JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הגישה המתוארת משלבת הזנב הנסיוני גרורות מוסר עם הדמיה vivo live בעלי חיים כדי לאפשר ניטור בזמן אמת של גרורות סרטן השד היווצרות וצמיחה בנוסף לקוונפיקציה של מספר גרורות וגודל בריאות.

Abstract

גרורות הוא הגורם העיקרי של מקרי מוות הקשורים לסרטן, יש אפשרויות טיפוליות מוגבלות עבור חולים עם מחלה גרורתית. זיהוי ובדיקה של מטרות טיפוליות הרומן שיאפשרו פיתוח של טיפולים טובים יותר עבור מחלה גרורתית דורש פרה במודלים vivo. הפגינו כאן הוא מודל העכבר הסינגנטי עבור assaying סרטן השד מושבת גרורות והצמיחה הבאים. תאים סרטניים גרורות הם התמרה באופן בלתי נשכח עם נגיפי וקטורים קידוד גחלילית לוציפראז ו-ZsGreen חלבונים. המועמדים הגנים הם לאחר מכן מניפולציות באופן שולי ב לוציפראז/ZsGreen-ביטוי תאים סרטניים ולאחר מכן התאים מוזרק לתוך עכברים באמצעות וריד זנב לרוחב לתוך מושבת גרורתית וצמיחה. במכשיר הדמיה vivo משמש מכן כדי למדוד את הביולומינציה או הזריחה של תאי הגידול בבעלי חיים לכמת שינויים בנטל גרורתי לאורך זמן. הביטוי של חלבון פלורסנט מאפשר את מספר וגודל גרורות בריאות כדי להיות כמותית בסוף הניסוי ללא צורך במתן הסבר או כתמים היסטולוגית. גישה זו מציעה דרך מהירה וקלה יחסית כדי לבדוק את התפקיד של גנים המועמדים בקולוניזציה גרורתית וצמיחה, ומספק הרבה יותר מידע מאשר מסורתית הזנב גרורות גרואסאומר. באמצעות גישה זו, אנו מראים כי הסתרה בו זמנית של החלבון המשויך כן (לצ) ו הטרנססקריפט שיתוף activator עם מוטיב PDZ-מחייב (TAZ) בתאי סרטן השד מוביל נטל גרורתי מופחת בריאות וכי נטל זה מופחת הוא תוצאה של מושבת גרורתית באופן משמעותי וצמיחה מופחתת של גרורות.

Introduction

הסרטן נשאר הגורם המוביל השני של המוות ברחבי העולם1 גרורות הוא אחראי על רוב מקרי המוות האלה2,3. עם זאת, הבנה מוגבלת של המנגנונים המולקולריים השולטים בקולוניזציה גרורתית והצמיחה הבאה מעכבת את התפתחות הטיפולים האפקטיביים למחלות גרורתית. הזיהוי של מטרות טיפוליות הרומן דורש מבחן כדי לבחון עד כמה מודאג הביטוי או התפקוד של גן מועמד משפיע גרורות היווצרות וצמיחה. בעוד שלדגמי העכבר האוטומטיים יש את היתרונות שלהם, הם צורכים זמן ויקרים להפקת, מה שהופך אותם למתאימים יותר לאימות היעד ולא לגילוי המטרה. מערכות מודל להשתלות שבו הגן המועמד הוא מודאג בתאי הסרטן בתחום החוץ ולאחר מכן השפעות על פוטנציאל גרורתי מוערך ב vivo, הם פחות יקר והתפוקה גבוהה יותר מאשר מודלים autochthonous. בנוסף, וקטורים ויראליות עבור משלוח יציב של RNAi, CRISPR/CAS9, ו transgenes זמינים באופן נרחב, מה שהופך אותו קל יחסית לperturb כמעט כל גן או גנים של עניין קווי תאים סרטניים. גישה זו יכולה לשמש גם כדי לייחס את התפקיד של הגנים המועמדים בקולוניזציה גרורתית וצמיחה בתאי סרטן האנושי על ידי שתילת התאים לתוך מושפע חיסוני או עכברים הומניזציה.

שני סוגים של בחני המשמש לבדיקת גרורות על-ידי תאים סרטניים מושתלים ב vivo הם גרורה ספונטנית וגרורה ניסיוני. ב גרורות ספונטנית אומר4,5, התאים הסרטניים מוזרק לתוך עכברים, מותר ליצור גידול ראשוני, ולאחר מכן היווצרות גרורות ספונטנית הצמיחה הבאה הם החוצה. החוזק של המודל הזה הוא כי התאים חייבים להשלים את כל השלבים של תהליך גרורתי כדי ליצור גידולים גרורתי. עם זאת, הרבה קווי התאים של סרטן אינם גרורות ביעילות במודלים גרורות ספונטנית, וכל מניפולציה של התאים ההשפעות על גידול ראשוני הגידול יכול לבלבל את התוצאות של שיטת גרורות. גרורות ניסיוני, שבו תאים סרטניים מוזרק ישירות לתוך המחזור, משמשים כדי למנוע מלכודות אלה. גרורות נסיוניות נפוצות כוללות את הזרקת וריד הזנב6,7,8 (והפגינו כאן), הזרקת תאיים9, ו הזרקת וריד השער10.

