Elektrikstimülasyon ile Sıçanlarda Akut Pontin Enfarktüsü Kurulması

Özet

Burada sunulan tek bir darbe ile elektrikstimülasyon yoluyla bir sıçan modelinde akut pontin enfarktüsü kurmak için bir protokoldür.

Özet

Pontin enfarktüsü posterior sirkülasyonda en sık görülen inme alt tipidir, pontin enfarktüsü taklit eden bir kemirgen modeli yoktur. Burada sağlanan başarılı akut pontin enfarktüsü bir sıçan modeli kurmak için bir protokoldür. Yaklaşık 250 g ağırlığındaki sıçanlar kullanılır ve stereotaksik bir aparat kullanılarak ponlara yalıtımlı kılıflı bir sonda enjekte edilir. Bir lezyon tek bir darbe ile elektriksel stimülasyon tarafından üretilir. Longa skoru, Berderson skoru ve ışın dengesi testi nörolojik açıkları değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, sensorimotor fonksiyonu belirlemek için yapıştırıcı kaldırma somatosensoriyel test kullanılır ve ekstremite yerleştirme testi propriosepsiyon değerlendirmek için kullanılır. MRG taramaları daha sonra in vivo inentüsiyi değerlendirmek için kullanılır ve TTC boyama in vitro enfarktüsü doğrulamak için kullanılır. Burada, rostral pons anterolateral temelinde bulunan başarılı bir enfarktüs tanımlanır. Sonuç olarak, yeni bir yöntem akut pontin enfarktüs sıçan modeli kurmak için açıklanmıştır.

Giriş

1980'li yıllardan bu yana, silikon filamentler tarafından indüklenen orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli yaygın temel inme araştırma¹kullanılmıştır. Diğer yöntemler (örneğin, MCA^2'nin bir dalının dikemi ve fotokimyasal indüklenen fokal enfarktüs) de kullanılmıştır. Bu modeller MCA tabanlı inme modelleri olarak adlandırılmıştır ve inmenin altında yatan patofizyolojik mekanizmaların ve potansiyel terapötiklerin araştırılmasına büyük katkıda bulunmuştur. Bu deneysel modellerin sınırlamaları olmasına rağmen^3,4, Bu yöntemler birçok laboratuvarlarda kullanılmıştır^5,6. MCA tabanlı inme modelleri ön sirkülasyonda bir inme temsil; ancak, birkaç rapor arka dolaşımda inme taklit modelleri araştırdık⁷.

Anterior ve posterior dolaşım inmeleri arasında etyoloji, mekanizmalar, klinik bulgular ve prognoz arasında anlamlı farklılıklar vardır⁸. Bu nedenle, ön sirkülasyon inme modellerinden elde edilen sonuçlar posterior dolaşım inme uygulanamaz. Örneğin, ön sirkülasyon için reperfüzyon süresi 6 saate uzatıldı, çalışmaların küçük bir kısmı görüntüleme bulgularına göre 24 saate kadar uzatıldı^9. Ancak, posterior dolaşım için zaman penceresi daha uzun olabilir 24 saat, önceki raporlara göre¹⁰ ve kendi klinik deneyimleri. Bu uzatılmış reperfüzyon süresi daha fazla çalışılmış ve deneysel modellerde teyit edilmelidir.

Posterior dolaşım inmeleri ile ilgili olarak, pontin enfarktüsü en sık görülen alt tiptir, tüm iskemik inme olgularının %7'sini oluşturan^11,12. Enfarktüs topografisine göre pontin enfarktüsü izole ve izole olmayan pontin enfarktüsleri¹³olarak ikiye ayrılır. İzole pontin enfarktüsleri altta yatan mekanizmalara göre üç tipe ayrılır: büyük arter hastalığı (LAD), baziler arter dal hastalığı (BABD) ve küçük arter hastalığı (SAD). Pontin enfarktüsünün mekanizmaları, bulguları ve prognozu hakkında bilgi olguların klinik araştırmalarından elde edilmiştir¹⁴. Ancak pontin enfarktüsü taklit eden bir kemirgen modeli daha az araştırılmıştır.

Önceki çalışmalarda, pons içeren diffüz beyin sapı tegmentum yaralanma^{araştırılmıştır 7}. Bir grup baziler arter ligasyonu ile pontin enfarktüs modeli oluşturmak için çalıştı (BA)¹⁵. Başka bir grup seçici proksimal BA seçici¹⁶dört nokta ligate için 10-0 naylon monofilament sütür kullanılır. Bu model LAD taklit, ancak en pontin enfarktüsBABD ve SAD sonucu. Buna ek olarak, BA seçici ligasyon karmaşık bir cerrahi ve yüksek ölüm oranına sahiptir.

Burada sağlanan elektrik stimülasyon ile akut pontin enfarktüsü kolay, kolayca çoğaltılabilir ve başarılı bir sıçan modeli için ayrıntılı bir protokoldür.

Protokol

Protokol, AAALACi tarafından akredite edilmiş bir kurum olan Guangzhou Tıp Üniversitesi İkinci Bağlı Hastanesi'nin Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı. Fareler, Güney Tıp Üniversitesi Hayvan Merkezi tarafından sağlandı.

1. Hayvan

1. 250 ± 10 g ağırlığında yetişkin erkek Sprague-Dawley sıçanları kullanın.
2. Taşıma sırasında fareleri ameliyattan en az 1 hafta önce 25 °C ortam sıcaklığı, bağıl nem oranı %65 ve 12 h/12 h ışık/karanlık döngüsü ile kontrollü çevre koşullarında barındırır.
3. Gıda ve su reklam libitumsağlayın.

