Establecimiento del Infarto Pontino Agudo en Ratas por Estimulación Eléctrica

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para establecer infarto agudo de pontina en un modelo de rata a través de la estimulación eléctrica con un solo pulso.

Resumen

El infarto de pontina es el subtipo de trazo más común en la circulación posterior, mientras que carece de un modelo de roedores que imita el infarto pontino. Aquí se proporciona un protocolo para establecer con éxito un modelo de rata de infarto pontino agudo. Se utilizan ratas que pesan alrededor de 250 g, y se inyecta una sonda con una vaina aislada en los pons utilizando un aparato estereotaxico. Una lesión es producida por la estimulación eléctrica con un solo pulso. La puntuación de Longa, la puntuación de Berderson y la prueba de balance de haz se utilizan para evaluar los déficits neurológicos. Además, la prueba somatosensorial de eliminación de adhesivo se utiliza para determinar la función sensorimotor, y la prueba de colocación de las extremidades se utiliza para evaluar la propriocepción. Las resonancias magnéticas se utilizan para evaluar el infarto in vivo, y la tinción TTC se utiliza para confirmar el infarto in vitro. Aquí, se identifica un infarto exitoso que se encuentra en la base anterolateral de los pons rostrales. En conclusión, se describe un nuevo método para establecer un modelo agudo de rata de infarto pontino.

Introducción

Desde la década de 1980, el modelo de oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) inducido por filamentos de silicona ha sido ampliamente utilizado en la investigación básica del accidente cerebrovascular^1. También se han utilizado otros métodos (es decir, la sutura de una rama del MCA² y el infarto focal inducido fotoquímicamente). Estos modelos han sido llamados modelos de accidente cerebrovascular basados en MCA y han contribuido en gran medida a las investigaciones de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes al accidente cerebrovascular y las posibles terapias. Aunque hay limitaciones de estos modelos experimentales^3,,4, estos métodos se han utilizado muchos laboratorios^5,6. Los modelos de trazo basados en MCA representan un trazo en la circulación anterior; sin embargo, pocos informes han investigado modelos que imitan el trazo en la circulación posterior⁷.

Hay diferencias significativas entre la etiología, los mecanismos, la manifestación clínica y el pronóstico entre los accidentes cerebrovasculares de circulación anterior y posterior⁸. Por lo tanto, los resultados derivados de los modelos de carrera de circulación anterior no se pueden aplicar a la carrera de circulación posterior. Por ejemplo, la ventana de tiempo de reperfusión para la circulación anterior se ha ampliado a 6 h, con una pequeña porción de estudios que se extiende a 24 h sobre la base de los hallazgos de imágenes⁹. Sin embargo, el plazo para la circulación posterior puede ser superior a 24 h, según informes anteriores¹⁰ y nuestras propias experiencias clínicas. Esta ventana de tiempo de reperfusión alargada debe estudiarse y confirmarse en modelos experimentales.

En cuanto a los trazos de circulación posterior, el infarto pontino es el subtipo más común, representando el 7% de todos los casos de accidente cerebrovascular isquémico^11,,12. Según la topografía del infarto, los infartos pontinos se dividen en infartos pontinos aislados y no aislados^13. Los infartos pontinos aislados se clasifican en tres tipos basados en los mecanismos subyacentes: enfermedad arterial grande (LAD), enfermedad de la rama de la arteria basilar (BABD) y enfermedad de las arterias pequeñas (SAD). El conocimiento de los mecanismos, manifestación y pronóstico del infarto pontino se ha derivado de investigaciones clínicas de los casos¹⁴. Sin embargo, un modelo de roedores que imita el infarto pontino ha sido menos investigado.

En estudios anteriores, se ha explorado la lesión difusa del tronco cerebral tegmentum que afecta a los pons⁷. Un grupo intentó crear un modelo de infarto pontino a través de la ligadura de la arteria basilar (BA)¹⁵. Otro grupo utilizó una sutura monofilamento de nylon 10-0 para ligar selectivamente cuatro puntos de la BA proximal selectivamente¹⁶. Este modelo imita LAD, pero la mayoría de las infartos pontinas son el resultado de BABD y SAD. Además, la ligadura selectiva de la BA es una cirugía complicada y tiene una alta tasa de mortalidad.

