הקמת אוטם פונטינה חריפה בחולדות על ידי גירוי חשמלי

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לביסוס אוטם פונטינה חריף במודל חולדה באמצעות גירוי חשמלי עם פעימה אחת.

Abstract

אוטם פונטינה הוא תת-סוג השבץ הנפוץ ביותר במחזור הדם האחורי, בעוד שחסר מודל מכרסמים המחקה אוטם פונטינה. בתנאי כאן הוא פרוטוקול להקמת מודל חולדה בהצלחה של אוטם פונטינה חריפה. עכברושים במשקל של כ-250 גרם משמשים, ובדיקה עם נדן מבודד מוזרקת לסונים באמצעות מערכת סטריאוטקסית. פצע מיוצר על ידי גירוי חשמלי עם פעימה אחת. הציון של לונגה, הציון של בורדרסון, ובדיקת איזון הקורה משמשים להערכת גירעונות נוירולוגיים. בנוסף, בדיקת somatosensory להסרת דבק משמש כדי לקבוע את תפקוד sensorimotor, ואת בדיקת מיקום הגפיים משמש כדי להעריך proprioception. סריקות MRI משמשות לאחר מכן כדי להעריך את האוטם בvivio, וכתמים TTC משמש כדי לאשר את האוטם במבחנה. כאן, אוטם מוצלח מזוהה כי הוא ממוקם על בסיס anterolateral של פונים rostral. לסיכום, שיטה חדשה מתוארת כדי לבסס מודל אוטם פונטין חריפה חולדה.

Introduction

מאז שנות ה-80, דגם חסימת העורקים המוחיים האמצעי (MCAO) המושרה על ידי נימי סיליקון נמצא בשימוש נרחב במחקר שבץ בסיסי¹. שיטות אחרות (כלומר, תפירה של ענף אחד של MCA^{2 ואוטם} מוקד המושרה פוטוכימית) שימשו גם. מודלים אלה כבר כונה מודלים שבץ מבוססי MCA תרמו רבות לחקירות של מנגנונים פתופיזיולוגיים הבסיסיים שבץ וטיפולים פוטנציאליים. למרות שיש מגבלות של מודלים^{ניסיוניים אלה 3,4}, שיטות אלה שימשו מעבדות רבות^5,6. מודלים מבוססי MCA קו מייצגים קו במחזור הקדמי; עם זאת, כמה דיווחים חקרו מודלים מחקים שבץ במחזור האחורי⁷.

ישנם הבדלים משמעותיים בין האטיולוגיה, מנגנונים, ביטוי קליני, ופרוגנוזה בין משיכות זרימת הדם הקדמי והאחורי⁸. לכן, אין אפשרות להחיל את התוצאות הנגזרות מדגמי קו מחזור קדמיים על שבץ מחזור אחורי. לדוגמה, חלון זמן ההתרמה למחזור הקדמי הוארך ל- 6 שעות, עם חלק קטן של מחקרים המשתרעים עד 24 שעות בהתבסס על ממצאי^{הדמיה 9}. עם זאת, חלון הזמן למחזור הדם האחורי עשוי להיות ארוך יותר מ- 24 שעות, על פי דיווחים^{קודמים 10} וחוויות קליניות שלנו. חלון זמן התרעה מוארך זה חייב להיחקר ואושר נוסף במודלים ניסיוניים.

לגבי משיכות מחזור הדם האחורי, אוטם פונטינה הוא תת הסוג הנפוץ ביותר, מהווה 7% מכל מקרי שבץ איסכמי^11,12. על פי טופוגרפיה אוטם, אוטם פונטינה מחולקים אוטם פונטינה מבודד ולא מבודד¹³. אוטמי פונטינה מבודדים מסווגים לשלושה סוגים המבוססים על המנגנונים הבסיסיים: מחלת עורקים גדולים (LAD), מחלת ענף עורקים בסילאר (BABD) ומחלת עורקים קטנים (SAD). הידע על המנגנונים, הביטוי והאבחנה של אוטם פונטינה נגזר מחקירות קליניות של^{מקרים 14.} עם זאת, מודל מכרסמים מחקה אוטם פונטינה נחקר פחות.