מטרת הפרוטוקול המוצג כאן היא לספק vivo גרורות ניסיוני המאפשר חוקר לפקח גרורות היווצרות וצמיחה בזמן אמת, כמו גם לכמת את נקודת הסיום מספר וגודל בריאות של אותו עכבר. כדי להשיג את זה, הניסוי המסורתי וריד הזנב גרורות שאומר6,7,8 משולבים עם הדמיה חיה בעלי חיים, באמצעות מכשיר vivo הדמיה9,11,12,13,14. תאים סרטניים באופן בלתי נשכח הן לוציפראז ו חלבון פלורסנט מוזרק לתוך עכברים דרך הווריד זנב לרוחב ולאחר מכן במכשיר הדמיה vivo משמש למדוד שינויים נטל גרורתי בריאות לאורך זמן (איור 1). עם זאת, המכשיר vivo live הדמיה בעלי חיים לא יכול להבחין או למדוד את הגודל של גרורות בודדות. כך, בסוף הניסוי, stereomicroscope פלורסנט משמש כדי לספור את המספר ולמדוד את הגודל של גרורות פלורסנט בריאות ללא צורך בהענשת היסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה (איור 1). פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבדוק כיצד לשנות את הביטוי או הפונקציה של מועמד גן משפיע גרורות היווצרות וצמיחה. תרכובות טיפוליות פוטנציאליות כגון מולקולות קטנות או נוגדנים לחסימת פונקציות ניתן גם לבדוק.

כדי להדגים גישה זו, ביצעת תחילה הוכחה של ניסוי המושג שבו גורם שכפול חיוני, חלבון שכפול A3 (RPA3) הוא הופל בתאים גרורות בסרטן השד העכבר. אנו מראים כי עכברים שהוחדרו עם RPA3 למטה התאים יש נטל משמעותי פחות גרורתי בכל נקודת זמן לעומת עכברים שהוחדרו עם תאי בקרה. ניתוח של הריאות גרורות מכיל מראה כי זה נטל גרורתי מופחתת היא תוצאה של מושבת גרורתית משמעותית וצמיחה לקויה של גרורות כי הטופס. כדי להמחיש עוד טכניקה זו, בדקנו אם בו להפיל את החלבון המשויך כן (יאפ) ו transcript co-activator עם מוטיב מחייב PDZ (TAZ) פוגע מושבת גרורתית או הצמיחה הבאה. לאחר מכן ו TAZ הם שני הקשורים הטרנססקריפט שיתוף מפעילים כי הם המטה הקריטי של מסלול היפו. אנו15,16 ואחרים יש מעורבים לנבוח ו TAZ ב גרורות (נבדקו17,18,19), הרומז כי חלבונים אלה הם מטרות טיפוליות טוב. באופן עקבי, מצאנו כי עכברים מוזרק עם מיקוד למטה לתאי הנוק/טאז הופחת משמעותית נטל גרורתי. ניתוח של הריאות הראו כי מיקוד למטה את התאים של מלנוק/טאז יצרו הרבה פחות גרורות ושגרורות שעשו צורה היו קטנות יותר. ניסויים אלה מדגימים כיצד גרורות נסיוניות לאפשר לחוקר במהירות ובזול לבדוק את התפקיד של גן מועמד במערך גרורות וצמיחה. הם עוד מראים כיצד השימוש המשולב של הדמיה חיה בעלי חיים וקוונפיקציה פלורסנט של גרורות בריאות שלמות מאפשר לחוקר להבין טוב יותר את השלבים במהלך הקולוניזציה גרורתית.

Protocol

פרוטוקול זה כרוך בשימוש בעכברים ובחומרים ביו-מסוכנים ומחייב אישור מוועדות הבטיחות המוסדיים המתאימות. כל המתואר בעבודה vivo כאן הוא אישר על ידי מכללת אולבני המכללה הרפואית בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש (IACUC).

הערה: למבט כולל על פרוטוקול, ראה סכמטי באיור 1.

1. אריזת כל הווירוסים הנדרשים ווירוסים

הערה: הפרוטוקול המתואר משתמש בוקטורים מונגיפיים או בוויראליות לבטא אנזים לוציפראז וחלבון פלורסנט, כמו גם לתמרן את הביטוי של גן מועמד. וירוסים אלה ארוזים בתאי HEK-293FT כמתואר להלן.