Aquí se proporciona un protocolo detallado para un modelo de rata fácil de realizar, fácil de reproducir y exitoso de infarto pontino agudo por estimulación eléctrica.

Protocolo

El protocolo fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangzhou, una institución acreditada por AAALACi. Las ratas fueron proporcionadas por el Centro Animal de la Universidad Médica del Sur.

1. Animal

1. Utilice ratas Sprague-Dawley machos adultos que pesen 250 x 10 g.
2. Tras el transporte, albergar a las ratas durante al menos 1 semana antes de la cirugía en condiciones ambientales controladas con una temperatura ambiente de 25 oC, humedad relativa del 65%, y 12 h/12 h de ciclo claro/oscuro.
3. Proporcione alimentos y agua ad libitum.

2. Establecimiento de infartos en los pons

1. Pesar las ratas antes de la cirugía y evaluar el rendimiento neurológico de acuerdo con las pruebas conductuales descritas a continuación (sección 3).
2. Precaliente la almohadilla de calentamiento inmediatamente antes de la anestesia.
3. Fije el taladro del cráneo al soporte en el marco estereotaxico.
4. Inyecte intraperitonealmente a las ratas con 50 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilazina. Compruebe la falta de respuesta de la dencha del dedo del pie.
5. Monte la rata en el marco estereotaxico en posición propensa. Coloque las barras de las orejas por encima del canal auditivo para asegurar la cabeza. Asegúrese de que el cráneo se mantiene horizontal para evitar cualquier sesgo de la inyección.
6. Mantener la anestesia por isoflurano (100% oxígeno, 2,5% isoflurano) a través de un accesorio de cono nasal estereotaxico para ratas con puertos de entrada y salida. Mantener la temperatura a 37 oC utilizando una almohadilla de calentamiento y controlar la temperatura durante todo el procedimiento.
7. Use pomada para los ojos para evitar el secado de la córnea. Use fórceps para pellizcar ligeramente las patas para asegurarse de que no hay respuesta al dolor.
8. Afeitar el cabello del cráneo con una micro afeitadora. Aplicar exfoliante quirúrgico de clorhexidina de forma circular comenzando en el lugar de la incisión quirúrgica y girando hacia afuera.
9. Haga una incisión de línea media de 3 cm con un bisturí de la línea del canthus lateral bilateral a 0,5 cm detrás de la fontanela posterior, que debe estar marcada por una pluma marcadora quirúrgica.
10. Use un hisopo de algodón para extraer una sangre.
11. Coloque un trozo de cinta quirúrgica colocado a cada lado de la solapa de la piel para exponer el cuero cabelludo (Figura 1).
12. Retire suavemente los tejidos conectivos del hueso del cráneo con un hisopo de algodón sumergido en 0,9% NaCl. Si no se retiran, los tejidos conectivos quedarán atrapados en el taladro.
13. Identifique el bregma. Elija el punto central del bregma como punto de origen y márquelo usando una pluma de marcador quirúrgico negro de punta fina.
14. Coloque un taladro en 6,0 mm AP, 2,0 mm ML (rango de 0,5-3,0 mm, Figura 2A).
15. Realice craneotomía (1 mm de diámetro) con un taladro automático. Proceda con cuidado, porque este punto está cerca del seno venoso.
16. Retire el taladro del marco estereotaxico.
17. Coloque una sonda de 22 G con una funda aislada en el marco estereotaxico(Figura 3A). La punta de la sonda debe colocarse 2 mm por encima del extremo proximal de la vaina (Figura 3A,B; Figura 2B).
18. Asegúrese de que la vaina entre en el cerebro 7 mm (7 mm DV, Figura 2B; Figura 1C).
19. Avance la sonda a lo largo de la vaina(Figura 1D)hasta que la punta de la sonda esté 9 mm por debajo de la superficie del cerebro (Figura 2D).
20. Conecte los electrodos a un estimulador eléctrico(Figura 3C). Conecte el ánodo con la sonda tal y como se muestra en del cuadro 1D. Conecte el cátodo a las ratas (generalmente a la oreja de las ratas).
21. Encienda el estimulador eléctrico y configure los siguientes parámetros: anchura de pulso único a 4.050 ms; tensión a 50 V; y corriente 4 mA(Figura 3C). Durante la estimulación eléctrica, la rata exhibirá temblores. En este estudio, el dispositivo no se encendió para las ratas del grupo de control utilizadas para las pruebas de comportamiento, la RMN y el TTC.
22. Deje la sonda en posición durante 5 minutos después de la estimulación.
23. Retire la sonda del cerebro(Figura 1F).
24. Use cemento óseo para cubrir la craneotomía. Deje que el cemento se seque antes de suturar la herida.
25. Suturar la herida con filamentos de sutura de poliamida 4-0. Después de tres o cuatro stiches, ate 2-1-1 nudos quirúrgicos estándar.
26. Inyectar las ratas con penicilina (0,25 ml, 80 UI diluidas en 4 ml de solución salina) por vía intraperitoneal para prevenir la infección.
27. Inyectar las ratas por vía subcutánea con meloxicam a una dosis de 2 mg/kg y luego repetirlo cada 24 h.
28. Monitoree las ratas cada 15 minutos hasta que estén completamente despiertos y vuelva a la jaula con una almohadilla de calentamiento. Proporcione acceso gratuito a alimentos y agua hasta su sacrificio.
    NOTA: Todos los procedimientos deben seguir los principios quirúrgicos asépticos. Antes de la cirugía, ponte una matorral, una mascarilla quirúrgica y guantes estériles después de un exfoliante quirúrgico de manos. Mantener el material de sutura estéril dentro del campo estéril en todo momento.

