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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.

Abstract

La metastasi è la principale causa di decessi correlati al cancro e ci sono limitate opzioni terapeutiche per i pazienti con malattia metastatica. L'identificazione e il collaudo di nuovi obiettivi terapeutici che faciliteranno lo sviluppo di migliori trattamenti per la malattia metastatica richiede modelli preclinici in vivo. Dimostrata qui è un modello di topo singenico per la soranalisi della colonizzazione metastatica del cancro al seno e la crescita successiva. Le cellule tumorali metastatiche sono tradusse stabilmente con vettori virali che codificano le luciferasi delle lucciole e le proteine verdi. I geni candidati vengono poi manipolati stabilmente nelle cellule tumorali che esprimono luciferasi / sGreen e quindi le cellule vengono iniettate nei topi attraverso la vena della coda laterale per testare la colonizzazione e la crescita metastatica. Un dispositivo di imaging in vivo viene quindi utilizzato per misurare la bioluminescenza o la fluorescenza delle cellule tumorali negli animali viventi per quantificare i cambiamenti nel carico metastatico nel tempo. L'espressione della proteina fluorescente consente di quantificare il numero e le dimensioni delle metastasi nei polmoni alla fine dell'esperimento senza la necessità di sezionare o colorare istologico. Questo approccio offre un modo relativamente rapido e semplice per testare il ruolo dei geni candidati nella colonizzazione e nella crescita metastatica e fornisce molte più informazioni rispetto ai tradizionali saggi di metastasi della vena della coda. Utilizzando questo approccio, mostriamo che il knockdown simultaneo di yes associated protein (YAP) e co-attivatore trascrizionale con un motivo legante PD (TAz) nelle cellule di cancro al seno porta a una riduzione del carico metastatico nei polmoni e che questo carico ridotto è il risultato di una colonizzazione metastatica significativamente compromessa e di una ridotta crescita delle metastasi.

Introduzione

Il cancro rimane la seconda causa di morte in tutto il mondo1 e la metastasi è responsabile della maggior parte di questi decessi2,3. Tuttavia, una comprensione limitata dei meccanismi molecolari che governano la colonizzazione metastatica e la successiva crescita ha ostacolato lo sviluppo di trattamenti efficaci per la malattia metastatica. L'identificazione di nuovi obiettivi terapeutici richiede un saggio per testare come l'espressione o la funzione perturbata di un gene candidato influenzi la formazione e la crescita delle metastasi. Sebbene i modelli di mouse autoctonomi abbiano i loro vantaggi, richiedono molto tempo e sono costosi da generare, il che li rende più adatti per la convalida degli obiettivi piuttosto che per l'individuazione della destinazione. I sistemi modello di trapianto in cui il gene candidato è perturbato nelle cellule tumorali in vitro e quindi gli effetti sul potenziale metastatico sono valutati in vivo, sono meno costosi e una maggiore produttività rispetto ai modelli autoctoni. Inoltre, sono ampiamente disponibili vettori virali per la consegna stabile di RNAi, CRISPR/CAS9 e transgene, il che rende relativamente facile perturbare praticamente qualsiasi gene o gene di interesse in linee cellulari tumorali. Questo approccio può essere utilizzato anche per esaminare il ruolo dei geni candidati nella colonizzazione metastatica e nella crescita delle linee cellulari del cancro umano trapiantando le cellule in topi immunocompromessi o umorizzati.

I due tipi di saggi utilizzati per testare la formazione di metastasi da cellule tumorali trapiantate in vivo sono saggi di metastasi spontanei e saggi di metastasi sperimentali. Nei saggi di metastasi spontanea4,5, le cellule tumorali vengono iniettate nei topi, permesso di formare un tumore primario, e quindi la formazione spontanea di metastasi e la crescita successiva sono formulati. La forza di questo modello è che le cellule devono completare tutte le fasi del processo metastatico al fine di formare tumori metastatici. Tuttavia, molte linee cellulari tumorali non metastatizzano in modo efficiente nei modelli di metastasi spontanee, e qualsiasi manipolazione delle cellule che colpisce la crescita primaria del tumore può confondere i risultati del saggio di metastasi. I saggi sperimentali di metastasi, in cui le cellule tumorali vengono iniettate direttamente nella circolazione, vengono utilizzati per evitare queste insidie. I più saggi di metastasi sperimentale comuni includono l'iniezione dellavenadella coda6,7,8 (e qui riportata), l'iniezione intracardiaca9e l'iniezione di vena del portale10.