  1. יום 1: צלחת HEK-293FT תאים על 6-צלחות היטב ב 2 מ ל של מדיה צמיחה מלאה (10% FBS ב DMEM זיכרון עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין) כך שהם 40-60% confluent ביום 2. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 לילה.
  2. יום 2: עבור כל וקטור ויראלי להיות ארוזים, transfect a 40-60% confluent היטב של HEK-293FT תאים עם וקטור retroviral יעיל או הווקטורים המתאימים קידוד המעיל הנגיפי אריזות חלבונים.
    הערה: פרוטוקול זה משתמש ב-VSVG כחלבון הפרווה, psPAX2 עבור אריזות מסיביות ויראליות, ומלא מחסום לאריזה רטרונגיפית (ראה טבלה משלימה 1 עבור רשימה וקטורית).
  3. הפוך תערובת משותפת לכל הטוב כדלקמן:
    1. לשלב 4 μL של פתרון השומנים עבור הטרנספיטים (ראה טבלת חומרים) ו-96 μl של מאגר הזיהום והדגירה עבור 5 דקות.
    2. הוסף 1 μg של וקטור ויראלי, 0.5 μg של חלבון מעיל וקטור (VSVG), ו 0.5 μg של אריזות חלבון וקטור (psPAX2 או מחסום-פול) ו דגירה עבור 20 דקות.
    3. להוסיף בעדינות את תערובת שיתוף החצייה משלב 1.3.2 לתאים HEK-293FT מצופה בשלב 1.1 ו-דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 לילה.
  4. יום 3: הסר את המדיה המכילה מדיה מתוך כל באר להוסיף בעדינות 2 מ ל של מדיית גדילה מלאה לכל טוב. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור כ 24 שעות.
  5. יום 4: לאסוף את supernatant ויראלי מכל טוב באמצעות מזרק 3 מ ל ולסנן דרך מסנן 0.45 יקרומטר לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 ml.
  6. אופציונלי: אם האוסף של אצווה שנייה של וירוס רצוי, להוסיף בעדינות 2 מ ל של מדיית צמיחה מלאה לכל טוב ומודב 37 ° c, 5% CO2 עבור כ 24 שעות.
  7. יום 5 (אופציונאלי): לאסוף סיבוב שני של סופר ויראלי כמו בשלב 1.5.
    הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה על ידי הקפאת הסופרנטאנט הנגיפי.

2. הדור של תאים סרטניים ביטוי לוציפראז וחלבון פלורסנט

הערה: הפרוטוקול הבא מתאר כיצד לתייג באופן ראשון תאים 4T1 בצורה בלתי ניתנת לשימוש עם גחלילית לוציו חלבון פלורסנט (ZsGreen) באמצעות שני וקטורים עם גנים בחירה ייחודית. ואז וקטורנגיפי 3 משמש כדי לתמרן את הביטוי של גן מועמד. עם זאת, וקטורים ויראליות אשר בו מספקים חלבון פלורסנט ומניפולציה גנטית יכול לשמש גם כחלופה (כמו בניסויים הנציג להלן). תאים סרטניים אחרים ניתן להשתמש, אבל מספרי התאים צריך להיות ממוטב עבור שלבים 2.1 ו 2.7.1.