3. Pruebas conductuales

1. Puntuación de Longa¹⁷
   1. Coloque las ratas en la superficie de la mesa.
   2. Registrar las puntuaciones de la siguiente manera: 0 - sin déficit neurológico; 1 - falta de extensión totalmente contralateral forepaw, un déficit neurológico focal leve; 2o dando vueltas hacia la izquierda, un déficit neurológico focal moderado; 3 - cayendo a la izquierda, un déficit focal severo; 4o sin caminar espontáneamente y un nivel de conciencia deprimido.
2. Berderson puntuación¹⁸
   1. Sostenga la rata por la cola y deje que las extremidades delanteras alcancen una mesa. Registre las puntuaciones de la siguiente manera: 0 - ambas extremidades llegaron a la tabla; 1 - sólo una extremidad llega a la mesa.
   2. Coloque el animal sobre una superficie rugosa. Registre las puntuaciones de la siguiente manera: 0o un fuerte agarre en la superficie rugosa con buena resistencia cuando se empuja; 1 - una ligera resistencia que sólo se ve en una pata; 2 no hay resistencia cuando se empuja en una dirección.
   3. Coloque la rata en un área cerrada (18 en 36 in) y deje que vague libremente. Registre las puntuaciones de la siguiente manera: 0o a pie toda la longitud del recinto sin dar vueltas; 1 - caminar toda la longitud de la carcasa con vueltas; 2 no puede caminar la longitud del recinto, pero puede rodear; 3 no se puede mover mucho. Utilice la suma de las puntuaciones de evaluación de cada tarea como puntuación final de la evaluación.
3. Prueba de haz de equilibrio¹⁹
   1. Asegúrese de que el aparato consta de un haz de 3 cm de ancho y 70 cm de largo y está 20 cm por encima del suelo. Coloque una caja oscurecida en el extremo lejano de la viga con una entrada estrecha.
   2. Coloque un generador de ruido blanco y una fuente de luz brillante al inicio del haz. El ruido y la luz se utilizaron para motivar a la rata a atravesar el haz y entrar en la caja de meta.
   3. Terminar los estímulos cuando los animales entran en la caja oscurecida. Registre la latencia para alcanzar el cuadro de meta (en segundos) y el rendimiento de la rata al atravesar la viga.
   4. Registre las puntuaciones para cada actuación de la siguiente manera: 0 o balances con postura constante; 1 - agarra el lado de la viga; 2o viga de abrazos y 1 extremidad cae de la viga; 3 - viga de abrazos y dos extremidades caen de la viga, o gira en la viga después de >60 s; 4 - Intenta equilibrar en la viga pero se cae después de >40 s; 5 - Intenta equilibrar en la viga pero se cae después de >20 s; y 6o se cae, ningún intento de equilibrar o colgar en la viga después de <20 s.
4. Prueba somatosensorial de eliminación de adhesivo²⁰
   1. Coloque las ratas en una caja de plexiglás transparente y déjelas explorar el nuevo entorno durante 2 o 3 minutos.
   2. Coloque una etiqueta adhesiva de color verde de 10 mm de diámetro en la superficie interior de cada extremidad delantera por encima del pulgar y en la muñeca.
   3. Devuelva las ratas a la caja de plexiglás.
   4. Registre el tiempo para que la rata retire la primera etiqueta y todas las demás etiquetas, respectivamente. Permitir un máximo de 3 min. La prueba debe realizarse 2 veces en el entrenamiento.
5. Prueba de colocación de las extremidades
   1. Sostenga las ratas en posición horizontal y evite el movimiento.
   2. Una vez que la rata pierde el contacto con la superficie de la mesa (movimiento pasivo de las extremidades), aplique estímulos táctiles y proprioceptivos a la pata con el borde de la mesa.
   3. Evalúe la colocación de la pata (éxito o fallo) en el borde de la mesa.
   4. Registre las puntuaciones de la siguiente manera: 0 , sin colocación; 0.5 - Colocación inacabada y/o retrasada; 1 - Colocación inmediata y completa.