Lo scopo del protocollo qui presentato è quello di fornire un test di metastasi sperimentale in vivo che consente a un ricercatore di monitorare la formazione e la crescita delle metastasi in tempo reale, nonché di quantificare il numero e le dimensioni della metastasi del punto finale nei polmoni dello stesso topo. Per raggiungere questo obiettivo, i tradizionali saggi sperimentali della vena della coda6,7,8 sono combinati con l'imaging animale vivo, utilizzando un dispositivo di imaging in vivo9,11,12,13,14. Le cellule tumorali che esprimono stabilmente sia la luciferasi che una proteina fluorescente vengono iniettate nei topi attraverso la vena laterale della coda e quindi il dispositivo di imaging in vivo viene utilizzato per misurare i cambiamenti nel carico metastatico nei polmoni nel tempo (Figura 1). Tuttavia, il dispositivo di imaging animale vivo in vivo non può distinguere o misurare le dimensioni delle singole metastasi. Così, alla fine dell'esperimento, uno stereomicroscopio fluorescente viene utilizzato per contare il numero e misurare la dimensione delle metastasi fluorescenti nei polmoni senza la necessità di sezionamento e istologia o immunohistochimica (Figura 1). Questo protocollo può essere utilizzato per testare come alterare l'espressione o la funzione di un gene candidato influenzi la formazione e la crescita delle metastasi. Possono essere testati anche potenziali composti terapeutici come piccole molecole o anticorpi di blocco delle funzioni.

Per dimostrare questo approccio, abbiamo prima eseguito un esperimento proof of concept in cui il fattore di replicazione essenziale, la proteina di replicazione A3 (RPA3) viene abbattuta nelle cellule metastatiche del cancro al seno del topo. Mostriamo che i topi iniettati con cellule knockdown RPA3 hanno significativamente meno carico metastatico ad ogni punto di tempo rispetto ai topi iniettati con cellule di controllo. L'analisi dei polmoni contenenti metastasi mostra che questo ridotto carico metastatico è il risultato di una colonizzazione metastatica significativamente ridotta e di una crescita compromessa delle metastasi che si formano. Per dimostrare ulteriormente questa tecnica, abbiamo testato se la composizione simultanea di proteine associate AYes (YAP) e co-attivatore trascrizionale con un motivo legante PD (TA) non compromette la colonizzazione metastatica o la crescita successiva. YAP e TAÀ sono due co-attivatori trascrizionali correlati che sono gli effetti a valle critici del Sentiero Ippopotamo. Abbiamo15,16 e altri hanno implicato YAP e TAz in metastasi (recensito in17,18,19), suggerendo che queste proteine sono buoni obiettivi terapeutici. Coerentemente, abbiamo scoperto che i topi iniettati con cellule knockdown YAP/TAz avevano significativamente ridotto l'onere metastatico. L'analisi dei polmoni ha mostrato che le cellule knockdown YAP/TAz formavano molte meno metastasi e che le metastasi che si formavano erano più piccole. Questi esperimenti dimostrano come i saggi sperimentali di metastasi consentano a un ricercatore di testare in modo rapido ed economico il ruolo di un gene candidato nella formazione e nella crescita delle metastasi. Essi mostrano inoltre come l'uso combinato di imaging animale vivo e quantificazione fluorescente di metastasi in polmoni interi permette al ricercatore di comprendere meglio i passi durante la colonizzazione metastatica.

Protocollo

Questo protocollo prevede l'uso di topi e materiali biopericolosi e richiede l'approvazione da parte dei comitati di sicurezza istituzionali appropriati. Tutto il lavoro in vivo qui descritto è approvato dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Albany Medical College (IACUC).

NOTA: per una panoramica del protocollo, vedere schematico nella Figura 1.

1. Imballaggio di tutti i retrovirus richiesti e lentivirus

NOTA: Il protocollo descritto utilizza vettori lentivirali o retrovirali per esprimere stabilmente un enzima luciferasi e proteine fluorescenti e per manipolare l'espressione di un gene candidato. Questi virus sono confezionati nelle cellule HEK-293FT come descritto di seguito.

