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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der beschriebene Ansatz kombiniert experimentelle Schwanzvenenmetastasierungs-Assays mit in vivo Live-Tier-Imaging, um neben der Quantifizierung der Metastasenzahl und -größe in der Lunge auch die Echtzeit-Überwachung der Bildung und des Wachstums von Brustkrebsmetastasen zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Metastasen sind die Hauptursache für krebsbedingte Todesfälle und es gibt nur begrenzte therapeutische Möglichkeiten für Patienten mit metastasierenden Erkrankungen. Die Identifizierung und Erprobung neuartiger therapeutischer Ziele, die die Entwicklung besserer Behandlungen für metastasierende Erkrankungen erleichtern, erfordert präklinische In-vivo-Modelle. Gezeigt wird hier ein syngenes Mausmodell zur Assaying-Metatonisierung von Brustkrebs und anschließendem Wachstum. Metastasierende Krebszellen werden stabil mit viralen Vektoren transduziert, die Glögfeuer-Luziferase und ZsGreen-Proteine kodieren. Kandidatengene werden dann in luziferase/ZsGrün-exezierenden Krebszellen stabil manipuliert und dann werden die Zellen über die laterale Schwanzvene in Mäuse injiziert, um metastasierende Besiedlung und Wachstum zu assay. Ein In-vivo-Bildgebungsgerät wird dann verwendet, um die Biolumineszenz oder Fluoreszenz der Tumorzellen bei den lebenden Tieren zu messen, um Veränderungen der metastasierenden Belastung im Laufe der Zeit zu quantifizieren. Die Expression des fluoreszierenden Proteins ermöglicht es, die Anzahl und Größe der Metastasen in der Lunge am Ende des Experiments zu quantifizieren, ohne dass eine Schnitt- oder histologische Färbung erforderlich ist. Dieser Ansatz bietet eine relativ schnelle und einfache Möglichkeit, die Rolle von Kandidatengenen bei der metastasierenden Kolonisation und dem Wachstum zu testen, und bietet viel mehr Informationen als herkömmliche Schwanzvenenmetastasasasen. Mit diesem Ansatz zeigen wir, dass der gleichzeitige Knockdown von Yes assoziiertem Protein (YAP) und Transkriptions-Co-Aktivator mit einem PDZ-bindenden Motiv (TAZ) in Brustkrebszellen zu einer reduzierten metastasierenden Belastung in der Lunge führt und dass diese reduzierte Belastung das Ergebnis einer signifikant beeinträchtigten metastasierenden Kolonisation und eines reduzierten Wachstums von Metastasen ist.

Einleitung

Krebs bleibt die zweithäufigste Todesursache weltweit1 und Metastasen sind für die Mehrheit dieser Todesfälle verantwortlich2,3. Ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die die metastasierende Kolonisation und das anschließende Wachstum steuern, hat jedoch die Entwicklung wirksamer Behandlungen für metastasierende Krankheiten behindert. Die Identifizierung neuartiger therapeutischer Ziele erfordert einen Test, um zu testen, wie gestörte Expression oder Funktion eines Kandidatengens die Metastasenbildung und das Wachstum beeinflusst. Autochthone Mausmodelle haben zwar ihre Vorteile, sind aber zeitaufwändig und teuer zu generieren, wodurch sie besser für die Zielvalidierung als für die Zielermittlung geeignet sind. Transplantationsmodellsysteme, bei denen das Kandidatengen in vitro in Krebszellen gestört wird und dann Die Auswirkungen auf das metastasierende Potenzial in vivo bewertet werden, sind kostengünstiger und höherer Durchsatz als autochthone Modelle. Darüber hinaus sind virale Vektoren für die stabile Lieferung von RNAi, CRISPR/CAS9 und Transgenen weit verbreitet, was es relativ einfach macht, praktisch jedes Gen oder Gene zu stören, die an einer Krebszelllinie interessiert sind. Dieser Ansatz kann auch verwendet werden, um die Rolle von Kandidatengenen bei der metastasierenden Besiedlung und dem Wachstum menschlicher Krebszelllinien zu untersuchen, indem die Zellen in immungeschwächte oder humanisierte Mäuse transplantiert werden.

Die beiden Arten von Assays, die verwendet werden, um die Metastasenbildung durch transplantierte Krebszellen in vivo zu testen, sind spontane Metastasen-Assays und experimentelle Metastasen-Assays. In spontanen Metastasen-Assays4,5werden Krebszellen in Mäuse injiziert, erlaubt, einen Primärtumor zu bilden, und dann werden spontane Metastasenbildung und anschließendes Wachstum untersucht. Die Stärke dieses Modells besteht darin, dass die Zellen alle Schritte des metastasierenden Prozesses ausführen müssen, um metastasierende Tumoren zu bilden. Jedoch, viele Krebszelllinien nicht effizient in spontanen Metastasen-Modelle metastasieren, und jede Manipulation der Zellen, die primäre Tumorwachstum beeinflusst, kann die Ergebnisse der Metastasierung Assay verwirren. Experimentelle Metastasen-Assays, bei denen Krebszellen direkt in den Kreislauf injiziert werden, werden verwendet, um diese Fallstricke zu vermeiden. Häufige experimentelle Metastasen-Assays sind die Schwanzveneninjektion6,7,8 (und hier gezeigt), intrakardiale Injektion9und Portalveneninjektion10.

