。
   注:視野C は、マウスをより近くで表示する必要がある場合にも使用できますが、これにより同時にイメージできるマウスの数が制限されます。
8. カメラが適切な温度に達したことを示したソフトウェアが表示されたら、[イメージングウィザード]ボタンをクリックし、[蛍光]を選択して、ドロップダウン メニューから適切なフィルタ ペアを選択します。
   メモ:使用している蛍光色素がオプションでない場合は、[入力 EX/EM]を選択し、必要な励起と放出を入力します。
9. ステップ3.2.4の説明に従って、マウスをチャンバーに置きます。
10. [シーケンスの取得] をクリックします。
11. イメージング後、マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を保証します。
12. 転移を含まないマウスを少なくとも 1 つ指定して、手順 5.2 と手順 5.7~ 5.9 を繰り返します。注:このマウスは、解析中にバックグラウンド信号を定量化して減算するために使用されます(ステップ8)。
13. 実験期間中の画像は週2~3回。

6. 生体内生動物イメージング装置による生物発光による転移負担のモニタリング

1. in vivo生きている動物のイメージング装置をオンにし、次のようにプログラムをセットアップします。
   1. イメージ ソフトウェアを開き (マテリアルの表を参照)、ログインします。[初期化] ボタンをクリックし、コンピューターが初期化されるのを待ちます。[視野]をDに変更します。
      注: ビュー Cのフィールドは、マウスのボディ全体をイメージするために近いビューに使用できます。ただし、これにより、一度に画像化できるマウスの数が制限されます。
   2. 初めて使用する場合は、次のように露出設定を編集します。環境設定 |買収 |[自動露出]をクリックし、最大露出時間を既定の 60 秒から 300 秒に変更して、[OK]をクリックします。
      注: [自動露出]タブで他のパラメータを変更しないでください。
2. 麻酔室およびイメージ下の部屋に1.5%と2%のイソフルランの間を提供するために製造業者のガイドラインに従って麻酔システムを設定する。
3. 手順 6.4 に進む前に、カメラが適切な温度に達していることを確認します。
4. ステップ4から転移を含むマウスを麻酔室に入れ、1.5〜2.5%のイソフルランを送出することによって、転移を含むマウスを麻酔する。
5. 生物発光イメージング用のマウスを以下のように調製する。
   1. D-ルシフェリン(D-PBSで30 mg/mL)で1 mLの注射器をロードし、シリンジに1/2インチの30ゲージ針を追加し、気泡を排出します。
   2. 麻酔されたマウスの質量を測定し、記録します。
   3. 親指とポインタの指を使って首の擦り傷をつまみ、ピンキーフィンガーと手のベースの間の尾をつかみ、マウスを拘束します。頭を下向きにして、マウスを 45 度の角度で反転します。
   4. 針をベベル側に上に挿入し、マウスの腹腔内(IP)空間に挿入します。小さなボリュームを取り戻して、IP スペースへの入力を確認します。IP空間に戻るときに、針の底に色が付いてはいけません。
   5. 150 mg/kg の用量の D-ルシフェリンの適切なボリュームを注入します。.
   6. D-ルシフェリン投与直後に、タイマーを開始し、鼻コーンに鼻を付けてイメージングデバイスの背面にマウスを平らに置き、1.5〜2.5%のイソフルランが投与されていることを確認します。複数のマウスをイメージングする場合は、各マウス間に分け器を置きます。マウスが可能な限り平らに配置されていることを確認します(つまり、片側に傾いていない)。
   7. [ルミネッセンス] ボックスと [写真] ボックスをクリックし、[取得]コントロール パネルの [取得] をクリックします。
6. ピーク信号が達成されるまで、生物発光画像を継続的に取得し、解析のためにピーク生物発光信号で画像を使用します。
7. イメージング後、マウスをケージに戻し、15分間監視して完全な回復を保証します。
8. 実験期間中の画像は週2~3回。

7. 転移の数と大きさの定量化

注:転移が増殖できる時間の長さは、細胞株およびマウス株ごとに決定されるべきであり、注入される細胞の数の影響を受ける。

1. 標準的な制度ガイドラインに従ってマウスを安楽死させる。
2. 各マウスから肺を分離して取り出し、1x PBSですすいで余分な血液を取り除きます。
3. 肺をゆっくりとローブに分けます。
4. GFP広帯域フィルター(励起470/40x)を用いた蛍光ステレオスコープを用いて、明視野と蛍光の10倍のローブにおけるZsGreen転移の画像を取得します。
   注: すべてのサンプルで同じ倍率と明るさを維持します。使用される倍率は、転移の大きさ、数、明るさ、および使用する顕微鏡の視野によって異なる場合があります。
5. 画像解析ソフトウェアを使用して、画像からの転移のサイズと数を定量化します。
   注:画像解析のプロトコルはソフトウェアに依存しており、ステップ3の腫瘍で最適化することができます。あるいは、蛍光ステレオスコープを用いて各肺の転移数を手動で数える。プロトコルはここで一時停止することができ、ステップ8は、すべての生体内画像が収集された後、任意の時点で行うことができます。