  1. צלחת 4T1 תאים בשעה 1.5 x 105 תאים/גם בצלחת 12-היטב במדיה צמיחה מלאה (10% FBS ב dmem עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו 2 מ"מ L-גלוטמין) ו דגירה ב 37 ° צ', 5% CO2 לילה.
  2. להדביק את התאים 4T1 עם supernatant נגיפי שנוצר בשלב 1 כדלקמן.
    1. מוחלק את מדיית הגדילה מהתאים ומוסיפים 500 μl של ללוציפראז נגיפי supernatant ו 500 μl של חלבון פלורסנט ויראלי supernatant במקביל להדביק את התאים עם הלוציפראז וגם חלבון פלורסנט ויראלי סופר.
    2. הוסף 1 μL של 8 מ"ג/מ"ל הקסאדימין ברומיד (ראה טבלת חומרים).
    3. מודסות את התאים ב 37 ° c, 5% עד 75-90% confluent (בדרך כלל 24-48 שעות).
  3. טריזיסיזציה של תאים 4T1 עם 500 μL של טריפסין עבור 2-5 דקות (התאים צריכים לשטוף בחופשיות את החלק התחתון של הבאר). להעביר את כל התאים לצלחת 6 ס"מ ב 4 מ ל של מדיה בחירה (הצמיחה המלאה מדיה המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה) ובכך לאשר את הטריפסין. צלחת 6 ס מ של תאי שליטה לא נגועים באותו מדיה בחירה.
    הערה: ריכוז אנטיביוטי מתאים יש לקבוע מראש בזמן על ידי בדיקת מספר מינונים. בנוסף, מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית יכול לשמש גם כדי לבחור את התאים בעלי תוויות פלואורוסקופים במקום בחירת סמים.
  4. מודטת התאים ב 37 ° צ', 5% CO2 במדיה בחירה לפצל את התאים בעת הצורך עד כל תאי שליטה שאינם נגועים מתים (תלוי בגנים הבחירה קו התאים).
  5. ודא כי התאים 4T1 נגועים מבטאים את חלבון הפלורסנט ZsGreen באמצעות עירור ירוק (450-490 ננומטר)/פליטה (500-550 nm) מסנן להגדיר על מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה ב 50-100x הגדלה.
  6. ודא כי התאים 4T1 נגועים מבטאים לוציפראז באמצעות ערכת פעילות לוציפראז זמין מסחרית כדלקמן.
    1. השתמש בנפח מינימלי של מאגר לפירוק פסיבי 1x כדי lyse לוציפראז-ביטוי תאים 4T1 ובקרה 4T1 תאים שאינם מבטאים לוציפראז, רועד בעדינות עבור 30 דקות.
    2. הוסף 20 μl של תא לפני התחתית 96-באר לוחית ולאחר מכן 50 μl של שיטת ללוציפראז מגיב מערכת הפעילות לוציפראז.
    3. השתמש בקורא לוחית כדי למדוד את האור מן התאים בכל אורכי הגל בספקטרום באמצעות הסביבה הלומינסבית.
      הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה על-ידי הקפאת התאים שעברו התמרה באופן בלתי נשכח.
  7. לטפל בביטוי של הגן המועמד כדלקמן:
    1. צלחת 6 x 105 מתויג תאים 4T1 משלב 2.6 על הצלחת 60 מ"מ ב 4 מ ל של מדיה צמיחה מלאה דגירה ב 37 ° צ', 5% CO2 לילה.
    2. מנושף את מדיית הגדילה מכל באר ומוסיפה 2 מ ל של מדיית צמיחה מלאה המכילה 4 μL של 8 מ"ג/mL הקסאדימין ברומיד.
    3. הוסף 2 מ ל של supernatant ויראלי משלב 1 אל התאים מצופה משלב 2.7.2 ו דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 לילה.
    4. טריזיסיזציה של תאים 4T1 עם 500 μL של טריפסין עבור 2-5 דקות (התאים צריכים לשטוף בחופשיות את החלק התחתון של הבאר). העבר את כל התאים לצלחת 10 ס מ ב -10 מ ל של מדיית בחירה (מדיית צמיחה מלאה המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה) ובכך מועלת את הטריפסין. צלחת מסוימים שליטה לא נגועה בתווית תאים 4T1 באותו מדיה בחירה.
    5. מודטת התאים ב 37 ° צ', 5% CO2 במדיה בחירה לפצל את התאים בעת הצורך עד כל התאים שאינם נגועים מתים.
    6. ודא כי הביטוי של הגן המועמד משתנה באמצעות גישה סטנדרטית כגון כתמי מערבי20 או qpcr21.
    7. שיטת לומינציה וזריחה כמו בשלבים 2.5-2.6 כדי לקבוע כיצד הם דומים בשליטה ומנוק תאים, כמו זה יכול לשנות (ראה דיון).
      הערה: הפרוטוקול עשוי להיות מושהה על-ידי הקפאת התאים שעברו התמרה באופן בלתי נשכח.

3. אופטימיזציה של העיצוב vivo ניסיוני

  1. מטב את מספר התא המתאים ומשך הניסוי עבור הנטל הגרורתי הרצוי כדלקמן.
    1. הרחיבו את התאים הפלואורסצנטי ותאי 4T1 משלב 2.6 במדיית הצמיחה המלאה כך שתאים עודפים זמינים ביום הרצוי של ההזרקה.
    2. הכינו את התאים לזריקות וריד כמתואר בשלב 4.2. כדי לקבוע את מספר התאים האופטימלי לזריקות, השהה מחדש את התאים בריכוזים שונים במספר 100 μL של 1x PBS.
      הערה: אנו ממליצים לבדוק מגוון של מספרי תאים/עכבר מ 25,000 עד 500,000.
    3. השאר את השפני התאים. על הקרח עד הזריקה
    4. הכנס כל דילול של תאים 4T1 משלב 3.1.2 לתוך 3-4 עכברים דרך הווריד זנב לרוחב תיאר בשלב 4.3 (ראה להלן).
    5. החזר את העכבר לכלוב שלו ונטר במשך 15 דקות כדי להבטיח החלמה מלאה. עכברים יש לבדוק סימנים של כאב או מצוקה 3 x שבועי.
    6. עכבר הצג עבור גרורות היווצרות וצמיחה עבור 3-6 שבועות (קו תא ומתח העכבר תלוי) באמצעות vivo חי הדמיה בעלי חיים המכשיר (ראה שלבים 5 ו 6).
      1. המתת חסד 3-6 שבועות לאחר הזרקת וריד הזנב בהתאם להנחיות מוסדיים סטנדרטיים.
      2. הכינו את הריאות והערכת גרורות בגודל ובמספר המתואר בשלב 7.
      3. לבחור את אורך הזמן המתאים עבור גרורות לצמוח על הנטל הגרורתי הרצוי (ראה דיון).