4. Confirmación de infarto por RMN

1. Realice la resonancia magnética 24 h después de la cirugía.
2. Anestesiar la rata por isoflurano (5% para la inducción, 1%-1.5% para mantenimiento).
3. Asegure la cabeza de la rata en una bobina de matriz cerebral de rata y combinado con una bobina de volumen de solo transmisión.
4. Coloque la bobina y la rata en el escáner de RMN. Asegure la rata dentro de la cuna usando las barras de dientes y orejas.
5. Mantener la temperatura corporal a 37 oC a 0,5 oC durante el procedimiento de exploración por RMN utilizando una chaqueta térmica de circuito cerrado.
6. Utilice una secuencia piloto para garantizar una geometría correcta.
7. Recoja los escaneos ponderados T2 usando una secuencia de eco de giro rápido: tiempo de eco (TE) a 33 ms; tiempo de repetición (TR) a 8.000 ms; campo de visión de 30 mm x 30 mm; matriz de adquisición 512 a 512; 50 rodajas; 0,4 mm de espesor.
8. Recoger un imágenes planas de eco-eco de cuatro disparos DWI: tiempo de eco a 30,5 ms; tiempo de repetición a 8000 ms; matriz de 96 a 96; campo de visión de 25 mm x 25 mm; tres direcciones x, y, z; Valores B: 0 1.000 s/mm² y 1.000 s/mm²; 50 rodajas axiales contiguas; 0,4 mm de espesor.
9. Devuelva a las ratas a la jaula.