8. 生体内生動物イメージング装置で取得した画像からのデータの処理と解析

1. イメージ ソフトウェアでマウスごとにすべてのイメージ ファイルを開きます。
   注:解析には、ピーク生物発光信号で画像を使用します。
2. 画像ウィンドウの左上にある矢印をクリックし、適切な単位に変更することで、蛍光データの[生物発光データ]と[効率]の単位がラディアンスであることを確認します。
3. 最後のタイムポイントの画像を使用して、次のように対象地域 (ROI) を作成します。
   1. [ツール パレット]ウィンドウで[ROI ツール]をクリックします。矢印をクリックし、[1]を選択して、1 つの ROI を挿入します。
   2. ROIの境界線をクリックし、マウスの胸の上に移動します。ROIのサイズを調整して、マウスの胸を覆い、信号を除外しないようにします。
4. [メジャー ROI] をクリックし、生の数値を Excel シートにコピーまたは入力します。
   注:生物発光データの場合、ROI内のすべての輝度の合計である総フラックス(フォトン/秒)を選択します。転移は必ずしも均一に成長するとは限らないので、転移負担の合計を測定するので平均輝度よりも総フラックスが好ましい。同様に、蛍光データの場合は、平均効率の代わりに総効率%(発光光(光子/秒)/励起光(フォトン/秒))を使用する必要があります。
5. イメージ ファイルを右クリックして、手順 8.3 で使用した ROI をコピーし、すべてのイメージ ファイルに貼り付けます。
   注:蛍光画像を定量する場合は、転移なしで画像化したマウス上の同じ領域を定量します。この信号をバックグラウンド信号として使用し、取得した各蛍光転移含有マウス画像から差し引きます。
6. 貼り付けた ROI を、各イメージの手順 8.3.4 で選択したリージョンに移動し、手順 8.4 を繰り返します。
7. 生データを次のようにプロットして分析します (補足表 2を参照)。
   1. 示された式 (補足表 2)を使用して各マウスの生データのログ₁₀変換を行い、図 2Dおよび図 4Fのようにプロットします。log₁₀変換は、幾何学的になりがちな成長曲線を線形化し、不均一分散を最小化します。
   2. 線形回帰を使用して、ステップ 8.7.1 でプロットされた各マウスの対数₁₀変換データに適合線の傾きを計算します (補足表 2)。補助表 2の数式を参照して線分をフィットさせ、1 ステップで勾配を計算します。
   3. 図 2Eおよび図 4Gのように、勾配の数値をプロットします。スチューデントのt検定または一方向ANOVA(2グループ以上)を使用して、統計的有意性を決定します。

結果

上記のアプローチを実証するために、重要な複製因子であるRPA3を転移マウス乳腺癌細胞株(4T1²²⁾でノックダウンした概念実証実験を行った。このプロトコルは、遺伝子操作の前にルシフェラーゼと蛍光タンパク質の両方で細胞を標識することを記述しているが、RNAiベクターもZsGreenを提供するので、我々は改変されたアプローチを用いた(図2A)。

ディスカッション

メソッドの重要な手順
これは、形成する転移の数と実験の長さに大きく影響を与えることができるので、特定の細胞株とマウス株のために注入される細胞の数を最適化することが重要です(ステップ3)。あまりにも多くの細胞が注入されたり、転移が長時間増殖したりすると、転移を数え難しくして遺伝子操作の効果を評価することが困難になる可能性があります。しかし、注?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE Gel			For western blot
2.5% Trypsin	Gibco	15090-046	Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plate	Corning	3922	For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipes			For sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)	Taconic	BALB-F	For tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regular	VWR Ameresco	97061-416	For western blot
Cell lysis buffer	Cell Signaling		For collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μm	Celltreat	40-229749-CS	For filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamber			For euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kit	Promega	E1960	For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered saline	Himedia	TS1006	For PBS
EDTA	VWR	97061-406	Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US origin	VWR	97068-085	Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imager	Fujifilm		For western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAb	Cell Signaling	2118	For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugate	Thermo Scientific	31460	For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FT	Invitrogen	R70007	Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucose	GE Healthcare life sciences	SH30243.01	Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure Grade	VWR Ameresco	97064-810	For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EA	Molecular devices		For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Imagej			Used for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF Membrane	Biorad	1620177	For western blot
Isoflurane			For mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)	PerkinElmer	CLS136340	For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)	Leica Microsystems		Microscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-Glutamine	Gibco	25030-081	Component of complete growth media
Lipofectamine 3000	Life technologies	L3000008	For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program)	PerkinElmer		Software for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1	Karmanos Cancer Institute	Aslakson, CJ et al.,1992	Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0	Fujifilm		Software for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer)	Gibco	31985-062	For packaging virus and transfection
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kit	Thermo Scientific	23225	For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets	Thermo Scientific	A32957	Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets	Thermo Scientific	A32953	Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide)	Sigma-Aldrich	45-H9268	For infection
Puromycin	Sigma-Aldrich	45-P7255	For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainer			For restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running buffer			For western blot
TAZ (V3886) Antibody	Cell Signaling	4883	For western blot
TBST buffer			For western blot
TC20 automated cell counter	Bio-Rad		For counting cells
Vectors			See Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence Microscope	VWR	89404-464	For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer buffer			For western blot
XenoLight D-Luciferin K+ Salt	PerkinElmer	122799	Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)	Roche	6365787001	For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb	Cell Signaling	14074	For western blot