Der Zweck des hier vorgestellten Protokolls ist es, einen in vivo experimentellen Metastasen-Assay bereitzustellen, der es einem Forscher ermöglicht, die Metastasenbildung und das Wachstum in Echtzeit zu überwachen, sowie die Anzahl und Größe von Endpunktmetastasen in der Lunge derselben Maus zu quantifizieren. Um dies zu erreichen, werden traditionelle experimentelle Schwanzvenenmetastasen6,7,8 mit Live-Tierbildgebung kombiniert, mit einem in vivo Bildgebungsgerät9,11,12,13,14. Tumorzellen, die sowohl Luziferase als auch ein fluoreszierendes Protein stabil exezieren, werden über die laterale Schwanzvene in Mäuse injiziert und dann wird das in vivo Bildgebungsgerät verwendet, um Veränderungen der metastasierenden Belastung in der Lunge im Laufe der Zeit zu messen (Abbildung 1). Das in vivo Live-Tierbildbildgerät kann jedoch die Größe einzelner Metastasen nicht unterscheiden oder messen. So wird am Ende des Experiments ein fluoreszierendes Stereomikroskop verwendet, um die Anzahl zu zählen und die Größe der fluoreszierenden Metastasen in der Lunge zu messen, ohne dass Schnittund und Histologie oder Immunhistochemie erforderlich sind (Abbildung 1). Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zu testen, wie die Veränderung der Expression oder Funktion eines Kandidatengens die Metastasenbildung und das Wachstum beeinflusst. Mögliche therapeutische Verbindungen wie kleine Moleküle oder funktionsblockierende Antikörper können ebenfalls getestet werden.

Um diesen Ansatz zu demonstrieren, führten wir zunächst ein Proof-of-Concept-Experiment durch, bei dem der wesentliche Replikationsfaktor, das Replikationsprotein A3 (RPA3), in metastasierenden Maus-Brustkrebszellen niedergeschlagen wird. Wir zeigen, dass Mäuse, die mit RPA3-Knockdown-Zellen injiziert werden, zu jedem Zeitpunkt eine signifikant geringere metastasierende Belastung aufweisen als Mäuse, die mit Kontrollzellen injiziert werden. Die Analyse der metastasierenden Lunge zeigt, dass diese reduzierte metastasierende Belastung das Ergebnis einer signifikant reduzierten metastasierenden Kolonisation und eines beeinträchtigten Wachstums der metastasierenden Metastasen ist. Um diese Technik weiter zu demonstrieren, haben wir getestet, ob der gleichzeitige Abschlag von Yes-assoziiertem Protein (YAP) und Transkriptions-Co-Aktivator mit einem PDZ-bindenden Motiv (TAZ) die metastasierende Kolonisation oder das nachfolgende Wachstum beeinträchtigt. YAP und TAZ sind zwei verwandte Transkriptions-Coaktivatoren, die die kritischen downstream-Effektoren des Hippo-Pfads sind. Wir15,16 und andere haben YAP und TAZ in Metastasen verwickelt (rezensiert in17,18,19), was darauf hindeutet, dass diese Proteine gute therapeutische Ziele sind. Konsequenterweise fanden wir heraus, dass Mäuse, die mit YAP/TAZ-Knockdown-Zellen injiziert wurden, die metastasierende Belastung signifikant reduziert hatten. Die Analyse der Lunge zeigte, dass die YAP/TAZ-Knockdown-Zellen viel weniger Metastasen bildeten und dass die Metastasen, die sich bildeten, kleiner waren. Diese Experimente zeigen, wie experimentelle Metastasen-Assays es einem Forscher ermöglichen, schnell und kostengünstig die Rolle eines Kandidatengens bei der Metastasenbildung und dem Wachstum zu testen. Sie zeigen ferner, wie der kombinierte Einsatz von Live-Tierbildgebung und fluoreszierender Quantifizierung von Metastasen in ganzen Lungen es dem Forscher ermöglicht, die Schritte während der metastasierenden Besiedlung besser zu verstehen.

Protokoll

Dieses Protokoll umfasst die Verwendung von Mäusen und biogefährlichen Stoffen und bedarf der Zustimmung der zuständigen institutionellen Sicherheitsausschüsse. Alle hier beschriebenen In-vivo-Arbeiten werden vom institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss des Albany Medical College (IACUC) genehmigt.

HINWEIS: Eine Protokollübersicht finden Sie im Schaltplan in Abbildung 1.

1. Verpackung aller erforderlichen Retroviren und Lentiviren

HINWEIS: Das beschriebene Protokoll verwendet lentivirale oder retrovirale Vektoren, um ein Luziferase-Enzym und fluoreszierendes Protein stabil auszudrücken und die Expression eines Kandidatengens zu manipulieren. Diese Viren werden wie unten beschrieben in HEK-293FT-Zellen verpackt.