4. הזרקת וריד זנב של תאים סרטניים המסומנים

הערה: שלב 4.2.4 ממוטב עבור תאים 4T1 הגדלים בעכברי באלבי/c syngeneic. אם קווי תאים אחרים של סרטן וזנים העכבר משמשים, מספר התאים הוזרק, ואת אורך השיטת צריך תחילה להיות ממוטבת.

  1. הרחיבו את קווי התא 4T1 שנוצרו בשלב 2 על 2 15 ס"מ מנות במדיית גדילה מלאה, כך שתאים עודפים זמינים ביום ההזרקה.
  2. הכן את התאים עבור הזרקת וריד הזנב כדלקמן:
    1. ולשטוף את לוחיות התאים. עם הערוץ הראשון
    2. טריזילזציה של התאים עם 5 מ ל של טריפסין לצלחת 15 ס מ עבור 2-5 דקות (תאים צריכים לשטוף בחופשיות את החלק התחתון של הבאר). העבר את כל התאים לשפופרת חרוט. לשטוף את התאים הנותרים מתוך התבשיל תרבות הרקמה עם מדיה צמיחה מלאה מספיק כדי להרוות את טריפסין ולהוסיף את השטיפה לצינור חרוט זהה.
    3. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את מספר התאים הכולל.
    4. צנטריפוגה את התאים ב 122 x g עבור 3 דקות, לנפח את הסופרנטאנט, ולהשעות מחדש את התאים ב-1X PBS בריכוז הרצוי. כאן, 2.5 x 104 תאים מוזרק לתוך כל עכבר 100 μl של PBS, כך את התאים להשעות מחדש ב 2.5 x 105 תאים/mL. השאר את השפני התאים. על הקרח עד הזריקה
      הערה: חשוב להגביל את כמות הזמן בין טריסיזציה של התאים לבין הזרקת הזנב בערך שעה אחת.
  3. הכנס תאים 4T1 משלב 4.2.5 לתוך עכברים דרך וריד הזנב לרוחב כדלקמן:
    1. עבודה בשכונה במתקן החי, בעדינות אבל לערבב ביסודיות את התאים על ידי היפוך הצינור או באמצעות מזרק 1 mL כדי לוודא שהם מושעה אחיד. ודא תמיד שהתאים מושעים מחדש לפני טעינת המזרק.
    2. טען 1 mL-מזרק מנעול עם ההשעיה התא ולגרש בועות אוויר עודפים. מקום של 1/2 אינץ ', 30-מד מחט על המזרק עם שיקוע למעלה ולגרש בועות אוויר.
    3. מניחים בעדינות את העכבר בתוך הרסן מכרסם.
    4. הורידים הצדדיים צריכים להיות גלויים ומורחבים. אם לא, לצבוט בעדינות את בסיס הזנב ולטבול את הזנב במי ברז חמים להתרחב ורידים.
      הערה: התרחבות הורידים עשויה להיות מושגת גם על ידי הצבת כלוב העכבר תחת מנורת חימום ו/או על גבי כרית חימום.
    5. השתמש במחיקה של אלכוהול כדי לנקות את הזנב. הכנס את המחט לתוך הווריד הזנב, צד משופע למעלה, ולהזריק 100 μL של השעיית תא.
      הערה: אם המחט מוכנס כראוי לתוך הווריד, זה צריך בקלות להחליק מעט קדימה ואחורה, ולא צריך להיות התנגדות כאשר הבוכנה נלחץ. זריקות מוצלחות צריך גם לגרום "סומק" שבו הצבע הכחול של הווריד הופך לבן במשך כמה שניות לאחר הזריקה.
  4. לאט להסיר את המחט באמצעות גזה סטרילי, להחיל לחץ על האתר ההזרקה כדי לעצור דימום.
  5. החזר את העכבר לכלוב שלו ונטר במשך 15 דקות כדי להבטיח החלמה מלאה. עכברים יש לבדוק סימנים של כאב או מצוקה 3 x שבועי.
  6. עכבר הצג עבור גרורות היווצרות וצמיחה עבור 3-6 שבועות (קו תא ומתח העכבר תלוי) באמצעות vivo חי הדמיה בעלי חיים המכשיר (ראה שלבים 5 ו 6).

5. ניטור הנטל גרורתי על ידי קרינה פלואורסצנטית עם vivo חי הדמיה חיה המכשיר

הערה: אל תמונה של בעל חיים עבור זריחה עם איתות פעיל זורח.