  1. Giorno 1: Piastra HEK-293FT cellule su piastre 6-pozze in 2 mL di supporti di crescita completa (10% FBS in DMEM con 1% penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutamine) in modo che siano 40-60% confluenti il giorno 2. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 durante la notte.
  2. Giorno 2: Per ogni vettore virale da confezionare, trasfecare un pozzo confluente 40-60% di cellule HEK-293FT con il vettore retrovirale o lentivirale e i vettori appropriati che codificano il cappotto virale e le proteine di imballaggio.
    NOTA: questo protocollo utilizza VSVG come proteina del mantello, psPAX2 per l'imballaggio lentivirale e gag-pol per l'imballaggio retrovirale (vedere Tabella supplementare 1 per l'elenco vettoriale).
  3. Fare una miscela di co-trasfezione per ogni bene come segue:
    1. Unire 4 ll di soluzione lipidica per le trafettitte (vedi Tabella dei Materiali)e 96 l di tampone di trasfezione e incubare per 5 minuti.
    2. Aggiungete 1 g di vettore virale, 0,5 g di vettore proteico del mantello (VSVG) e 0,5 g di vettore proteico di imballaggio (psPAX2 o gag-pol) e incubate per 20 minuti.
    3. Aggiungere delicatamente la miscela di co-trasfezione dal passo 1.3.2 alle cellule HEK-293FT placcate al punto 1.1 e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 durante la notte.
  4. Giorno 3: Rimuovere il supporto che contiene la trasfezione da ogni pozzo e aggiungere delicatamente 2 mL di supporti di crescita completa ad ogni pozzo. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per circa 24 ore.
  5. Giorno 4: Raccogliere il supernatante virale da ogni pozzo utilizzando una siringa da 3 mL e filtrare attraverso un filtro 0,45 m in un tubo di microcentrismo da 2 mL.
  6. Facoltativo: se si desidera la raccolta di un secondo lotto di virus, aggiungere delicatamente 2 mL di supporti di crescita completa a ciascun pozzo e incubare a 37 C, 5% CO2 per circa 24 ore.
  7. Giorno 5 (facoltativo): Raccogliere un secondo ciclo di supernatali virali come nel passaggio 1.5.
    NOTA: Il protocollo può essere sospeso congelando il supernnatale virale.

2. Generazione di cellule tumorali che esprimono stabilmente luciferasi e una proteina fluorescente

NOTA: Il seguente protocollo descrive come etichettare in modo stabile le cellule 4T1 con luciferasi di lucciole e una proteina fluorescente (verde) utilizzando due vettori con geni di selezione unici. Quindi un vettore virale 3rd viene utilizzato per manipolare l'espressione di un gene candidato. Tuttavia, i vettori virali che forniscono contemporaneamente una proteina fluorescente e una manipolazione genetica possono anche essere utilizzati come alternativa (come negli esperimenti rappresentativi riportati di seguito). Altre cellule tumorali possono essere utilizzate, ma i numeri delle cellule devono essere ottimizzati per i passi 2.1 e 2.7.1.