  1. Tag 1: Platte HEK-293FT-Zellen auf 6-Well-Platten in 2 ml komplettem Wachstumsmedium (10% FBS in DMEM mit 1% Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin), so dass sie am 2. Tag 40-60% konfluent sind. Bei 37 °C inkubieren, 5%CO2 über Nacht.
  2. Tag 2: Für jeden zu verpackenden viralen Vektor einen 40-60% Konfluentbrunnen der HEK-293FT-Zellen mit dem retroviralen oder lentiviralen Vektor und den entsprechenden Vektoren, die die viralen Mantel- und Verpackungsproteine kodieren, transfezieren.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet VSVG als Deckprotein, psPAX2 für lentivirale Verpackungen und Knebelpol für retrovirale Verpackungen (siehe Ergänzende Tabelle 1 für Vektorliste).
  3. Machen Sie eine Co-Transfektion-Mischung für jeden Brunnen wie folgt:
    1. Kombinieren Sie 4 l Lipidlösung für Transfektionen (siehe Materialtabelle)und 96 l Transfektionspuffer und inkubieren Sie 5 Minuten lang.
    2. Fügen Sie 1 g viralen Vektor, 0,5 g Mantelproteinvektor (VSVG) und 0,5 g Verpackungsproteinvektor (psPAX2 oder Gag-pol) hinzu und brüten 20 Minuten lang.
    3. Fügen Sie die Co-Transfektionsmischung aus Schritt 1.3.2 vorsichtig zu den HEK-293FT-Zellen hinzu, die in Schritt 1.1 plattiert sind, und brüten Sie bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht.
  4. Tag 3: Entfernen Sie die transfetionshaltigen Medien aus jedem Brunnen und fügen Sie vorsichtig 2 ml komplette Wachstumsmedien zu jedem Brunnen hinzu. Bei 37 °C inkubieren, 5% CO2 für ca. 24 Stunden.
  5. Tag 4: Sammeln Sie den viralen Überstand von jedem Brunnen mit einer 3 ml Spritze und filtern Sie durch einen 0,45 m Filter in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr.
  6. Optional: Wenn die Sammlung einer zweiten Viruscharge gewünscht wird, fügen Sie vorsichtig 2 ml komplette Wachstumsmedien zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C, 5%CO2 für ca. 24 Stunden.
  7. Tag 5 (Optional): Sammeln Sie eine zweite Runde viralen Überstandwies wie in Schritt 1.5.
    HINWEIS: Das Protokoll kann durch Einfrieren des viralen Überstandes angehalten werden.

2. Erzeugung von Krebszellen, die eine luziferase und ein fluoreszierendes Protein stabil ausdrücken

HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt, wie man zuerst 4T1-Zellen mit Galleifeferase und einem fluoreszierenden Protein (ZsGreen) mit zwei Vektoren mit einzigartigen Selektionsgenen stabil kennzeichnen kann. Dann wird ein3. viraler Vektor verwendet, um die Expression eines Kandidatengens zu manipulieren. Aber auch virale Vektoren, die gleichzeitig ein fluoreszierendes Protein und eine genetische Manipulation liefern, können als Alternative eingesetzt werden (wie in den repräsentativen Experimenten unten). Andere Krebszellen können verwendet werden, aber die Zellzahlen sollten für die Schritte 2.1 und 2.7.1 optimiert werden.