  1. אם רק הדמיה ביולומינסנציה, דלג לשלב 6.
  2. הפעל את המכשיר בvivo חיים הדמיה חיה.
  3. הגדר את מערכת vivo live הרדמה בעלי חיים על פי הנחיות היצרן לספק בין 1.5% ו 2% isof, לחדר ההרדמה ולחדר ההדמיה.
  4. העכברים מורדם בעזרת פלואורוסקופים שכותרתו גרורות משלב 4 על ידי הצבת אותם בחדר הרדמה ואספקת 1.5-2.5% isofלאנה.
  5. פתח את תוכנת התמונה (ראה טבלת חומרים) וכניסה.
  6. לחץ על לחצן אתחול והמתן לאתחול המחשב.
  7. שנה את שדה התצוגה ל -D.
    הערה: שדה של View C יכול לשמש גם אם יש צורך בתצוגה מקרוב של עכבר, אך פעולה זו מגבילה את מספר העכברים שניתן להציג בו.
  8. לאחר שהתוכנה ציינה שהמצלמה הגיעה לטמפרטורה המתאימה, לחץ על לחצן אשף ההדמיה , בחר באפשרות ' קרינה פלואורסצנטית ' ולאחר מכן בחר את זוג המסננים המתאים מהתפריט הנפתח.
    הערה: אם השימוש fluorophore הוא לא אופציה, לבחור קלט EX/EM ו סוג עירור ופליטה נדרש.
  9. מניחים את העכבר בתא כמתואר בשלב 3.2.4.
  10. לחץ על רכישת רצף.
  11. לאחר הדמיה, להחזיר את העכבר לכלוב שלו ולנטר במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה.
  12. חזור על שלב 5.2 ושלבים 5.7-5.9 עם עכבר אחד לפחות שאינו מכיל גרורות. הערה: עכבר זה ישמש לכמת ולהחסיר אות הרקע במהלך ניתוח (שלב 8).
  13. תמונה 2-3 פעמים בשבוע למשך הניסוי.

6. ניטור הנטל הגרורתי על ידי ביולומינסנציה עם מכשיר הדמיה בעלי חיים vivo חיים

  1. הפעל את המכשיר vivo live הדמיה בעלי חיים ולהגדיר את התוכנית כדלקמן.
    1. פתח את תוכנת התמונה (ראה טבלת חומרים) וכניסה. לחץ על לחצן אתחול והמתן לאתחול המחשב. שנה את שדה התצוגה ל -D.
      הערה: שדה של View C ניתן להשתמש לתצוגה מקרוב לתמונה גוף העכבר המלא; עם זאת, פעולה זו מגבילה את מספר העכברים שניתן לתמונה בו.
    2. לשימוש בפעם הראשונה, ערוך הגדרות חשיפה כדלקמן: לחץ על עריכה | העדפות | רכישה | חשיפה אוטומטית ולשנות את זמן החשיפה המקסימלי מתוך ברירת המחדל 60 שניות ל 300 שניות ולחץ על OK.
      הערה: אל תשנה פרמטרים אחרים בכרטיסיה חשיפה אוטומטית.
  2. הגדרת מערכת ההרדמה על פי הנחיות היצרן כדי לספק בין 1.5% ו 2% isofלפני חדר ההרדמה ואת חדר ההדמיה.
  3. ודא שהמצלמה הגיעה לטמפרטורה המתאימה לפני שתמשיך בשלב 6.4.
  4. גרופי גרורות-המכילות עכברים משלב 4 על-ידי הצבת אותם בחדר הרדמה ואספקת 1.5-2.5% isofלאנה.
  5. הכינו עכברים לדימות ביולומינסנציה כדלקמן.
    1. טען a 1 מזרק mL עם D-לluciferin (30 מ"ג/mL ב D-PBS) ולאחר מכן להוסיף 1/2 אינץ ' 30-מד מחט למזרק ולגרש בועות אוויר.
    2. למדוד ולהקליט את המסה של העכבר מורדם.
    3. רסן את העכבר על ידי צובט את העורף של הצוואר שלהם באמצעות האגודל ואת האצבעות המצביע ואוחז את הזנב בין אצבע הזרת לבין בסיס היד. היפוך העכבר בזווית 45 מעלות, כאשר ראשו מופנה כלפי מטה.
    4. הכנס את המחט, הצד המשופעת כלפי מעלה, לחלל השמאלי של העכבר בתוך הצפק (IP). אשר כניסה למרחב ה-IP על-ידי ציור בחזרה של אמצעי אחסון קטן. לא צריך להיות צבע בבסיס של המחט כאשר הציור חזרה במרחב ה-IP.
    5. הכנס את הנפח המתאים של D-לluciferin עבור מנה של 150 מ"ג/ק"ג.
    6. מיד לאחר הממשל D-לluciferin, להתחיל טיימר ולמקם את העכבר שטוח על גבו במכשיר הדמיה עם אפו בקונוס האף ולהבטיח כי 1.5-2.5% isofלהיות מנוהל. הציבו חוצצים בין כל עכבר אם הדמיה של עכברים מרובים. ודא שעכברים ממוקמים בשטח שטוח ככל האפשר (כלומר לא נוטה לצד אחד).
    7. לחץ על תיבות מאיר וצילום ולאחר מכן לחץ על לרכוש בלוח הבקרה של הרכישה.
  6. לרכוש ברציפות תמונות ביולומינטיות עד שאות השיא מושגת ולהשתמש בתמונה עם האות הביולולומיאלי לניתוח.
  7. לאחר הדמיה, להחזיר את העכבר לכלוב שלו ולנטר במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה.
  8. תמונה 2-3 פעמים בשבוע למשך הניסוי.