  1. Piastra 4T1 cellule a 1,5 x 105 cellule / bene in una piastra di 12 pozzetti in mezzi di crescita completa (10% FBS in DMEM con 1% penicillina / streptomicina e 2 mM L-Glutamine) e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 durante la notte.
  2. Infettare le cellule 4T1 con il supernante virale generato nel passaggio 1 come segue.
    1. Aspirare i mezzi di crescita dalle cellule e aggiungere 500 -L di lucidferase supernnatante virale e 500 .L di proteina fluorescente supernatant virale per infettare contemporaneamente le cellule sia con i supernatanti virali luciferasi che proteici fluorescenti.
    2. Aggiungere 1 -L di bromuro di esadimetingia 8 mg/mL (vedere Tabella dei materiali).
    3. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi, 5% fino al 75-90% di confluenti (tipicamente 24-48 ore).
  3. Provare le cellule 4T1 con 500 litri di trypsin per 2-5 minuti (le cellule dovrebbero risciacquare liberamente dal fondo del pozzo). Trasferire tutte le cellule in un piatto di 6 cm in 4 mL di mezzi di selezione (mezzi di crescita completi contenenti gli antibiotici appropriati) discando così la trypsin. Piatto di 6 cm di cellule di controllo non infette nello stesso supporto di selezione.
    NOTA: L'adeguata concentrazione antibiotica deve essere determinata in anticipo testando diverse dosi. Inoltre, lo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza può essere utilizzato anche per selezionare le cellule con etichetta fluorescente al posto della selezione del farmaco.
  4. Incubare le cellule a 37 , 5% DI CO2 nei mezzi di selezione e dividere le cellule quando necessario fino a quando tutte le cellule di controllo non infette sono morte (a seconda del gene di selezione e della linea cellulare).
  5. Verificare che le cellule 4T1 infette eseprimano la proteina fluorescente verde utilizzando un filtro di eccitazione verde (450-490 nm)/emissione (500-550 nm) impostato su un microscopio fluorescente invertito a ingrandimento 50-100x.
  6. Confermare che le cellule 4T1 infette stanno esprimendo luciferasi utilizzando un kit di attività luciferasi disponibile in commercio come segue.
    1. Utilizzare un volume minimo di 1x buffer di lisi passiva per lussuriare le cellule 4T1 che esprimono luciferasi e controllare le cellule 4T1 che non esprimono luciferasi, agitando delicatamente per 30 minuti.
    2. Aggiungete 20 lunatici a una piastra bianca-inferiore 96-well e poi 50 l del dicono luciferate reagente dal kit di attività luciferasi.
    3. Utilizzare un lettore di lastre per misurare la luminescenza delle cellule a tutte le lunghezze d'onda dello spettro utilizzando l'impostazione della luminescenza.
      NOTA: il protocollo può essere sospeso bloccando le cellule trasdotte in modo stabile.
  7. Manipolare l'espressione del gene candidato come segue:
    1. Piastra 6 x 105 etichettata 4T1 cellule dal passo 2.6 su un piatto 60 mm in 4 mL di mezzi di crescita completa e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 durante la notte.
    2. Aspirare i media di crescita da ogni pozzo e aggiungere 2 mL di supporti di crescita completa contenenti 4 -L di bromuro di esadimetina 8 mg/mL.
    3. Aggiungere 2 mL di supernatante virale dal punto 1 alle cellule placcate dal passo 2.7.2 e incubare a 37 c, 5% CO2 durante la notte.
    4. Provare le cellule 4T1 con 500 litri di trypsin per 2-5 minuti (le cellule dovrebbero risciacquare liberamente dal fondo del pozzo). Trasferire tutte le cellule in un piatto di 10 cm in 10 mL di supporti di selezione (mezzi di crescita completi contenenti gli antibiotici appropriati) placando così la trypsin. Piastrare alcuni controlli non infetti etichettato 4T1 cellule nello stesso supporto di selezione.
    5. Incubare le cellule a 37 , 5% DI CO2 nei mezzi di selezione e dividere le cellule quando necessario fino a quando tutte le cellule non infette sono morte.
    6. Confermare che l'espressione del gene candidato viene alterata utilizzando un approccio standard come la macchia occidentale20 o qPCR21.
    7. La luminescenza e la fluorescenza del saggio come nei passaggi 2.5-2.6 per determinare quanto siano simili nelle cellule di controllo e knockdown, in quanto questo può cambiare (vedi Discussione).
      NOTA: il protocollo può essere sospeso bloccando le cellule trasdotte in modo stabile.

3. Ottimizzazione del progetto sperimentale in vivo

  1. Ottimizzare il numero di cella appropriato e la durata dell'esperimento per l'onere metastatico desiderato come segue.
    1. Espandere le cellule 4T1 fluorescenti e bioluminescenti dal punto 2.6 in un supporto a crescita completa in modo che le cellule in eccesso siano disponibili nel giorno di iniezione desiderato.
    2. Preparare le cellule per le iniezioni di vena della coda come descritto al punto 4.2. Per determinare il numero di cellulare ottimale per le iniezioni, risospendere le cellule a diverse concentrazioni in 100 - L di 1x PBS.
      NOTA: Si consiglia di testare un intervallo di numeri di cella / mouse da 25.000 fino a 500.000.
    3. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino all'iniezione.
    4. Iniettare ogni diluizione di cellule 4T1 dal passaggio 3.1.2 in 3-4 topi attraverso la vena posteriore della coda descritta nel passaggio 4.3 (vedi sotto).
    5. Riportare il mouse alla gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire un recupero completo. I topi devono essere controllati per i segni di dolore o angoscia 3volte.
    6. Monitorare i mouse per la formazione e la crescita di metastasi per 3-6 settimane (linea cellulare e pressione del topo dipendente) utilizzando un dispositivo di imaging animale vivo in vivo (vedere i passaggi 5 e 6).
      1. I topi eutanasi 3-6 settimane dopo l'iniezione della vena della coda secondo le linee guida istituzionali standard.
      2. Preparare i polmoni e valutare la dimensione e il numero della metastasi descritti al punto 7.
      3. Scegliere il periodo di tempo appropriato per la crescita delle metastasi per l'onere metastatico desiderato (vedere discussione).