  1. Platte 4T1-Zellen bei 1,5 x 105 Zellen/Gut in einer 12-Well-Platte in kompletten Wachstumsmedien (10% FBS in DMEM mit 1% Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) und bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht inkubieren.
  2. Infizieren Sie die 4T1-Zellen mit dem viralen Überstand, der in Schritt 1 wie folgt erzeugt wird.
    1. Saugen Sie die Wachstumsmedien aus den Zellen und fügen Sie 500 L luziferase viralen Überstand und 500 l fluoreszierendes Protein viralen Überstand hinzu, um die Zellen gleichzeitig mit der Luziferase und fluoreszierenden Protein viralen Übertreibungen zu infizieren.
    2. Fügen Sie 1 l von 8 mg/ml Hexadimethrinbromid hinzu (siehe Materialtabelle).
    3. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5% bis 75-90% konfluent (in der Regel 24-48 Stunden).
  3. Trypsinisieren Sie die 4T1-Zellen mit 500 l Trypsin für 2-5 Minuten (Zellen sollten frei von der Unterseite des Brunnens abspülen). Übertragen Sie alle Zellen auf eine 6 cm Schale in 4 ml Selektionsmedien (komplette Wachstumsmedien, die die entsprechenden Antibiotika enthalten) und löschen Sie so das Trypsin. Platte eine 6 cm Schale von nicht infizierten Kontrollzellen in den gleichen Selektionsmedien.
    HINWEIS: Eine angemessene Antibiotikakonzentration sollte im Voraus durch Tests mehrerer Dosen bestimmt werden. Zusätzlich kann die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung auch verwendet werden, um die fluoreszierend markierten Zellen anstelle der Arzneimittelauswahl auszuwählen.
  4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2 in Selektionsmedien und spalten Sie die Zellen bei Bedarf, bis alle nicht infizierten Kontrollzellen tot sind (abhängig vom Selektionsgen und der Zelllinie).
  5. Bestätigen Sie, dass die infizierten 4T1-Zellen das ZsGreen-Fluoreszenzprotein mit einem grünen Anregungsfilter (450-490 nm)/Emission (500-550 nm) auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 50-100-facher Vergrößerung ausdrücken.
  6. Bestätigen Sie, dass die infizierten 4T1-Zellen Luziferase mit einem kommerziell erhältlichen Luciferase-Aktivitätskit wie folgt exexzieren.
    1. Verwenden Sie ein minimales Volumen von 1x passivem Lysepuffer, um luziferase-exprimierende 4T1-Zellen zu lyseundisieren und 4T1-Zellen zu steuern, die keine Luziferase ausdrücken und 30 Minuten lang sanft schütteln.
    2. Fügen Sie 20 L Zelllysat zu einer weißen 96-Well-Platte und dann 50 l des Luziferase-Assay-Reagenz aus dem Luciferase-Aktivitätskit hinzu.
    3. Verwenden Sie einen Plattenleser, um die Lumineszenz der Zellen bei allen Wellenlängen im Spektrum mithilfe der Lumineszenzeinstellung zu messen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann angehalten werden, indem die stabil endenden Zellen eingefroren werden.
  7. Manipulieren Sie die Expression des Kandidatengens wie folgt:
    1. Platte 6 x 105 beschriftet 4T1-Zellen ab Schritt 2,6 auf einer 60-mm-Schale in 4 ml komplettem Wachstumsmedium und bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht inkubieren.
    2. Saugen Sie die Wachstumsmedien aus jedem Brunnen und fügen Sie 2 ml vollständige Wachstumsmedien hinzu, die 4 l mit 8 mg/ml Hexadimethrinbromid enthalten.
    3. Fügen Sie 2 ml viralen Überstand aus Schritt 1 zu den Zellen, die ab Schritt 2.7.2 plattiert sind, und inkubieren bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht.
    4. Trypsinisieren Sie die 4T1-Zellen mit 500 l Trypsin für 2-5 Minuten (Zellen sollten frei von der Unterseite des Brunnens abspülen). Übertragen Sie alle Zellen auf eine 10 cm Schale in 10 ml Selektionsmedien (vollständige Wachstumsmedien, die die entsprechenden Antibiotika enthalten) und löschen Sie so das Trypsin. Platte einige nicht infizierte Steuerelemente mit 4T1-Zellen im selben Auswahlmedium beschriftet.
    5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, 5%CO2 in Selektionsmedien und spalten Sie die Zellen bei Bedarf, bis alle nicht infizierten Zellen tot sind.
    6. Bestätigen Sie, dass die Expression des Kandidatengens mit einem Standardansatz wie Western Blot20 oder qPCR21verändert wird.
    7. Assay Lumineszenz und Fluoreszenz wie in den Schritten 2.5-2.6, um zu bestimmen, wie ähnlich sie in Kontroll- und Knockdown-Zellen sind, da sich dies ändern kann (siehe Diskussion).
      HINWEIS: Das Protokoll kann angehalten werden, indem die stabil endenden Zellen eingefroren werden.

3. Optimierung des in vivo experimentellen Designs

  1. Optimieren Sie die geeignete Zellzahl und Die Dauer des Experiments für die gewünschte metastasierende Belastung wie folgt.
    1. Erweitern Sie die fluoreszierenden und biolumineszierenden 4T1-Zellen ab Schritt 2.6 in kompletten Wachstumsmedien, so dass überschüssige Zellen am gewünschten Injektionstag verfügbar sind.
    2. Bereiten Sie die Zellen für Schwanzveneninjektionen vor, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Um die optimale Zellzahl für Injektionen zu bestimmen, setzen Sie die Zellen in verschiedenen Konzentrationen in 100 l 1x PBS wieder aus.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, einen Bereich von Zellennummern/Maus von 25.000 bis 500.000 zu testen.
    3. Halten Sie die Zellsuspensionen bis zur Injektion auf Eis.
    4. Injizieren Sie jede Verdünnung von 4T1-Zellen aus Schritt 3.1.2 in 3-4 Mäuse über die in Schritt 4.3 beschriebene laterale Schwanzvene (siehe unten).
    5. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig und Monitor für 15 Minuten, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten. Mäuse sollten 3x wöchentlich auf Anzeichen von Schmerzen oder Schmerzen überprüft werden.
    6. Überwachen Sie Mäuse 3-6 Wochen lang auf Metastasenbildung und Wachstum (Zelllinie und Mausstammabhängig) mit einem in vivo Live-Tierbildgebungsgerät (siehe Schritte 5 und 6).
      1. Euthanisieren Sie Mäuse 3-6 Wochen nach der Injektion der Schwanzvene nach den üblichen institutionellen Richtlinien.
      2. Bereiten Sie die Lunge vor und bewerten Sie die Größe und Anzahl der Metastasen, die in Schritt 7 beschrieben sind.
      3. Wählen Sie die geeignete Zeitdauer für die Metastasen, um für die gewünschte metastasierende Belastung zu wachsen (siehe Diskussion).

4. Schwanzveneninjektion von markierten Krebszellen

HINWEIS: Schritt 4.2.4 wurde für 4T1-Zellen optimiert, die in syngenischen BALB/c-Mäusen wachsen. Wenn andere Krebszelllinien und Mausstämme verwendet werden, sollten zuerst die Anzahl der injizierten Zellen und die Länge des Assays optimiert werden.