7. קוונפיקציה של מספר וגודל של גרורות

הערה: משך הזמן שגרורות מורשות לגדול צריך להיקבע עבור כל קו תא ומתח העכבר, והוא יושפעו ממספר התאים שהוזרקו.

  1. המתת חסד העכברים לפי הנחיות מוסדיים סטנדרטיים.
  2. לבודד ולהסיר את הריאות מכל עכבר ולשטוף ב-1x PBS כדי להסיר עודף דם.
  3. הפרד בעדינות את הריאות לאונות.
  4. לרכוש תמונות של גרורות ZsGreen באונות ב 10x בשדה בהיר וקרינה פלואורסצנטית באמצעות פלורסנט סטריאוסקופ עם מסנן הלהקה GFP (עירור 470/40x).
    הערה: שמור על אותה הגדלה ובהירות עבור כל הדגימות. ההגדלה הנמצאת בשימוש עשוי להשתנות בהתאם לגודל, למספר ולבהירות של גרורות, כמו גם לשדה התצוגה המשמש למיקרוסקופ.
  5. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לכמת את הגודל והמספר של גרורות מן התמונות.
    הערה: הפרוטוקול לניתוח תמונה הוא תלוי תוכנה והוא יכול להיות ממוטב עם גידולים מ step3. לחלופין, לספור את מספר גרורות בכל ריאה באופן ידני באמצעות הפלורסנט סטריאוסקופ. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ולשלב 8 ניתן לבצע בכל נקודה לאחר שנאספו כל התמונות הvivo.

8. עיבוד וניתוח נתונים מתוך התמונות שנרכשו באמצעות התקן הדמיה בעלי חיים vivo חיים

  1. פתח את כל קבצי התמונה עבור כל עכבר בתוכנת התמונה.
    הערה: השתמש בתמונה עם אות הביולומילוסמלי לניתוח
  2. ודא כי היחידות הן בזוהר עבור נתונים ביולואולונטי ויעילות עבור נתוני פלורסנט על-ידי לחיצה על החץ בקצה השמאלי העליון של חלון התמונה ושינויו ליחידה המתאימה.
  3. השתמש בתמונה מנקודת הזמן האחרונה כדי ליצור אזור מעניין (ROI) כדלקמן.
    1. לחץ על רועי כלים בחלון לוח הכלים . הוסף ROI אחד על-ידי לחיצה על החץ ובחירה באפשרות 1.
    2. לחץ על הגבול של ROI ולהעביר אותו על החזה של העכבר. להתאים את גודל ה-ROI כך שהוא מכסה את החזה של העכבר אינו מוצא את האות.
  4. לחץ על מדידה של ROIs והעתק או הקלד את המספר הגולמי בגיליון של excel.
    הערה: עבור נתונים ביולומסתיים בחר את השטף הכולל (פוטונים/שנייה), שהוא סכום של כל הזוהר ב-ROI. מאז גרורות לא בהכרח לצמוח אחיד, שטף הכולל מועדף על הזוהר הממוצע כי זה מודד את הסכום של הנטל גרורתי. באופן דומה, עבור נתוני פלורסנט, היעילות הכוללת% (פליטת האור (בפוטונים/שנייה)/באור הריגוש (פוטונים/שנייה)) יש להשתמש במקום יעילות ממוצעת.
  5. קליק ימני בקובץ התמונה כדי להעתיק את ROI בשימוש בשלב 8.3 ולהדביק אותו לכל קובץ תמונה.
    הערה: כאשר מכמת תמונות פלורסנט, לכמת את אותו אזור על העכבר שהיה בתמונה ללא גרורות. השתמש באות זה כאות הרקע והפחת אותו מכל גרורות פלורסנט המכילות תמונת עכבר שנרכשה.
  6. הזזת ROIs מודבק מעל אותו אזור שנבחר בשלב 8.3.4 עבור כל תמונה וחזור על שלב 8.4.
  7. התווה ונתח את הנתונים הגולמיים כדלקמן (ראה טבלה משלימה 2).
    1. בצע יומן רישום10 המרה של הנתונים הגולמיים עבור כל עכבר באמצעות הנוסחה המצוינת (טבלה משלימה 2) והתוויה כמו באיור 2D ואיור 4F. יומן הרישום10 שינוי הטרנספורמציה של עקומת הצמיחה אשר נוטה להיות גיאומטרי וממזער הטרוסטיות.
    2. באמצעות רגרסיה ליניארית, חשב את השיפוע של הקו המצויד ליומן הרישום10 נתונים שעברו שינוי עבור כל עכבר המותוות בשלב 8.7.1 (טבלה משלימה 2). עיין בנוסחה בטבלה משלימה 2 כדי להתאים לשורה ולחשב את השיפוע בשלב אחד.
    3. מתווה את הערכים המספריים של המדרונות כמו באיור 2E ואיור 4G. השתמש ב-מבחן t או בכיוון אחד של הסטודנט (עבור יותר מ -2 קבוצות) על המדרונות כדי לקבוע משמעות סטטיסטית.