במחקרים קודמים, לפזר את הפציעה של גזע המוח מעורבים פונים נחקר⁷. קבוצה אחת ניסתה ליצור מודל אוטם פונטינה באמצעות קשירה של עורק הבזיליקום (BA)¹⁵. קבוצה אחרת השתמשה בתפר מונופילמנט ניילון 10-0 כדי לתפור באופן סלקטיבי ארבע נקודות של BA proximal^{באופן סלקטיבי 16}. מודל זה מחקה LAD, אבל רוב אוטמי פונטינה נובעים BABD ו SAD. בנוסף, קשירה סלקטיבית של BA הוא ניתוח מסובך ויש לו שיעור מוות גבוה.

מסופק כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור קל לביצוע, בקלות לשכפל, ומודל חולדה מוצלח של אוטם פונטינה חריפה על ידי גירוי חשמלי.

Protocol

הפרוטוקול נבדק ואושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסד ושימוש של בית החולים המזוהה השני של האוניברסיטה הרפואית של גואנגג'ואו, מוסד מוכר על ידי AAALACi. החולדות סופקו על ידי מרכז בעלי החיים של האוניברסיטה הרפואית הדרומית.

1. בעלי חיים

1. השתמש זכר בוגר Sprague-Dawley חולדות במשקל 250 ± 10 גרם.
2. בעת ההובלה, להאוס את החולדות לפחות שבוע לפני הניתוח בתנאים סביבתיים מבוקרים עם טמפרטורת סביבה של 25 מעלות צלזיוס, לחות יחסית של 65%, ו 12 h /12 h / מחזור אור / כהה.
3. ספקו מזון ומים אד libitum.