  1. Erweitern Sie die in Schritt 2 erzeugten 4T1-Zelllinien auf zwei 15 cm großen Schalen in kompletten Wachstumsmedien, so dass am Tag der Injektion überschüssige Zellen zur Verfügung stehen.
  2. Bereiten Sie die Zellen für die Injektion der Schwanzvene wie folgt vor:
    1. Aspirieren Sie die Medien und spülen Sie die Zellplatten mit 1x PBS.
    2. Trypsinisieren Sie die Zellen mit 5 ml Trypsin pro 15 cm Platte für 2-5 Minuten (Zellen sollten frei abspülen die Unterseite des Brunnens). Übertragen Sie alle Zellen in ein konisches Rohr. Waschen Sie die verbleibenden Zellen aus der Gewebekulturschale mit genügend vollständigen Wachstumsmedien, um das Trypsin zu löschen und fügen Sie die Wäsche in das gleiche konische Rohr.
    3. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellenzählers, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellen 3 Minuten lang bei 122 x g, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1x PBS in der gewünschten Konzentration wieder aus. Hierwerden werden 2,5 x 104 Zellen in jede Maus in 100 l PBS injiziert, so dass die Resuspendzellen bei 2,5 x 105 Zellen/ml. Halten Sie die Zellsuspensionen bis zur Injektion auf Eis.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Zeit zwischen der Trypsinisierung der Zellen und der Schwanzveneninjektion auf etwa 1 Stunde zu begrenzen.
  3. Injizieren Sie 4T1-Zellen aus Schritt 4.2.5 in Mäuse über die laterale Schwanzvene wie folgt:
    1. Arbeiten Sie in einer Haube in der Tieranlage, mischen Sie die Zellen sanft, aber gründlich, indem Sie das Rohr invertieren oder eine 1 ml Spritze verwenden, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig resuspendiert werden. Stellen Sie immer sicher, dass die Zellen vor dem Beladen der Spritze resuspendiert werden.
    2. Laden Sie eine 1 ml Luer-Lock Spritze mit Zellsuspension und vertreiben Sie überschüssige Luftblasen. Legen Sie eine Nadel mit 1,2 Zoll und 30-Spur auf die Spritze mit der Abschrägung und vertreiben Sie Luftblasen.
    3. Legen Sie die Maus vorsichtig in einen Nagetier-Restrainer.
    4. Die seitlichen Schwanzvenen sollten sichtbar und erweitert sein. Wenn nicht, kneifen Sie vorsichtig die Basis des Schwanzes und tauchen Sie den Schwanz in warmes Leitungswasser, um die Venen zu verdünnen.
      HINWEIS: Eine Erweiterung der Venen kann auch erreicht werden, indem der Mauskäfig unter einer Heizlampe und/oder auf einem Heizkissen platziert wird.
    5. Verwenden Sie ein Alkoholtuch, um den Schwanz zu reinigen. Setzen Sie die Nadel in die Schwanzvene ein, fasen Sie seite nach oben, und injizieren Sie 100 l Zellsuspension.
      HINWEIS: Wenn die Nadel richtig in die Vene eingeführt wird, sollte sie leicht nach vorne und hinten gleiten, und es sollte kein Widerstand vorhanden sein, wenn der Kolben gedrückt wird. Erfolgreiche Injektionen sollten auch zu einem "Flush" führen, bei dem die blaue Farbe der Vene für einige Sekunden nach der Injektion weiß wird.
  4. Entfernen Sie langsam die Nadel und mit einer sterilen Gaze, Druck auf die Injektionsstelle ausüben, um jede Blutung zu stoppen.
  5. Bringen Sie die Maus in ihren Käfig und Monitor für 15 Minuten, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten. Mäuse sollten 3x wöchentlich auf Anzeichen von Schmerzen oder Schmerzen überprüft werden.
  6. Überwachen Sie Mäuse 3-6 Wochen lang auf Metastasenbildung und Wachstum (Zelllinie und Mausstammabhängig) mit einem in vivo Live-Tierbildgebungsgerät (siehe Schritte 5 und 6).

5. Überwachung der metastasierenden Belastung durch Fluoreszenz mit einem in vivo Live-Tierbildgebungsgerät

HINWEIS: Bildtiere nicht für Fluoreszenz mit aktivem Leuchtsignal abbilden.

  1. Wenn sie nur die Biolumineszenz abbilden, fahren Sie mit Schritt 6 fort.
  2. Schalten Sie das in vivo Live-Tier-Bildgebungsgerät ein.
  3. Richten Sie das In-vivo-Anästhesiesystem für lebende Tiere gemäß den Herstellerrichtlinien ein, um zwischen 1,5% und 2% Isofluran in die Anästhesiekammer und die Bildgebungskammer zu liefern.
  4. Anästhesisieren Sie Mäuse mit fluoreszierend markierten Metastasen ab Schritt 4, indem Sie sie in eine Anästhesiekammer legen und 1,5-2,5% Isofluran liefern.
  5. Öffnen Sie die Bildsoftware (siehe Tabelle der Materialien) und melden Sie sich an.
  6. Klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, und warten Sie, bis der Computer initialisiert wurde.
  7. Ändern Sie das Feld der Ansicht in D.
    HINWEIS: Feld der Ansicht C kann auch verwendet werden, wenn eine nähere Ansicht einer Maus erforderlich ist, aber dies begrenzt die Anzahl der Mäuse, die gleichzeitig abgebildet werden können.
  8. Sobald die Software angezeigt hat, dass die Kamera die entsprechende Temperatur erreicht hat, klicken Sie auf die Schaltfläche Imaging Wizard, wählen Sie Fluoreszenz und wählen Sie dann das entsprechende Filterpaar aus dem Dropdown-Menü aus.
    HINWEIS: Wenn das verwendete Fluorophor keine Option ist, wählen Sie Input EX/EM aus und geben Sie die erforderliche Anregung und Emission ein.
  9. Platzieren Sie die Maus in der Kammer, wie in Schritt 3.2.4 beschrieben.
  10. Klicken Sie auf Sequenz erwerben.
  11. Nach der Bildgebung kehren Sie die Maus für 15 Minuten in ihren Käfig und Monitor zurück, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten.
  12. Wiederholen Sie Schritt 5.2 und die Schritte 5.7-5.9 mit mindestens einer Maus, die keine Metastasen enthält. HINWEIS: Diese Maus wird verwendet, um Hintergrundsignale während der Analyse zu quantifizieren und zu subtrahieren (Schritt 8).
  13. Bild 2-3 mal wöchentlich für die Dauer des Experiments.