4. Iniezione della vena della coda di cellule tumorali etichettate

NOTA: Il passaggio 4.2.4 è stato ottimizzato per le cellule 4T1 che crescono nei topi sinogenici BALB/c. Se vengono utilizzate altre linee cellulari tumorali e ceppi di topo, il numero di cellule iniettate e la lunghezza del saggio devono prima essere ottimizzate.

  1. Espandere le linee cellulari 4T1 generate nel punto 2 su due piatti da 15 cm in supporti di crescita completa in modo che le cellule in eccesso siano disponibili il giorno dell'iniezione.
  2. Preparare le cellule per l'iniezione della vena della coda come segue:
    1. Aspirati il supporto e risciacquare le piastre delle cellule con 1x PBS.
    2. Provare le cellule con 5 mL di trypsin per 15 cm piastra per 2-5 minuti (le cellule dovrebbero risciacquare liberamente il fondo del pozzo). Trasferire tutte le cellule in un tubo conico. Lavare le cellule rimanenti dal piatto di coltura dei tessuti con un supporto di crescita sufficientemente completo per placare la prova e aggiungere il lavaggio allo stesso tubo conico.
    3. Contare le celle utilizzando un contatore cellulare automatizzato per determinare il numero totale di celle.
    4. Centrifugare le cellule a 122 x g per 3 minuti, aspirare il super-natante, e riutilizzare le cellule in 1x PBS alla concentrazione desiderata. Qui, 2,5 x 104 celle vengono iniettate in ogni topo in 100 : L di PBS, quindi le celle di resospendio a 2,5 x 105 celle / mL. Mantenere le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino all'iniezione.
      NOTA: è importante limitare il tempo tra la ripsinizzazione delle cellule e l'iniezione della vena della coda a circa 1 ora.
  3. Iniettare 4T1 cellule dal passo 4.2.5 nei topi attraverso la vena posteriore della coda come segue:
    1. Lavorando in un cappuccio presso l'impianto animale, mescolare delicatamente ma accuratamente le cellule invertendo il tubo o utilizzando una siringa da 1 mL per garantire che vengano risospese uniformemente. Assicurarsi sempre che le celle siano risospese prima di caricare la siringa.
    2. Caricare una siringa Luer-lock da 1 mL con sospensioni cellulari ed espellere le bolle d'aria in eccesso. Posizionare un ago da 1/2 pollice e 30 calibro sulla siringa con la smussatura in su ed espellere le bolle d'aria.
    3. Posizionare delicatamente il mouse in un ristrainer per roditori.
    4. Le vene laterali della coda devono essere visibili e dilatate. In caso contrario, pizzicare delicatamente la base della coda e immergere la coda in acqua calda del rubinetto per dilatare le vene.
      NOTA: La dilatazione delle vene può essere ottenuta anche posizionando la gabbia del mouse sotto una lampada di riscaldamento e/o sopra una piastra di riscaldamento.
    5. Utilizzare una salvietta alcolica per pulire la coda. Inserire l'ago nella vena posteriore, smussare il lato verso l'alto e iniettare 100 l of una sospensione cellulare.
      NOTA: Se l'ago è inserito correttamente nella vena, dovrebbe facilmente scivolare leggermente avanti e indietro, e non ci dovrebbe essere resistenza quando lo stantuffo viene spinto. Iniezioni riuscite dovrebbero anche provocare un "flush" in cui il colore blu della vena diventa bianco per alcuni secondi dopo l'iniezione.
  4. Rimuovere lentamente l'ago e utilizzando una garza sterile, applicare la pressione al sito di iniezione per fermare qualsiasi sanguinamento.
  5. Riportare il mouse alla gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero. I topi devono essere controllati per i segni di dolore o angoscia 3volte.
  6. Monitorare i mouse per la formazione e la crescita di metastasi per 3-6 settimane (linea cellulare e pressione del topo dipendente) utilizzando un dispositivo di imaging animale vivo in vivo (vedere i passaggi 5 e 6).