2. הקמת אוטם בפונים

1. שקלו את החולדות לפני הניתוח והעריכו את הביצועים הנוירולוגיים בהתאם לבדיקות ההתנהגות המתוארות להלן (סעיף 3).
2. מחממים מראש את משטח החימום מיד לפני ההרדמה.
3. חבר את מקדחה הגולגולת למחזיק על המסגרת הסטריאו-קסית.
4. תוך-אפרטון להזריק את החולדות עם 50 מ"ג/ק"ג קטמין ו 5 מ"ג/ק"ג xylazine. בדוק אם אין תגובה לצביטת בהון.
5. הר העכברוש על המסגרת הסטריאו-קסית בתנוחה נוטה. מקם את הסורגים מעל תעלת האוזן כדי לאבטח את הראש. ודא כי הגולגולת נשמרת אופקית כדי למנוע כל הטיה של הזריקה.
6. לשמור על הרדמה על ידי isoflurane (100% חמצן, 2.5% איזופלוראן) באמצעות חיבור קונוס האף סטריאוטקסי עבור חולדות עם כניסת ויציאות שקע. לשמור על הטמפרטורה ב 37 מעלות צלזיוס באמצעות משטח חימום ולפקח על הטמפרטורה לאורך כל ההליך.
7. השתמש במשחה לעיניים כדי למנוע ייבוש קרנית. השתמש במגרסה כדי לצבוט מעט את כפות הרגליים כדי להבטיח שאין תגובה לכאב.
8. לגלח את השיער של הגולגולת עם גילוח מיקרו. למרוח קרצוף כירורגי כלורקסידין באופן מעגלי החל באתר החתך הכירורגי ומסתובב כלפי חוץ.
9. הפוך חתך 3 ס"מ קו האמצע עם אזמל מהקו של canthus לרוחב דו צדדי 0.5 ס"מ מאחורי fontanelle האחורי, אשר צריך להיות מסומן על ידי עט סמן כירורגי.
10. השתמש בספוגית כותנה כדי להסיר דם.
11. מניחים חתיכת סרט כירורגי מונחת על כל צד של דש העור כדי לחשוף את הקרקפת(איור 1).
12. הסר בעדינות את רקמות החיבור מעצם הגולגולת עם ספוגית כותנה טבולה ב-0.9% NaCl. אם לא יוסר, רקמות החיבור ייתפסו במקדחה.
13. זהה את ה"ברגמה". בחר את הנקודה המרכזית של bregma כ נקודת המוצא ולסמן אותו באמצעות עט סמן כירורגי שחור קצה.
14. מקם מקדחה ב- AP 6.0 מ"מ, 2.0 מ"מ מ"מ מ"ל (טווח של 0.5-3.0 מ"מ, איור 2A).
15. בצע פתיחת גולגולת (קוטר 1 מ"מ) באמצעות מקדחה אוטומטית. המשך בזהירות, כי נקודה זו קרובה לסינוסים הארסיים.
16. הסר את המקדחה מהמסגרת הסטריאו-קסית.
17. מניחים בדיקה 22 G עם נדן מבודד במסגרת סטריאוטקסית(איור 3A). קצה הגשוש צריך להיות ממוקם 2 מ"מ מעל הקצה הפרוקסימלי של הנדן (איור 3A,B; איור 2B).
18. ודא כי נדן נכנס למוח 7 מ"מ (7 מ"מ DV, איור 2B; איור 1C.
19. לקדם את הגשושלאורך נדן ( איור 1D) עד קצה הגשוש הוא 9 מ"מ מתחת לפני השטח של המוח(איור 2D).
20. חבר את האלקטרודות לממריץ חשמלי (איור 3C). חבר את האנודה לגשוש כפי שמצג באות 1D. חבר את הקתודה לחולדות (בדרך כלל לאוזן החולדות).
21. הפעל את הממריץ החשמלי והגדר את הפרמטרים הבאים: רוחב פולס יחיד = 4,050 ms; מתח = 50 V; וזרם = 4 mA (איור 3C). במהלך גירוי חשמלי, העכברוש יפגין רעד. במחקר זה, המכשיר לא היה מופעל עבור חולדות קבוצת בקרה המשמשות לבדיקות התנהגותיות, MRI, ו TTC.
22. השאר את הגשוש בעמדה למשך 5 דקות לאחר הגירוי.
23. הסר את הגשוש מהמוח(איור 1F).
24. השתמש במלט עצם כדי לכסות את פתיחת הגולגולת. תן למלט להתייבש לפני תפירת הפצע.
25. תפר את הפצע עם 4-0 פוליאמיד תפרים. לאחר שלושה או ארבעה stiches, תיקו 2-1-1 קשרים כירורגיים סטנדרטיים.
26. להזריק את החולדות עם פניצילין (0.25 מ"ל, 80 IU מדולל ב 4 מ"ל של תמיסת מלח) תוך-אפרטון כדי למנוע זיהום.
27. להזריק את החולדות תת עורית עם מלוקסיאם במינון של 2 מ"ג/ק"ג ולאחר מכן לחזור על זה כל 24 שעות.
28. נטרו את החולדות כל 15 דקות עד שהם ערים לגמרי והחזירו אותם לכלוב עם משטח חימום. גישה חופשית למזון ומים עד להקרבה.
    הערה: כל ההליכים צריכים לפעול על פי העקרונות הכירורגיים האפטיים. לפני הניתוח, ללבוש חולצה, מסכה כירורגית וכפפות סטריליות לאחר קרצוף כירורגי של הידיים. לשמור על חומר תפר סטרילי בתוך השדה סטרילי בכל עת.