6. Überwachung der metastasierenden Belastung durch Biolumineszenz mit einem in vivo Live-Tierbildgebungsgerät

  1. Schalten Sie das Live-Tierbildgerät in vivo ein und richten Sie das Programm wie folgt ein.
    1. Öffnen Sie die Bildsoftware (siehe Tabelle der Materialien) und melden Sie sich an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Initialisieren, und warten Sie, bis der Computer initialisiert wurde. Ändern Sie das Feld der Ansicht in D.
      HINWEIS: Feld der Ansicht C kann für eine nähere Ansicht verwendet werden, um den gesamten Mauskörper abzubilden; Dies begrenzt jedoch die Anzahl der Mäuse, die gleichzeitig abgebildet werden können.
    2. Bearbeiten Sie bei der ersten Verwendung die Belichtungseinstellungen wie folgt: Klicken Sie auf Bearbeiten | Präferenzen | Akquisition | Automatische Belichtung und ändern Sie die maximale Belichtungszeit von der Standardeinstellung 60 Sekunden auf 300 Sekunden und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Ändern Sie keine anderen Parameter auf der Registerkarte Autobelichtung.
  2. Richten Sie das Anästhesiesystem nach herstellerspezifischen Richtlinien ein, um zwischen 1,5% und 2% Isofluran in die Anästhesiekammer und die Bildgebungskammer zu liefern.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Kamera die entsprechende Temperatur erreicht hat, bevor Sie mit Schritt 6.4 fortfahren.
  4. Anästhesieren Sie metastasierende Mäuse ab Schritt 4, indem Sie sie in eine Anästhesiekammer legen und 1,5-2,5% Isofluran liefern.
  5. Bereiten Sie Mäuse wie folgt auf die Biolumineszenz-Bildgebung vor.
    1. Laden Sie eine 1 ml Spritze mit D-Luciferin (30 mg/ml in D-PBS) und fügen Sie dann eine 1/2 Zoll 30-Spur-Nadel in die Spritze und vertreiben Luftblasen.
    2. Messen und aufzeichnen Sie die Masse der anästhesierten Maus.
    3. Halten Sie die Maus zurück, indem Sie die Schürfzeit ihres Halses mit Daumen und Zeigerfingern kneifen und den Schwanz zwischen dem Pinkiefinger und der Basis der Hand greifen. Invertieren Sie die Maus in einem 45-Grad-Winkel, mit dem Kopf nach unten gerichtet.
    4. Setzen Sie die Nadel, Abschrägung Seite nach oben, in die linke Seite der Maus intraperitoneal (IP) Raum. Bestätigen Sie den Eintrag in den IP-Bereich, indem Sie ein kleines Volume zurückzeichnen. Es sollte keine Farbe an der Basis der Nadel vorhanden sein, wenn sie im IP-Bereich zurückgezeichnet wird.
    5. Injizieren Sie das entsprechende Volumen von D-Luciferin für eine Dosis von 150 mg/kg.
    6. Unmittelbar nach der Verabreichung von D-Luciferin starten Sie einen Timer und legen Sie die Maus flach auf den Rücken in das Bildgebungsgerät mit der Nase im Nasenkegel und stellen Sie sicher, dass 1,5-2,5% Isofluran verabreicht wird. Platzieren Sie Trennwände zwischen jeder Maus, wenn Sie mehrere Mäuse bildgeben. Stellen Sie sicher, dass Mäuse so flach wie möglich positioniert sind (d. h. nicht zur Seite geneigt sind).
    7. Klicken Sie auf die Felder Luminescent und Photograph, und klicken Sie dann in der Erfassungssteuerungauf Übernehmen .
  6. Erfassen Sie kontinuierlich biolumineszierende Bilder, bis das Spitzensignal erreicht ist, und verwenden Sie das Bild mit dem Peak-Biolumineszenzsignal für die Analyse.
  7. Nach der Bildgebung kehren Sie die Maus für 15 Minuten in ihren Käfig und Monitor zurück, um eine vollständige Wiederherstellung zu gewährleisten.
  8. Bild 2-3 mal wöchentlich für die Dauer des Experiments.

7. Quantifizierung der Anzahl und Größe der Metastasen

HINWEIS: Die Dauer des Anbaus der Metastasen sollte für jede Zelllinie und jeden Mausstamm bestimmt werden und wird durch die Anzahl der injizierten Zellen beeinflusst.