5. Confirmación del infarto por tinción TTC

1. Sacrificar las ratas en el punto de tiempo de acuerdo con el diseño experimental. En este experimento, sacrificamos las ratas 24 h después de la cirugía.
2. Prepare una solución TTC del 2% antes del sacrificio. Añadir 0,2 g de polvo TTC a los 10 ml 0,01 M PBS (pH 7,4). Transfiera la dilución a un plato de 10 cm cubierto con papel plateado y precalificado a 37 oC en un baño de agua.
3. Exponer la rata al 5% de isoflurano hasta la pérdida del conocimiento. Luego, exponga la rata a CO₂ (20%-30% del volumen de la jaula por minuto) hasta que la respiración se haya detenido, luego mantenga 2 min de exposición a_CO2.
4. Utilice los siguientes signos para confirmar la muerte: no hay aumento y caída del pecho, no hay latidos cardíacos palpables, mal color de la membrana mucosa, no hay respuesta a la pellizco del dedo del dedo del de la nariz, cambio de color u opacidad en los ojos.
5. Realice la luxación cervical.
6. Asegure a los animales pegando las patas en una plataforma estéril. Crea una incisión de línea media desde la clavícula hasta el hipogastrio y una incisión lateral desde el xifoide a la izquierda a lo largo de la caja torácica. Haga un corte en el diafragma también a lo largo de la caja torácica y una incisión de la línea media del tórax para exponer el corazón.
7. Conecte la punta de una aguja (27 G) a una bomba de perfusión que contenga 0,01 M de PBS a 4 oC en el ventrículo izquierdo.
   NOTA: Avance la punta a lo largo del borde izquierdo del ventrículo para evitar entrar en la aurícula. Encienda la bomba de perfusión para asegurarse de que la punta está en el ventrículo izquierdo y corte la aurícula derecha. Si el líquido drena fuera de la fosa nasal, la punta está en la aurícula y necesita ser ajustada o reinsertada.
8. Utilizar aproximadamente 100 ml de 0,01 M PBS, mantenido a 4 oC para perfusión. Apague la bomba de perfusión hasta que el hígado se vuelva blanco.
9. Decapitar a las ratas y diseccionar todo el cerebro usando las tijeras y fórceps. Retire el agua de la superficie cerebral con papel hinchado.
10. Almacene todo el cerebro a -80 oC durante 1 min (cortar secciones cerebrales es más fácil después de la congelación).
    NOTA: Este paso se puede omitir si las secciones cerebrales se pueden cortar bien sin congelarse.
11. Coloque el cerebro en la matriz con el lado dorsal hacia arriba.
12. Identifique el agujero en la superficie del cerebro como se muestra en la Figura 1G e inserte una hoja de acero inoxidable de 0,21 mm de espesor. Por lo general, el área más grande de infarto está en el plano de la sonda; por lo tanto, se debe insertar una hoja en esta región.
13. Inserte las otras cuchillas en un intervalo de 2 mm.
14. Retire simultáneamente las cuchillas, todas a la vez, de la matriz y coloque todo el cerebro con las cuchillas en la solución TTC en el plato. Retire las cuchillas con cuidado.
    NOTA: Aquí, las secciones cerebrales no se eliminaron fácilmente del líquido porque alguna pia mater residual en la base cranii interfería con la sección. Si quedan secciones en la matriz, utilice una pequeña espátula para transferirlas al plato.
15. Colocar el plato con solución TTC y secciones cerebrales en un baño de agua a 37 oC.
16. Compruebe el plato cada 5 minutos y asegúrese de que no hay superposición de secciones.
17. Añadir 10 ml de solución de paraformaldehído al 4% al plato para terminar la reacción TTC.
18. Orientar las secciones de la rostral a caudal y tomar fotos.

6. Estadísticas

1. Utilice software de análisis estadístico (por ejemplo, GraphPad Prism) para realizar una prueba tdel estudiante.
   NOTA: Todos los datos se expresan como medias de SE. Las diferencias entre grupos se determinan con las pruebas tdel estudiante de dos colas (p < 0.05 definida como significación estadística).

Resultados

Seis animales fueron sometidos al protocolo de cirugía descrito anteriormente. El grupo de control como se muestra en la Figura 4 consistía en seis ratas. Las rebanadas cerebrales mostradas en la Figura 4 se derivaron de una rata por grupo.

La resonancia magnética mostró que el infarto estaba ubicado en la base de los pons (Figura 4A). Dado que la sonda se inyectó 2 mm a la izquierda de la línea med...

Discusión

El presente estudio proporciona un protocolo para generar un modelo agudo de rata de infarto pontino. Este modelo se puede utilizar para la investigación sobre el pronóstico y la rehabilitación (incluyendo dolor crónico post-accidente cerebrovascular) en pacientes con accidente cerebrovascular pontino.

Hay varios puntos fuertes de este método. En primer lugar, proporciona un modelo de rata de infarto pontino agudo para futuros estudios. Como se mencionó anteriormente, el infarto de ponti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 sucture	Shanghai Jinzhong		Surgical instruments
Adhesive tape	Shanghai Jinzhong		Surgical instruments
Animal anesthesia system	RWD		Wear mask when using the system
Bone cement	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Cured clamp	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
General tissue scissors	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilization
Isoflurane	RWD	217181101
Lesion Making Device	Shanghai Yuyan		Making a lesion
MRI system	Bruker Biospin		Confirmation of infarction in vivo
Needle holder	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Probe	Anke		Need some modification
Q-tips	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Stereotaxic apparatus	RWD
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Tissue holding forcepts	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
TTC	Sigma-Aldrich	BCBW5177	For infarction confirmation in vitro