3. בדיקות התנהגותיות

1. ציון לונגה¹⁷
   1. מניחים את החולדות על פני השולחן.
   2. שיא ציונים כדלקמן: 0 = אין גירעון נוירולוגי; 1 = אי הארכה מלאה של תחכום פנים, גירעון נוירולוגי מוקד מתון; 2 = חג שמאלה, גירעון נוירולוגי מוקד מתון; 3 = נפילה שמאלה, גירעון מוקד חמור; 4 = אין הליכה ספונטנית ורמה מדוכאת של תודעה.
2. ברדרסון ציון¹⁸
   1. החזיקו את העכברוש בזנב ותנו למברות להגיע לשולחן. רטו את הציונים כדלקמן: 0 = שני הגפיים הגיעו לטבלה; 1 = רק איבר אחד מגיע לשולחן.
   2. מניחים את החיה על משטח מחוספס. להקליט את הציונים כדלקמן: 0 = אחיזה חזקה על פני השטח מחוספס עם התנגדות טובה כאשר דחף; 1 = התנגדות קלה לראות רק בכף רגל אחת; 2 = אין התנגדות כאשר דחף בכיוון אחד.
   3. מניחים את החולדה באזור סגור (18 ב - 36 אינם) ומאפשרים לו לשוטט בחופשיות. להקליט את הציונים כדלקמן: 0 = ללכת את כל אורך המתחם מבלי להקיף; 1 = ללכת לאורך כל המתחם עם הקיף; 2 = לא יכול ללכת לאורך המארז אבל יכול להקיף; 3 = לא יכול לזוז הרבה. השתמש בסכום ציוני ההערכה מכל פעילות כציון ההערכה הסופי.
3. מבחן קרן איזון¹⁹
   1. ודא כי ההתאגות מורכבת 3 ס"מ רוחב ו 70 ס"מ אורך קרן והוא 20 ס"מ מעל הרצפה. מניחים קופסה חשוכה בקצה הרחוק של הקרן עם כניסה צרה.
   2. מקם מחולל רעשים לבנים ומקור אור בהיר בתחילת הקרן. הרעש והאור שימשו כדי להניע את העכברוש לחצות את הקרן ולהיכנס לתיאור השער.
   3. סיים את הגירויים כאשר בעלי החיים נכנסים לקופסה החשוכה. להקליט את ההשתיה כדי להגיע לתייב השער (בשניות) וביצועים אחוריים של העכברוש בעת חציית הקרן.
   4. להקליט את הציונים עבור כל ביצועים כדלקמן: 0 = יתרות עם יציבה יציבה; 1 = תופס את הצד של קרן; 2 = חיבוקים קרן 1 איבר נופל מקרן; 3 = חיבוקים קרן ושני גפיים ליפול קרן, או ספינים על קורה אחרי >60 s; 4 = מנסה לאזן על קרן אבל נופל לאחר >40 s; 5 = מנסה לאזן על קרן אבל נופל לאחר >20 s; ו- 6 = נופל, אין ניסיון לאזן או להיאחז בקרן לאחר <20 s.
4. הסרת דבק somatosensory מבחן²⁰
   1. מניחים את החולדות בתיבת פרספקס ברורה ולאפשר להם לחקור את הסביבה החדשה במשך 2 או 3 דקות.
   2. מניחים תווית דבק בצבע ירוק בקוטר 10 מ"מ על המשטח הפנימי של כל תכלית מעל האגודל ועל פרק כף היד.
   3. החזר את החולדות לקופסת הזכוכית.
   4. הקלט את הזמן עבור העכברוש להסיר את התווית הראשונה ואת כל התוויות האחרות, בהתאמה. אפשר מקסימום של 3 דקות. המבחן צריך להיערך 2x באימונים.
5. בדיקת מיקום גפיים
   1. החזק את החולדות בתנוחה אופקית ומנע תנועה.
   2. ברגע שהעכברוש מאבד קשר עם משטח השולחן (תנועת גפיים פסיבית), למרוח גירויים מישוש וproproceptive על כף הרגל עם קצה השולחן.
   3. להעריך את מיקום כף הרגל (הצלחה או כישלון) על קצה השולחן.
   4. רמת את הציונים כדלקמן: 0 = אין מיקום; 0.5 = מיקום לא גמור ו/או מושהה; 1 = מיקום מיידי ושלם.

4. אישור אוטם על ידי MRI

1. בצע את סריקת ה-MRI 24 שעות לאחר הניתוח.
2. להניח את החולדה על ידי isoflurane (5% עבור אינדוקציה, 1%-1.5% עבור תחזוקה).
3. אבטחו את ראש העכברוש בסיליל מערך מוח של חולדות ובשילוב עם אסיל נפח של שידור בלבד.
4. שים את הבוליל ואת העכברוש בסורק ה-MRI. אבטחו את העכברוש בתוך העריסה בעזרת הסורגים בשיניים ובאוזניות.
5. שמור על טמפרטורת הגוף ב- 37°C ± 0.5°C במהלך תהליך סריקת ה-MRI באמצעות ז'קט תרמי במעגל סגור.
6. השתמש ברצף טייס כדי להבטיח גיאומטריה נכונה.
7. אסוף סריקות משוקללות T2 באמצעות רצף הד ספין מהיר: זמן הד (TE) = 33 ms; זמן חזרה (TR) = 8,000 ms; שדה תצוגה = 30 מ"מ x 30 מ"מ; מטריצת רכישה = 512 × 512; 50 פרוסות; בעובי 0.4 מ"מ.
8. לאסוף ארבע ירה ספין-אקו הדמיה dWI סריקות: זמן הד = 30.5 ms; זמן חזרה = 8000 ms; מטריקס = 96 × 96; שדה תצוגה = 25 מ"מ x 25 מ"מ; שלושה כיוונים = x, y, z; ערכי B = 0 1,000 s/mm² ו- 1,000 s/mm²; 50 פרוסות חד-כיסיות רציפות; בעובי 0.4 מ"מ.
9. החזר את החולדות לכלוב.

5. אישור אוטם על ידי כתם TTC

1. להקריב את החולדות בנקודת הזמן על פי העיצוב הניסיוני. בניסוי הזה, הקרבנו את החולדות 24 שעות לאחר הניתוח.
2. הכן פתרון TTC של 2% לפני ההקרבה. הוסף 0.2 גרם אבקת TTC ל-10 מ"ל PBS 0.01 M (pH 7.4). מעבירים את דילול לצלחת של 10 ס"מ מכוסה בנייר כסף ומותאם מראש ל-37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
3. לחשוף את החולדה ל5% isoflurane עד אובדן הכרה. לאחר מכן, לחשוף את העכברוש CO₂ (20%-30% מנפח הכלוב לפחות) עד נשימה נעצרה, ולאחר מכן לשמור על 2 דקות של חשיפה CO_2.
4. השתמש בסימנים הבאים כדי לאשר את המוות: אין עלייה ונפילה של החזה, אין דופק מוחשי, צבע ממברנה רירי עני, אין תגובה לצביטת בהון, שינוי צבע או אטימות בעיניים.
5. לבצע נקע בצוואר הרחם.
6. לאבטח את החיות על ידי הדבקת כפות על פלטפורמה סטרילית. ליצור חתך קו אמצע מעצם הבריח כדי hypogastrium וחתך רוחבי מן xiphoid שמאלה לאורך בית החזה. לעשות חתך בסרעפת גם לאורך בית החזה וחתך קו אמצע בית החזה כדי לחשוף את הלב.
7. חבר את קצה המחט (27 G) למשאבת זביה המכילה PBS 0.01 M ב- 4 °C בחדר השמאלי.
   הערה: הקדם את הקצה לאורך הקצה השמאלי של החדר כדי להימנע מכניסה לאטריום. הפעל את משאבת התבה כדי לוודא שהקצה נמצא בחדר השמאלי וחותכים את האטריום הימני. אם נוזל מתנקז מהנוריל, הקצה נמצא באטריום ויש לכוונן אותו או להכנסתו מחדש.
8. השתמש בכ- 100 מ"ל של 0.01 M PBS, מתוחזק ב- 4 °C עבור עירוי. כבה את משאבת העירוי עד שהכבד יהפוך ללבן.
9. ערפו את ראשם של החולדות ותתמדו את כל המוח באמצעות המספריים והמרטיות. הסר את כל המים מפני השטח של המוח עם נייר כתמים.
10. לאחסן את המוח כולו ב -80 °C במשך 1 דקות (חיתוך קטעים במוח קל יותר לאחר הקפאה).
    הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם ניתן לחתוך היטב את מקטעי המוח מבלי להקפיא.
11. מניחים את המוח במטריצה עם הגב למעלה.
12. זהה את החור במשטח המוח כפי שהוצג בדמות 1G והכנס להב בעובי 0.21 מ"מ מפלדת אל-חלד. בדרך כלל, האזור הגדול ביותר של אוטם הוא במטוס של הגשוש; לכן, יש להכניס להב אחד לאזור זה.
13. הכנס את הלהבים האחרים במרווח של 2 מ"מ.
14. בו זמנית להסיר את הלהבים, בבת אחת, מהמטריקס ולמקם את כל המוח עם הלהבים בתמיסת TTC בצלחת. הסר את הלהבים בזהירות.
    הערה: כאן, מקטעים במוח לא הוסרו בקלות מן הנוזל כי כמה שאריות פיא מאטר על בסיס cranii הפריע למקטע. אם חלקים כלשהם נשארים במטריקס, השתמשו במיתית קטנה כדי להעביר אותם לצלחת.
15. מניחים את המנה עם תמיסת TTC וקטעי מוח באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס.
16. בדוק את המנה כל 5 דקות ולוודא שאין חפיפה של מקטעים.
17. להוסיף 10 מ"ל של 4% תמיסת paraformaldehyde לצלחת כדי לסיים את תגובת TTC.
18. כוון את החלקים מהרוזסטרל לcaudal ולצלם.