  1. Euthanisieren Sie die Mäuse nach standardinstitutionellen Richtlinien.
  2. Isolieren und entfernen Sie die Lunge von jeder Maus und spülen Sie in 1x PBS, um überschüssiges Blut zu entfernen.
  3. Die Lunge vorsichtig in Lappen trennen.
  4. Erfassen Sie Bilder von ZsGreen-Metastasen in den Lappen bei 10x im hellen Feld und fluoreszenz mit einem fluoreszierenden Stereoskop mit einem GFP-Breitbandfilter (Erregung 470/40x).
    HINWEIS: Behalten Sie die gleiche Vergrößerung und Helligkeit für alle Proben bei. Die verwendete Vergrößerung kann je nach Größe, Anzahl und Helligkeit der Metastasen sowie dem Sichtfeld für das verwendete Mikroskop variieren.
  5. Verwenden Sie Bildanalysesoftware, um die Größe und Anzahl der Metastasen aus den Bildern zu quantifizieren.
    HINWEIS: Das Protokoll für die Bildanalyse ist softwareabhängig und könnte mit Tumoren von Schritt 3 optimiert werden. Alternativ können Sie die Anzahl der Metastasen in jeder Lunge manuell mit dem fluoreszierenden Stereoskop zählen. Das Protokoll kann hier angehalten werden und Schritt 8 kann jederzeit durchgeführt werden, nachdem alle In-vivo-Bilder gesammelt wurden.

8. Verarbeitung und Analyse der Daten aus den mit dem Live-Tierbildgerät in vivo aufgenommenen Bildern

  1. Öffnen Sie alle Bilddateien für jede Maus in der Bildsoftware.
    ANMERKUNG: Verwenden Sie das Bild mit dem Spitzen-Biolumineszenzsignal zur Analyse
  2. Stellen Sie sicher, dass sich die Einheiten in Radiance befinden, um biolumineszierende Daten und Effizienz für fluoreszierende Daten zu erhalten, indem Sie auf den Pfeil oben links im Bildfenster klicken und ihn in die entsprechende Einheit ändern.
  3. Verwenden Sie das Bild vom letzten Zeitpunkt, um eine Region von Interesse (ROI) wie folgt zu erstellen.
    1. Klicken Sie im Fenster Werkzeugpalette auf ROI-Werkzeuge. Fügen Sie einen ROI ein, indem Sie auf den Pfeil klicken und 1auswählen.
    2. Klicken Sie auf den Rand des ROI und bewegen Sie ihn über die Brust der Maus. Passen Sie die Größe des ROI so an, dass er die Brust der Maus abdeckt und das Signal nicht ausschließt.
  4. Klicken Sie auf ROIs messen, und kopieren oder geben Sie die unformatierte Zahl in ein Excel-Blatt ein.
    HINWEIS: Wählen Sie für biolumineszierende Daten den Gesamtfluss (Photonen/Sekunde) aus, der die Summe aller Strahlungen im ROI darstellt. Da Metastasen nicht notwendigerweise gleichmäßig wachsen, wird der Gesamtfluss gegenüber der durchschnittlichen Ausstrahlung bevorzugt, da er die Summe der metastasierenden Belastung misst. Ebenso sollte für fluoreszierende Daten der Gesamtwirkungsgrad %(Emissionslicht (Photonen/Sekunde)/Anregungslicht (Photonen/Sekunde)) anstelle der durchschnittlichen Effizienz verwendet werden.
  5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in die Bilddatei, um den roi in Schritt 8.3 zu kopieren und in jede Bilddatei einzufügen.
    HINWEIS: Quantifizieren Sie bei der Quantifizierung von fluoreszierenden Bildern dieselbe Region auf einer Maus, die ohne Metastasierung abgebildet wurde. Verwenden Sie dieses Signal als Hintergrundsignal und subtrahieren Sie es von jedem fluoreszierenden metastasenhaltigen Mausbild, das erfasst wurde.
  6. Verschieben Sie eingefügte ROIs über denselben Bereich, der in Schritt 8.3.4 für jedes Bild ausgewählt wurde, und wiederholen Sie Schritt 8.4.
  7. Plotten und analysieren Sie die Rohdaten wie folgt (siehe Ergänzende Tabelle 2).
    1. Führen Sie eine Log10-Transformation der Rohdaten für jede Maus mit der angegebenen Formel (Ergänzende Tabelle 2) und Diagramm wie in Abbildung 2D und Abbildung 4Fdurch. Die log10-Transformation linearisiert die Wachstumskurve, die zu geometrischer Weise ist, und minimiert die Heteroskedastizität.
    2. Berechnen Sie mithilfe der linearen Regression die Steigung der angepassten Linie zu den transformierten Protokolldaten10 für jede in Schritt 8.7.1 dargestellte Maus (Ergänzende Tabelle 2). Beziehen Sie sich auf die Formel in Ergänzungstabelle 2, um die Linie anzupassen und die Neigung in einem Schritt zu berechnen.
    3. Zeichnen Sie die numerischen Werte der Steigungen wie in Abbildung 2E und Abbildung 4G. Verwenden Sie einen Schüler-T-Test oder eine einseitige ANOVA (für mehr als 2 Gruppen) auf der Piste, um die statistische Signifikanz zu bestimmen.