5. Monitoraggio del carico metastatico mediante fluorescenza con un dispositivo di imaging animale vivo in vivo

NOTA: Non immagine animale per la fluorescenza con segnale luminescente attivo.

  1. Se si fa solo l'imaging della bioluminescenza, andare al passaggio 6.
  2. Accendere il dispositivo di imaging animale vivo in vivo.
  3. Impostare il sistema di anestesia per l'imaging animale vivo in vivo secondo le linee guida del produttore per fornire tra l'1,5% e il 2% dell'isoflurane alla camera di anestesia e alla camera di imaging.
  4. Anestesizza i topi con metastasi fluorescenti del passaggio 4 posizionandoli in una camera di anestesia e consegnando l'isoflurane 1,5-2,5%.
  5. Aprire il software di immagine (vedere Tabella dei materiali)e accedere.
  6. Fare clic sul pulsante Inizializza e attendere l'inizializzazione del computer.
  7. Modificare il campo di visualizzazione in D.
    NOTA: Il campo di vista C può essere utilizzato anche se è necessaria una visione più ravvicinata di un mouse, ma questo limita il numero di mouse che possono essere visualizzati contemporaneamente.
  8. Una volta che il software ha indicato che la fotocamera ha raggiunto la temperatura appropriata, fare clic sul pulsante Imaging Wizard, scegliere Fluorescenza e quindi scegliere la coppia di filtri appropriata dal menu a discesa.
    NOTA: Se il fluoroforo utilizzato non è un'opzione, scegliere Input EX/EM e digitare l'eccitazione e l'emissione necessarie.
  9. Posizionare il mouse nella camera come descritto al punto 3.2.4.
  10. Fare clic su Acquisisci sequenza.
  11. Dopo l'imaging, riportare il mouse alla sua gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero.
  12. Ripetere il passaggio 5.2 e i passaggi 5.7-5.9 con almeno un mouse che non contiene metastasi. NOTA: Questo mouse verrà utilizzato per quantificare e sottrarre il segnale di fondo durante l'analisi (passaggio 8).
  13. Immagine 2-3 volte settimanale per la durata dell'esperimento.

6. Monitoraggio del carico metastatico dalla bioluminescenza con un dispositivo di imaging animale vivo in vivo

  1. Accendere il dispositivo di imaging animale vivo in vivo e impostare il programma come segue.
    1. Aprire il software di immagine (vedere Tabella dei materiali)e accedere. Fare clic sul pulsante Inizializza e attendere l'inizializzazione del computer. Modificare il campo di visualizzazione in D.
      NOTA: Il campo di vista C può essere utilizzato per una visione più ravvicinata per l'immagine del corpo completo del mouse; tuttavia, questo limita il numero di topi che possono essere immagine contemporaneamente.
    2. Per il primo utilizzo, modificare le impostazioni di esposizione come segue: fare clic su Modifica Proprietà Preferences (Preferenze) Acquisizione . Esposizione automatica e modificare il tempo massimo di esposizione dal valore predefinito 60 secondi a 300 secondi e fare clic su OK.
      NOTA: non modificare altri parametri nella scheda Esposizione automatica.
  2. Impostare il sistema di anestesia secondo le linee guida del produttore per fornire tra l'1,5% e il 2% di isoflurane alla camera di anestesia e alla camera di imaging.
  3. Assicurarsi che la telecamera abbia raggiunto la temperatura appropriata prima di procedere al passaggio 6.4.
  4. Anestesizzai topi contenenti metastasi dal punto 4 posizionandoli in una camera di anestesia e erogare 1,5-2,5% di isoflurane.
  5. Preparare i topi per l'imaging della bioluminescenza come segue.
    1. Caricare una siringa da 1 mL con D-lucidferin (30 mg/mL in D-PBS) e quindi aggiungere un ago da 1/2 pollice da 30 gauge alla siringa ed espellere le bolle d'aria.
    2. Misurare e registrare la massa del topo anestesizzato.
    3. Restringere il mouse pizzicando la foratura del collo usando il pollice e le dita del puntatore e afferrando la coda tra il mignolo e la base della mano. Invertire il mouse con un angolo di 45 gradi, con la testa rivolta verso il basso.
    4. Inserire l'ago, smussare il lato verso l'alto, nello spazio intraperitoneale (IP) del lato sinistro del mouse. Confermare l'ingresso nello spazio IP ritirando un piccolo volume. Non ci dovrebbe essere colore alla base dell'ago quando si disegna indietro nello spazio IP.
    5. Iniettare il volume appropriato di D-luciferin per una dose di 150 mg/kg.
    6. Subito dopo la somministrazione D-luciferin, avviare un timer e posizionare il mouse piatto sulla schiena nel dispositivo di imaging con il naso nel cono del naso e assicurarsi che 1.5-2.5% isoflurane viene somministrato. Posizionare i divisori tra ogni mouse se si rilevano più topi. Assicurarsi che i topi siano posizionati il più piatti possibile (cioè non appoggiati su un lato).
    7. Fare clic sulle caselle Luminescent e Photograph , quindi scegliere Acquisisci nel Pannello di controllo Acquisizione.
  6. Acquisire continuamente immagini bioluminescenti fino a raggiungere il segnale di picco e utilizzare l'immagine con il segnale bioluminescente di picco per l'analisi.
  7. Dopo l'imaging, riportare il mouse alla sua gabbia e monitorare per 15 minuti per garantire il pieno recupero.
  8. Immagine 2-3 volte settimanale per la durata dell'esperimento.

7. Quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi

NOTA: Il periodo di tempo in cui le metastasi possono crescere deve essere determinato per ogni linea cellulare e sforzo del topo e sarà influenzato dal numero di cellule iniettate.

  1. Eutanasia i topi secondo le linee guida istituzionali standard.
  2. Isolare e rimuovere i polmoni da ogni topo e risciacquare in 1x PBS per rimuovere il sangue in eccesso.
  3. Separare delicatamente i polmoni in lobi.
  4. Acquisire immagini di metastasi verdi nei lobi a 10volte in campo luminoso e fluorescenza utilizzando uno stereoscopio fluorescente con un filtro a banda larga GFP (eccitazione 470/40x).
    NOTA: mantenere lo stesso ingrandimento e la stessa luminosità per tutti i campioni. L'ingrandimento utilizzato può variare a seconda delle dimensioni, del numero e della luminosità delle metastasi, nonché del campo visivo per il microscopio utilizzato.
  5. Utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare le dimensioni e il numero di metastasi dalle immagini.
    NOTA: Il protocollo per l'analisi delle immagini dipende dal software e può essere ottimizzato con i tumori del passaggio 3. In alternativa, contare manualmente il numero di metastasi in ogni polmone utilizzando lo stereoscopio fluorescente. Protocollo può essere messo in pausa qui e il passaggio 8 può essere fatto in qualsiasi momento dopo che tutte le immagini in vivo sono state raccolte.

8. Elaborazione e analisi dei dati delle immagini acquisite con il dispositivo di imaging animale in vivo in vivo

  1. Aprire tutti i file di immagine per ogni mouse nel software di immagine.
    NOTA: Utilizzare l'immagine con il segnale bioluminescente di picco per l'analisi
  2. Assicurarsi che le unità siano in Radianza per i dati bioluminescenti e l'efficienza per i dati fluorescenti facendo clic sulla freccia in alto a sinistra della finestra dell'immagine e modificandola nell'unità appropriata.
  3. Utilizzare l'immagine dall'ultimo timepoint per creare un'area di interesse (ROI) come segue.
    1. Fare clic su Strumenti ROI nella finestra Tavolozza strumenti. Inserire un ROI facendo clic sulla freccia e selezionando 1.
    2. Fare clic sul bordo del ROI e spostarlo sul petto del mouse. Regolare la dimensione del ROI in modo che copra il torace del mouse e non escluda il segnale.
  4. Fare clic su ROI di misura e copiare o digitare il numero non elaborato in un foglio di Excel.
    NOTA: Per i dati bioluminescenti selezionare il flusso totale (fotoni/secondo), che è la somma di tutta la luminosità nel ROI. Poiché le metastasi non crescono necessariamente in modo uniforme, il flusso totale è preferito rispetto alla radioance media perché misura la somma dell'onere metastatico. Analogamente, per i dati fluorescenti, la percentuale di efficienza totale (luce di emissione (fotoni/secondo)/luce di eccitazione (fotoni/secondo)) deve essere utilizzata al posto dell'efficienza media.
  5. Fare clic con il pulsante destro del mouse nel file di immagine per copiare il ROI utilizzato nel passaggio 8.3 e incollarlo in ogni file di immagine.
    NOTA: quando si quantificano le immagini fluorescenti, quantificare la stessa regione su un mouse che è stato immagine senza metastasi. Utilizzare questo segnale come segnale di sfondo e sottrarlo da ogni immagine del mouse contenente metastasi fluorescenti acquisita.
  6. Spostare i ROI incollati sulla stessa area selezionata nel passaggio 8.3.4 per ogni immagine e ripetere il passaggio 8.4.
  7. Tracciare e analizzare i dati grezzi come segue (vedere la tabella supplementare 2).
    1. Eseguire una trasformazione del log10 dei dati non elaborati per ogni mouse utilizzando la formula indicata (Tabella supplementare 2) e tracciare come illustrato nella Figura 2D e Figura 4F. La trasformazione del log10 linearizza la curva di crescita che tende ad essere geometrica e riduce al minimo l'eteroscedasticità.
    2. Utilizzando la regressione lineare, calcolare la pendenza della linea adattata al log10 dati trasformati per ogni mouse tracciato nel passaggio 8.7.1 (Tabella supplementare 2). Fare riferimento alla formula nella Tabella supplementare 2 per adattarla alla linea e calcolare la pendenza in un unico passaggio.
    3. Tracciare i valori numerici delle pendenze come in Figura 2E e Figura 4G. Utilizzare un test t di Student o ANOVA unidirezionale (per più di 2 gruppi) sulle piste per determinare la significatività statistica.

Risultati

Per dimostrare l'approccio di cui sopra, abbiamo eseguito un esperimento proof of concept in cui un fattore di replica critico, RPA3 è stato abbattuto in una linea di cellule carcinoma di mammario topoto metastatico (4T122). Mentre il protocollo descrive l'etichettatura delle cellule con proteine luciferasi e fluorescenti prima della manipolazione genetica, abbiamo usato un approccio modificato perché i vettori RNAi forniscono anche il verde(Figura 2A

Discussione

Fasi critiche del metodo
È fondamentale ottimizzare il numero di cellule iniettate (passaggio 3) per una determinata linea cellulare e la deformazione del topo in quanto ciò può influenzare notevolmente il numero di metastasi che si formano e la lunghezza dell'esperimento. Se vengono iniettate troppe cellule o le metastasi crescono troppo a lungo, le metastasi possono essere difficili da contare rendendo gli effetti della manipolazione genetica difficili da valutare. Tuttavia, se vengono iniettate ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Emily Norton per aver assistito con le infezioni virali e la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche Ryan Kanai per l'aiuto nell'acquisizione di immagini dei polmoni e Kate E. Tubbesing per l'analisi delle immagini delle metastasi verdi nei polmoni. Ringraziamo il personale della struttura di ricerca sugli animali per il loro sostegno e per l'assistenza nella preparazione di questo video. Questo lavoro è stato supportato da un Susan G. Komen Career Catalyst Grant che ha assegnato a J.M.L. (#CCR17477184).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE GelFor western blot
2.5% TrypsinGibco15090-046Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipesFor sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)TaconicBALB-FFor tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regularVWR Ameresco97061-416For western blot
Cell lysis bufferCell SignalingFor collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μmCelltreat40-229749-CSFor filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamberFor euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kitPromegaE1960For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered salineHimediaTS1006For PBS
EDTAVWR97061-406Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US originVWR97068-085Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imagerFujifilmFor western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAbCell Signaling2118For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugateThermo Scientific31460For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FTInvitrogenR70007Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucoseGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure GradeVWR Ameresco97064-810For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
ImagejUsed for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF MembraneBiorad1620177For western blot
IsofluraneFor mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)PerkinElmerCLS136340For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)Leica MicrosystemsMicroscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-GlutamineGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000Life technologiesL3000008For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program)PerkinElmerSoftware for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ et al.,1992Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0FujifilmSoftware for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer)Gibco31985-062For packaging virus and transfection
Penicillin StreptomycinGibco15140-122Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kitThermo Scientific23225For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32957Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32953Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide)Sigma-Aldrich45-H9268For infection
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainerFor restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running bufferFor western blot
TAZ (V3886) AntibodyCell Signaling4883For western blot
TBST bufferFor western blot
TC20 automated cell counterBio-RadFor counting cells
VectorsSee Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence MicroscopeVWR89404-464For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer bufferFor western blot
XenoLight D-Luciferin K+ SaltPerkinElmer122799Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)Roche6365787001For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074For western blot

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