6. סטטיסטיקה

1. השתמש בתוכנה לניתוח סטטיסטי (לדוגמה, מנסרה של GraphPad) כדי לבצע בדיקת tשל סטודנט.
   הערה: כל הנתונים מבוטאים כ-mean ± SE. ההבדלים בין קבוצות נקבעים עם -בדיקות tשל תלמיד דו-זנב (p < 0.05 המוגדרות כמשמעות סטטיסטית).

תוצאות

שש חיות היו נתונות לפרוטוקול הניתוח שתואר לעיל. קבוצת הביקורת כפי ש המוצגת באות 4 כללה שישה חולדות. פרוסות המוח המוצגות בדמות 4 נגזרו מחולדה אחת לכל קבוצה.

סריקת ה-MRI הראתה כי האוטם היה ממוקם על בסיס הפוני(איור 4א). מאז הגשוש הוזר...

Discussion

המחקר הנוכחי מספק פרוטוקול ליצירת מודל עכברוש אוטם פונטינה חריפה. מודל זה יכול לשמש למחקר על פרוגנוזה ושיקום (כולל כאב כרוני לאחר שבץ) בחולים שבץ פונטינה.

ישנן מספר נקודות חוזק של שיטה זו. ראשית, הוא מספק מודל חולדה של אוטם פונטינה חריפה עבור מחקרים עתידיים. כאמור, אוטם פונטי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 sucture	Shanghai Jinzhong		Surgical instruments
Adhesive tape	Shanghai Jinzhong		Surgical instruments
Animal anesthesia system	RWD		Wear mask when using the system
Bone cement	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Cured clamp	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
General tissue scissors	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilization
Isoflurane	RWD	217181101
Lesion Making Device	Shanghai Yuyan		Making a lesion
MRI system	Bruker Biospin		Confirmation of infarction in vivo
Needle holder	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Probe	Anke		Need some modification
Q-tips	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Stereotaxic apparatus	RWD
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Tissue holding forcepts	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
TTC	Sigma-Aldrich	BCBW5177	For infarction confirmation in vitro