Ergebnisse

Um den obigen Ansatz zu demonstrieren, führten wir ein Proof-of-Concept-Experiment durch, bei dem ein kritischer Replikationsfaktor, RPA3, in einer metastasierenden Maus-Mammakarzinom-Zelllinie niedergeschlagen wurde (4T122). Während das Protokoll beschreibt, dass die Zellen vor der genetischen Manipulation sowohl mit Luziferase als auch mit fluoreszierenden Proteinen gekennzeichnet werden, haben wir einen modifizierten Ansatz verwendet, da DIE RNAi-Vektoren auch ZsGreen liefern (

Diskussion

Kritische Schritte der Methode
Es ist wichtig, die Anzahl der injizierten Zellen (Schritt 3) für eine bestimmte Zelllinie und Mausdehnung zu optimieren, da dies die Anzahl der Metastasen, die sich bilden, und die Länge des Experiments stark beeinflussen kann. Wenn zu viele Zellen injiziert werden oder die Metastasen zu lange wachsen, können die Metastasen schwer zu zählen sein, was die Auswirkungen der genetischen Manipulation schwer einschätzen kann. Wenn jedoch zu wenige Zellen injiziert werden...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Emily Norton für die Unterstützung bei Virusinfektionen und die kritische Lektüre des Manuskripts. Wir danken auch Ryan Kanai für die Hilfe beim Erfassen von Bildern der Lunge und Kate E. Tubbesing für Hilfe bei der Bildanalyse der grünen Metastasen in der Lunge. Wir danken den Mitarbeitern der Tierforschungseinrichtung für die Unterstützung und unterstützung bei der Erstellung dieses Videos. Diese Arbeit wurde von einem Susan G. Komen Career Catalyst Grant unterstützt, der J.M.L. (#CCR17477184) verliehen wurde.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10% SDS-PAGE GelFor western blot
2.5% TrypsinGibco15090-046Trypsin for tissue culture
96 well flat bottom white assay plateCorning3922For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Alcohol wipesFor sterolizing the injection site before tail vein injecitons
BALB/C mice (female, 6 weeks)TaconicBALB-FFor tail vein metastatic colonization and burden assays
BSA regularVWR Ameresco97061-416For western blot
Cell lysis bufferCell SignalingFor collecting protien samples
Celltreat Syringe Filters, PES 30mm, 0.45 μmCelltreat40-229749-CSFor filtering viral supernatant
CO2 and euthanasia chamberFor euthanasing the mice
Dual-luciferase reporter assay kitPromegaE1960For measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
Dulbecco&39;s phosphate buffered salineHimediaTS1006For PBS
EDTAVWR97061-406Used to dilute trypsin for tissue culture
FBS 100% US originVWR97068-085Component of complete growth media
Fujifilm LAS-3000 gel imagerFujifilmFor western blot
GAPDH(14C10) Rabibit mAbCell Signaling2118For western blot
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP conjugateThermo Scientific31460For western blot
Human embryonic kidney cells, HEK-293FTInvitrogenR70007Cell line used for packging virus
HyClone DMEM/High clucoseGE Healthcare life sciencesSH30243.01Component of complete growth media
Hygromycin B, Ultra Pure GradeVWR Ameresco97064-810For antibiotic selection of infected cells
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAMolecular devicesFor measuring luciferase and renilla signal in cultured cells
ImagejUsed for image analysis of lung metastases: threshold set to 25 & 100
Immuno-Blot PVDF MembraneBiorad1620177For western blot
IsofluraneFor mouse anesthesia
IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)PerkinElmerCLS136340For in vivo imaging of metastatic burden
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (GFP and bright field filters)Leica MicrosystemsMicroscope and camera for visualing, counting and taking pcitures of metastases in the lungs; 10X magnifacation, 3.5 sec exposure, 1.4 gain
L-GlutamineGibco25030-081Component of complete growth media
Lipofectamine 3000Life technologiesL3000008For YAP/TAZ-TEAD reporter transfection
Living Image 3.2 (image software program)PerkinElmerSoftware for IVIS
Mouse breast cancer cells, 4T1Karmanos Cancer InstituteAslakson, CJ et al.,1992Mouse metastatic breast cance cell line
Multi-Gauge version 3.0FujifilmSoftware for quantifying western blot band intensity
Opti-MEM (transfection buffer)Gibco31985-062For packaging virus and transfection
Penicillin StreptomycinGibco15140-122Component of complete growth media
Pierce BCA protein assay kitThermo Scientific23225For quantifying protein concentration
Pierce Phosphatase Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32957Added to cell lysis buffer
Pierce Protease Inhibitor Mini TabletsThermo ScientificA32953Added to cell lysis buffer
Polybrene (hexadimethrine bromide)Sigma-Aldrich45-H9268For infection
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255For antibiotic selection of infected cells
Rodent restrainerFor restraining mice during tail vein injeciton
SDS-PAGE running bufferFor western blot
TAZ (V3886) AntibodyCell Signaling4883For western blot
TBST bufferFor western blot
TC20 automated cell counterBio-RadFor counting cells
VectorsSee Table 1 for complete list of vectors
VWR Inverted Fluorescence MicroscopeVWR89404-464For visualizing fluorescence in ZSGreen labeled cells
Western transfer bufferFor western blot
XenoLight D-Luciferin K+ SaltPerkinElmer122799Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)Roche6365787001For packaging virus
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074For western blot

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