תוצאות

כדי להדגים את הגישה הנ ל, ביצעת הוכחת הרעיון של ניסוי שבו גורם שכפול קריטי, RPA3 הופל בתוך מיכל של קרצינומה של הפטמות של העכבר גרורות (4T122). בעוד הפרוטוקול מתאר תיוג התאים עם לוציפראז וחלבונים פלורסנט לפני מניפולציה גנטית, השתמשנו בגישה שונה כי וקטורים RNAi גם לספק ZsGreen (א...

Discussion

צעדים קריטיים של השיטה
זה קריטי כדי לייעל את מספר התאים המוזרקים (שלב 3) עבור קו תא נתון ומתח העכבר כמו זה יכול להשפיע מאוד על מספר גרורות כי הטופס ואת אורך הניסוי. אם תאים רבים מדי מוזרק או לגדול גרורות במשך זמן רב מדי, גרורות עשוי להיות קשה לספור עושה את ההשפעות של מניפולציה גנטית...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מודים אמילי נורטון על סיוע עם זיהומים ויראלי קריאה ביקורתית של כתב היד. אנחנו גם מודים לריאן Kanai לעזרה עם רכישת תמונות של הריאות וקייט E. טאבבסינג לעזרה עם ניתוח תמונה של גרורות ירוקות בריאות. אנו מודים לצוות המחקר של בעלי החיים על תמיכתם וסיוע בהכנת וידאו זה. עבודה זו נתמכת על ידי הגרנט סוזן ג ' Komen הקריירה המענק הוענק J.M.L. (#CCR17477184).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE GelFor western blot
2.5% TrypsinGibco15090-046Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipesFor sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)TaconicBALB-FFor tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regularVWR Ameresco97061-416For western blot
Cell lysis bufferCell SignalingFor collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μmCelltreat40-229749-CSFor filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamberFor euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kitPromegaE1960For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered salineHimediaTS1006For PBS
EDTAVWR97061-406Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US originVWR97068-085Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imagerFujifilmFor western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAbCell Signaling2118For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugateThermo Scientific31460For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FTInvitrogenR70007Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucoseGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure GradeVWR Ameresco97064-810For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
ImagejUsed for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF MembraneBiorad1620177For western blot
IsofluraneFor mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)PerkinElmerCLS136340For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)Leica MicrosystemsMicroscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-GlutamineGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000Life technologiesL3000008For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program)PerkinElmerSoftware for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ et al.,1992Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0FujifilmSoftware for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer)Gibco31985-062For packaging virus and transfection
Penicillin StreptomycinGibco15140-122Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kitThermo Scientific23225For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32957Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32953Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide)Sigma-Aldrich45-H9268For infection
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainerFor restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running bufferFor western blot
TAZ (V3886) AntibodyCell Signaling4883For western blot
TBST bufferFor western blot
TC20 automated cell counterBio-RadFor counting cells
VectorsSee Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence MicroscopeVWR89404-464For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer bufferFor western blot
XenoLight D-Luciferin K+ SaltPerkinElmer122799Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)Roche6365787001For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074For western blot

References

  1. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  2. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  3. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  4. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  5. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  6. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  7. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  8. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  9. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  10. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  11. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  12. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  13. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  16. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  17. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  18. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  19. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  20. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  21. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  22. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  23. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122 (2012).
  24. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119 (2015).
  25. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  26. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529 (2011).
  27. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  28. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  29. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  30. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  31. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  32. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  33. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647 (2016).
  34. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, 1523-1536 (2014).
  35. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  36. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  37. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  38. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  39. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  40. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 1744-1753 (2018).
  41. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  42. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  43. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  44. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  45. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  46. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  47. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  48. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310 (2017).
  49. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  50. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  51. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122 (2017).
  52. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  53. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, 217-225 (2005).
  54. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  55. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  56. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1544T1syngeneicTAZ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved