Établissement de l’infarctus aigu des pontines chez les rats par stimulation électrique

Résumé

Présenté ici est un protocole pour établir l’infarctus aigu de pontine dans un modèle de rat par stimulation électrique avec une seule impulsion.

Résumé

L’infarctus pontine est le sous-type de trait le plus commun dans la circulation postérieure, alors qu’il manque un modèle de rongeur imitant l’infarctus de pontine. Fourni ici est un protocole pour établir avec succès un modèle de rat de l’infarctus aigu pontine. Des rats pesant environ 250 g sont utilisés, et une sonde avec une gaine isolée est injectée dans les pons à l’aide d’un appareil stéréotaxique. Une lésion est produite par la stimulation électrique avec une seule impulsion. Le score de Longa, le score de Berderson, et le test d’équilibre de faisceau sont utilisés pour évaluer des déficits neurologiques. En outre, le test somatosensoriel adhésif-enlèvement est utilisé pour déterminer la fonction sensorimotrice, et le test de placement des membres est utilisé pour évaluer la proprioception. Les balayages de MRI sont alors utilisés pour évaluer l’infarctus in vivo, et la coloration de TTC est employée pour confirmer l’infarctus in vitro. Ici, un infarctus réussi est identifié qui est situé dans la base antérolatérale des pons rostral. En conclusion, une nouvelle méthode est décrite pour établir un modèle aigu de rat d’infarctus de pontine.

Introduction

Depuis les années 1980, le modèle d’occlusion cérébrale moyenne (MCAO) induit par les filaments de silicone a été largement utilisé dans la recherche de base sur les accidents vasculaires cérébraux¹. D’autres méthodes (c.-à-d. suturer une branche du MCA² et l’infarctus focal induit par photochimiquement) ont également été utilisées. Ces modèles ont été appelés modèles d’AVC basés sur le MCA et ont grandement contribué aux investigations des mécanismes pathophysiologiques sous-jacents à l’AVC et aux thérapies potentielles. Bien qu’il y ait des limites de ces modèles expérimentaux^3,4, ces méthodes ont été utilisées de nombreux laboratoires^5,6. Les modèles d’AVC basés sur le MCA représentent un accident vasculaire cérébral dans la circulation antérieure; cependant, peu de rapports ont étudié des modèles imitant l’AVC dans la circulation postérieure⁷.

Il y a des différences significatives entre l’étiologie, les mécanismes, la manifestation clinique, et le pronostic entre les courses antérieures et postérieures de circulation⁸. Par conséquent, les résultats dérivés des modèles antérieurs de course de circulation ne peuvent pas être appliqués à la course de circulation postérieure. Par exemple, la fenêtre de temps de reperfusion pour la circulation antérieure a été étendue à 6 h, avec une petite partie des études s’étendant à 24 h sur la base des résultats d’imagerie⁹. Cependant, la fenêtre de temps pour la circulation postérieure peut être plus longue que 24 h, selon les rapports précédents¹⁰ et nos propres expériences cliniques. Cette fenêtre de temps de reperfusion allongée doit être étudiée et confirmée plus loin dans les modèles expérimentaux.

En ce qui concerne les accidents vasculaires cérébraux postérieurs, l’infarctus pontine est le sous-type le plus courant, représentant 7% de tous les cas d’AVC ischémique^11,12. Selon la topographie de l’infarctus, les infarctus pontines sont divisés en infarctus pontines isolés et non isolés¹³. Les infarctus isolés de pontine sont classés en trois types basés sur les mécanismes sous-jacents : la grande maladie d’artère (LAD), la maladie de branche basilaire d’artère (BABD), et la petite maladie d’artère (SAD). La connaissance des mécanismes, de la manifestation et du pronostic de l’infarctus pontine a été dérivée des investigations cliniques des cas¹⁴. Cependant, un modèle de rongeur imitant l’infarctus de pontine a été moins étudié.

Dans des études précédentes, la lésion diffuse de tegmentum de tronc cérébral impliquant les pons a été explorée⁷. Un groupe a tenté de créer un modèle d’infarctus pontine par ligature de l’artère basilaire (BA)¹⁵. Un autre groupe a utilisé une suture monofilament en nylon 10-0 pour lier sélectivement quatre points de la BA proximale sélectivement¹⁶. Ce modèle imite LAD, mais la plupart des infarctus pontines résultent de BABD et SAD. En outre, la ligature sélective de la BA est une chirurgie compliquée et a un taux de mortalité élevé.

Fourni ici est un protocole détaillé pour un modèle de rat facile à réaliser, facilement reproduit, et réussi de l’infarctus aigu pontine par stimulation électrique.

Protocole

Le protocole a été examiné et approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’institution du deuxième hôpital affilié de l’Université médicale de Guangzhou, un établissement accrédité par l’AAALACi. Les rats ont été fournis par le Centre animal de l’Université médicale du Sud.

1. Animal

1. Utiliser des rats mâles adultes Sprague-Dawley pesant 250 ± 10 g.
2. Lors du transport, loger les rats pendant au moins 1 semaine avant la chirurgie dans des conditions environnementales contrôlées avec une température ambiante de 25 °C, une humidité relative de 65%, et 12 h/12 h cycle clair/foncé.
3. Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum.

2. Établissement d’infarctus dans les pons

1. Peser les rats avant la chirurgie et évaluer les performances neurologiques selon les tests comportementaux décrits ci-dessous (section 3).
2. Préchauffer le coussin chauffant immédiatement avant l’anesthésie.
3. Attachez la perceuse crânienne au support sur le cadre stéréotaxique.
4. Intraperitoneally injecter les rats avec 50 mg/kg de kétamine et 5 mg/kg de xylazine. Vérifiez l’absence de réponse de pincement d’orteil.
5. Montez le rat sur le cadre stéréotaxique en position couchée. Placez les barres d’oreille au-dessus du conduit auditif pour fixer la tête. Assurez-vous que le crâne est maintenu à l’horizontale pour éviter tout biais de l’injection.
6. Maintenir l’anesthésie par isoflurane (100% oxygène, 2,5% isoflurane) via un attachement de cône de nez stéréotaxique pour les rats avec des ports d’entrée et de sortie. Maintenir la température à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant et surveiller la température tout au long de la procédure.
7. Utilisez l’onguent pour prévenir le séchage cornéen. Utilisez des forceps pour pincer légèrement les pattes pour s’assurer qu’il n’y a pas de réponse à la douleur.
8. Raser les cheveux du crâne avec un micro-rasoir. Appliquer le gommage chirurgical de la chlorhexidine de façon circulaire à partir du site d’incision chirurgicale et en tournant vers l’extérieur.
9. Faire une incision de 3 cm avec un scalpel de la ligne du canthus latéral bilatéral à 0,5 cm derrière la fontanelle postérieure, qui doit être marquée par un stylo marqueur chirurgical.
10. Utilisez un coton-tige pour enlever un sang.
11. Placez un morceau de ruban chirurgical placé de chaque côté du rabat de la peau pour exposer le cuir chevelu (figure 1).
12. Retirez doucement les tissus conjonctifs de l’os du crâne avec un coton-tige trempé dans 0,9% de NaCl. S’ils ne sont pas enlevés, les tissus conjonctifs seront pris dans la perceuse.
13. Identifiez le bregma. Choisissez le point central du bregma comme point d’origine et marquez-le à l’aide d’un stylo marqueur chirurgical noir à pointe fine.
14. Placer une perceuse à 6,0 mm AP, 2,0 mm ML (portée de 0,5 à 3,0 mm, figure 2A).
15. Effectuer la craniotomie (1 mm de diamètre) à l’aide d’une perceuse automatique. Procédez prudemment, car ce point est proche du sinus veineux.
16. Retirez la perceuse du cadre stéréotaxique.
17. Placez une sonde de 22 G avec une gaine isolée dans le cadre stéréotaxique (figure 3A). La pointe de la sonde doit être placée à 2 mm au-dessus de l’extrémité proximale de la gaine (figure 3A,B; Figure 2B).
18. S’assurer que la gaine pénètre dans le cerveau 7 mm (7 mm DV, figure 2B; Figure 1C).
19. Avancez la sonde le long de la gaine (Figure 1D) jusqu’à ce que la pointe de la sonde soit inférieure de 9 mm sous la surface du cerveau (figure 2D).
20. Connecter les électrodes à un stimulateur électrique (figure 3C). Connectez l’anode à la sonde comme indiqué dans la figure 1D. Connectez la cathode aux rats (habituellement à l’oreille des rats).
21. Allumez le stimulateur électrique et réglez les paramètres suivants : largeur d’impulsion unique = 4 050 ms; tension = 50 V; courant = 4 mA (figure 3C). Pendant la stimulation électrique, le rat affichera des tremblements. Dans cette étude, le dispositif n’a pas été allumé pour les rats de groupe témoin utilisés pour les essais comportementaux, MRI, et TTC.
22. Laissez la sonde en position pendant 5 min après la stimulation.
23. Retirez la sonde du cerveau (Figure 1F).
24. Utilisez du ciment osseux pour couvrir la craniotomie. Laisser sécher le ciment avant de se blesser.
25. Suturer la plaie avec des filaments de suture de polyamide 4-0. Après trois ou quatre stiches, égalité 2-1-1 noeuds chirurgicaux standard.
26. Injectez les rats avec de la pénicilline (0,25 mL, 80 UI dilué dans 4 mL de saline) intraperitoneally pour prévenir l’infection.
27. Injectez les rats sous-cutanéement avec du meloxicam à une dose de 2 mg/kg, puis répétez-le tous les 24 h.
28. Surveillez les rats toutes les 15 minutes jusqu’à ce qu’ils soient complètement éveillés et retournez-les dans la cage à l’aide d’un coussin chauffant. Fournir un accès gratuit à la nourriture et à l’eau jusqu’au sacrifice.
    NOTE : Toutes les procédures devraient suivre les principes chirurgicaux aseptiques. Avant l’opération, mettez un haut de gommage, un masque chirurgical et des gants stériles après un gommage chirurgical des mains. Maintenir le matériel de suture stérile dans le champ stérile en tout temps.

3. Tests comportementaux

1. Longa score¹⁷
   1. Placez les rats à la surface de la table.
   2. Scores records comme suit : 0 = aucun déficit neurologique; 1 = défaut d’étendre complètement la pattes avant contralatérale, un léger déficit neurologique focal; 2 = cercle vers la gauche, un déficit neurologique focal modéré; 3 = tomber à gauche, un grave déficit focal; 4 = pas de marche spontanée et un niveau de conscience déprimé.
2. Berderson marque¹⁸
   1. Tenez le rat par la queue et laissez les membres antérieurs tendre la main pour une table. Enregistrez les scores comme suit : 0 = les deux membres ont atteint la table; 1 = un seul membre atteint la table.
   2. Placer l’animal sur une surface rugueuse. Enregistrez les scores comme suit : 0 = une forte prise sur la surface rugueuse avec une bonne résistance lorsqu’il est poussé; 1 = une légère résistance que l’on ne voit que dans une patte; 2 = aucune résistance lorsqu’il est poussé dans une direction.
   3. Placez le rat dans une zone fermée (18 po × 36 po) et laissez-le se déplacer librement. Enregistrez les scores comme suit : 0 = marcher toute la longueur de l’enceinte sans tourner; 1 = marcher toute la longueur de l’enceinte avec le cercle; 2 = ne peut pas marcher sur toute la longueur de l’enceinte, mais peut tourner en rond; 3 = ne peut pas bouger beaucoup. Utiliser la somme des scores d’évaluation de chaque tâche comme note d’évaluation finale.
3. Essai de faisceau d’équilibre¹⁹
   1. Assurez-vous que l’appareil se compose d’un faisceau de 3 cm de large et de 70 cm de long et de 20 cm au-dessus du sol. Placez une boîte sombre à l’extrémité du faisceau avec une entrée étroite.
   2. Placez un générateur de bruit blanc et une source lumineuse au début du faisceau. Le bruit et la lumière ont été utilisés pour motiver le rat à traverser le faisceau et entrer dans la boîte de but.
   3. Terminez les stimuli lorsque les animaux entrent dans la boîte sombre. Enregistrez la latence pour atteindre la boîte de but (en secondes) et les performances postérieures du rat lors de la traversée du faisceau.
   4. Enregistrez les scores pour chaque performance comme suit : 0 = équilibres avec une posture stable; 1 = saisit le côté du faisceau; 2 = faisceau de câlins et 1 membre tombe de la poutre; 3 = faisceau de câlins et deux membres tombent du faisceau, ou tourne sur le faisceau après >60 s; 4 = tentatives d’équilibre sur le faisceau mais tombe après >40 s; 5 = tentatives d’équilibre sur le faisceau mais tombe après >20 s; et 6 = tombe, aucune tentative d’équilibrer ou de s’accrocher à la poutre après <20 s.
4. Essai somatosensoriel d’enlèvement adhésif²⁰
   1. Placez les rats dans une boîte en plexiglas claire et leur permettre d’explorer le nouvel environnement pendant 2 ou 3 min.
   2. Placez une étiquette adhésive de couleur verte de 10 mm de diamètre sur la surface intérieure de chaque membre antérieur au-dessus du pouce et sur le poignet.
   3. Retournez les rats dans la boîte de plexiglas.
   4. Enregistrez le temps pour le rat de retirer la première étiquette et toutes les autres étiquettes, respectivement. Laisser un maximum de 3 min. Le test doit être effectué 2x à l’entraînement.
5. Test de placement des membres
   1. Tenir les rats en position horizontale et empêcher les mouvements.
   2. Une fois que le rat perd le contact avec la surface de la table (mouvement passif des membres), appliquez des stimuli tactiles et proprioceptifs à la patte avec le bord de la table.
   3. Évaluer le placement de la patte (succès ou échec) sur le bord de la table.
   4. Enregistrez les scores comme suit : 0 = pas de placement; 0,5 = placement inachevé et/ou retardé; 1 = placement immédiat et complet.

4. Confirmation infarctus par IRM

1. Effectuer l’IRM 24 h après la chirurgie.
2. Anesthésier le rat par isoflurane (5% pour l’induction, 1%–1,5% pour l’entretien).
3. Fixer la tête de rat dans une bobine de réseau de cerveau de rat et combiné avec une bobine de volume de transmission seulement.
4. Placez la bobine et le rat dans le scanner IRM. Fixer le rat à l’intérieur du berceau à l’aide des barres de la dent et de l’oreille.
5. Maintenir la température corporelle à 37 °C ± 0,5 °C pendant la procédure de balayage IRM à l’aide d’une veste thermique en circuit fermé.
6. Utilisez une séquence pilote pour assurer une géométrie correcte.
7. Recueillir des analyses pondérées en T2 à l’aide d’une séquence d’écho à rotation rapide : temps d’écho (TE) = 33 ms; temps de répétition (TR) = 8 000 ms; champ de vision = 30 mm x 30 mm; matrice d’acquisition = 512 × 512; 50 tranches; 0,4 mm d’épaisseur.
8. Recueillir un balayage d’imagerie planaire à écho spin-écho à quatre coups : temps d’écho = 30,5 ms; temps de répétition = 8000 ms; matrice = 96 × 96; champ de vision = 25 mm x 25 mm; trois directions = x, y, z; Valeurs B = 0 1 000 s/mm² et 1 000 s/mm²; 50 tranches axiales contiguës; 0,4 mm d’épaisseur.
9. Retournez les rats dans la cage.

5. Confirmation infarctus par la coloration TTC

1. Sacrifiez les rats au moment de l’étude selon la conception expérimentale. Dans cette expérience, nous avons sacrifié les rats 24 h après la chirurgie.
2. Préparez une solution TTC de 2 % avant le sacrifice. Ajouter 0,2 g de poudre TTC au PBS de 10 mL 0,01 M (pH 7,4). Transférer la dilution dans un plat de 10 cm recouvert de papier argenté et préassemblé à 37 °C dans un bain d’eau.
3. Exposer le rat à 5% isoflurane jusqu’à la perte de conscience. Ensuite, exposer le rat au CO₂ (20%–30% du volume de la cage par minute) jusqu’à ce que la respiration a cessé, puis maintenir 2 min d’exposition au CO_2.
4. Utilisez les signes suivants pour confirmer la mort : pas de hausse et de chute de la poitrine, pas de battement de cœur palpable, mauvaise couleur muqueuse, pas de réponse à la pince aux orteils, changement de couleur ou d’opacité dans les yeux.
5. Effectuer une dislocation cervicale.
6. Sécurisez les animaux en tapant les pattes sur une plate-forme stérile. Créer une incision médiane de la clavicule à l’hypogastrium et une incision latérale du xiphoide vers la gauche le long de la cage thoracique. Faire une coupe dans le diaphragme aussi le long de la cage thoracique et une incision thorax ligne médiane pour exposer le cœur.
7. Connectez la pointe d’une aiguille (27 G) à une pompe à perfusion contenant 0,01 M PBS à 4 °C dans le ventricule gauche.
   REMARQUE : Avancez la pointe le long du bord gauche du ventricule pour éviter d’entrer dans l’atrium. Allumez la pompe de perfusion pour vous assurer que la pointe se trouve dans le ventricule gauche et coupez l’atrium droit. Si le liquide s’écoule de la narine, la pointe se trouve dans l’atrium et doit être ajustée ou réinsérée.
8. Utiliser environ 100 mL de 0,01 M PBS, maintenu à 4 °C pour la perfusion. Éteindre la pompe de perfusion jusqu’à ce que le foie devienne blanc.
9. Décapitez les rats et disséquez tout le cerveau à l’aide des ciseaux et des forceps. Retirez toute l’eau de la surface du cerveau avec du papier blotting.
10. Rangez le cerveau entier à -80 °C pendant 1 min (couper les sections du cerveau est plus facile après la congélation).
    REMARQUE : Cette étape peut être ignorée si les sections du cerveau peuvent être bien coupées sans geler.
11. Placez le cerveau dans la matrice avec le côté dorsal vers le haut.
12. Identifier le trou dans la surface du cerveau comme le montre la figure 1G et insérer une lame en acier inoxydable de 0,21 mm d’épaisseur. Habituellement, la plus grande zone d’infarctus se trouve dans le plan de la sonde; ainsi, une lame doit être insérée dans cette région.
13. Insérez les autres lames à un intervalle de 2 mm.
14. Retirez simultanément les lames, tout à la fois, de la matrice et placez l’ensemble du cerveau avec les lames dans la solution TTC dans le plat. Retirez soigneusement les lames.
    NOTE : Ici, les sections de cerveau n’ont pas été facilement enlevées du liquide parce qu’une certaine mater résiduelle de pia dans le cranii de base a interféré avec la sectionnement. Si des sections restent dans la matrice, utilisez une petite spatule pour les transférer dans le plat.
15. Placez le plat avec la solution TTC et les sections de cerveau dans un bain d’eau à 37 °C.
16. Vérifiez le plat toutes les 5 minutes et assurez-vous qu’il n’y a pas de chevauchement des sections.
17. Ajouter 10 mL de 4% de solution de paraformaldéhyde au plat pour mettre fin à la réaction TTC.
18. Orienter les sections du rostral au caudal et prendre des photos.

6. Statistiques

1. Utilisez un logiciel d’analyse statistique (p. ex., GraphPad Prism) pour effectuer le test tde l’élève.
   REMARQUE : Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SE. Les différences entre les groupes sont déterminées à l’aide des tests t-testsde l’élève à deux queues (p < 0,05 défini comme une signification statistique).

Résultats

Six animaux ont été soumis au protocole de chirurgie décrit ci-dessus. Le groupe témoin, tel qu’indiqué dans la figure 4, était composé de six rats. Les tranches cérébrales indiquées dans la figure 4 étaient dérivées d’un rat par groupe.

L’IRM a montré que l’infarctus était situé à la base des pons (figure 4A). Comme la sonde a été injectée de 2 mm à gauche de la ligne médian...

Discussion

La présente étude fournit un protocole pour générer un modèle aigu de rat d’infarctus de pontine. Ce modèle peut être utilisé pour la recherche sur le pronostic et la réadaptation (y compris la douleur chronique post-AVC) chez les patients atteints d’avc pontine.

Il existe plusieurs points forts de cette méthode. Tout d’abord, il fournit un modèle de rat de l’infarctus aigu pontine pour les études futures. Comme mentionné ci-dessus, l’infarctus pontine est un sous-type d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 sucture	Shanghai Jinzhong		Surgical instruments
Adhesive tape	Shanghai Jinzhong		Surgical instruments
Animal anesthesia system	RWD		Wear mask when using the system
Bone cement	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Cured clamp	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
General tissue scissors	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilization
Isoflurane	RWD	217181101
Lesion Making Device	Shanghai Yuyan		Making a lesion
MRI system	Bruker Biospin		Confirmation of infarction in vivo
Needle holder	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Probe	Anke		Need some modification
Q-tips	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Stereotaxic apparatus	RWD
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Tissue holding forcepts	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
TTC	Sigma-Aldrich	BCBW5177	For infarction confirmation in vitro