2. Ponlarda enfarktüs kurulması

1. Ameliyattan önce sıçanları tartın ve aşağıda açıklanan davranıştestlerine göre nörolojik performansı değerlendirin (bölüm 3).
2. Isıtıcı yastığı anesteziden hemen önce ısıtın.
3. Kafatası matkabını stereotaksik çerçeveüzerindeki tutucuya takın.
4. İntraperitoneally 50 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg ksilazin ile sıçan enjekte. Parmak kıstırması yanıtı eksikliği olup olmadığını kontrol edin.
5. Fareyi stereotaksik çerçeveye yatkın bir pozisyonda monte edin. BaşGüvenliğini sağlamak için kulak çubuklarını kulak kanalının üzerine yerleştirin. Enjeksiyonun herhangi bir eğriliğini önlemek için kafatasının yatay tutulduğundan emin olun.
6. Giriş ve çıkış portu olan sıçanlar için stereotaksik burun konisi eki ile isoflurane (%100 oksijen, %2.5 izofluran) ile anesteziyi koruyun. Isıtma yastığı kullanarak sıcaklığı 37 °C'de koruyun ve prosedür boyunca sıcaklığı izleyin.
7. Korneanın kurumasını önlemek için göz merhemini kullanın. Ağrı tepkisi olmadığından emin olmak için pençeleri hafifçe çimdiklemek için forceps kullanın.
8. Kafatasının saçını mikro tıraş makinesiyle tıraş edin. Klorheksidin cerrahi scrub'ı cerrahi kesi alanından başlayıp dışa doğru dönerek dairesel bir şekilde uygulayın.
9. Bir cerrahi marker kalem ile işaretlenmiş olmalıdır posterior fontanelle arkasında 0,5 cm bilateral lateral kanthus çizgisinden bir neşter ile 3 cm orta hat kesi olun.
10. Bir kan kaldırmak için bir pamuklu bez kullanın.
11. Kafa derisini ortaya çıkarmak için deri kapağının her iki tarafına yerleştirilen bir parça cerrahi bant yerleştirin (Şekil 1).
12. Hafifçe% 0.9 NaCl batırılmış bir pamuklu bez ile kafatası kemiğinden bağ dokuları çıkarın. Kaldırılmazsa, bağ dokuları matkapta yakalanır.
13. Bregma'yı tanımlayın. Başlangıç noktası olarak bregma merkezi noktası seçti ve ince uçlu siyah cerrahi marker kalem kullanarak işaretleyin.
14. 6,0 mm AP, 2,0 mm ML (0,5-3,0 mm arasında değişen, Şekil 2A)bir matkap yerleştirin.
15. Otomatik matkap kullanarak kraniyotomi (1 mm çapında) gerçekleştirin. Bu nokta venöz sinüs yakın olduğu için, dikkatli bir şekilde devam edin.
16. Delkabı stereotaksik çerçeveden çıkarın.
17. Stereotaksik çerçeveye yalıtımlı kılıflı 22 G probu yerleştirin(Şekil 3A). Probun ucu kılıfın proksimal ucundan 2 mm yukarı yerleştirilmelidir(Şekil 3A,B; Şekil 2B).
18. Kılıfın beyne 7 mm (7 mm DV, Şekil 2B; Şekil 1C).
19. Sondanın ucu beyin yüzeyinin 9 mm altında olana kadar probu kılıf boyunca(Şekil 1D)ilerletin(Şekil 2D).
20. Elektrotları bir elektrik stimülatörüne bağlayın(Şekil 3C). Anoşu Şekil 1D'degösterildiği gibi sondaya bağlayın. Katot fareler (genellikle sıçanların kulağına) bağlayın.
21. Elektriksi uyaranını açın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: tek darbe genişliği = 4.050 ms; gerilim = 50 V; ve akım = 4 mA (Şekil 3C). Elektriksel stimülasyon sırasında, sıçan titreme sergileyecek. Bu çalışmada, davranış testleri, MRG ve TTC için kullanılan kontrol grubu sıçanlar için cihaz açık değildi.
22. Uyarıldıktan sonra probu 5 dk pozisyonda bırakın.
23. Sondayı beyinden çıkarın (Şekil 1F).
24. Kraniyotomi yi örtmek için kemik çimentosu kullanın. Yara dikiş önce çimento kurumasını bekleyin.
25. Yarayı 4-0 poliamid dikiş filamentleriyle dikin. Üç veya dört stiches sonra, kravat 2-1-1 standart cerrahi düğüm.
26. İnfeksiyonu önlemek için sıçanlara penisilin (0.25 mL, 4 mL tuzlu suda seyreltilmiş 80 IU) enjekte edin.
27. Sıçanlara 2 mg/kg dozda meloksikam enjekte edin ve 24 saatte bir tekrarlayın.
28. Tamamen uyanana kadar her 15 dakikada bir fareleri izleyin ve bir ısıtma yastığı ile kafese geri dönün. Kurban edinene kadar yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlayın.
    NOT: Tüm işlemler aseptik cerrahi ilkelere uymalıdır. Ameliyattan önce, bir scrub üst, cerrahi maske ve steril eldiven ellerin cerrahi scrub sonra koymak. Steril dikiş malzemesini steril alan içinde her zaman koruyun.

3. Davranış testleri

1. Longa skoru¹⁷
   1. Fareleri masanın yüzeyine yerleştirin.
   2. Aşağıdaki gibi rekor skorlar: 0 = hiçbir nörolojik eksikliği; 1 = tam kontralateral forepaw uzatmak için başarısızlık, hafif bir fokal nörolojik açık; 2 = sola daire, orta odak nörolojik açık; 3 = sola düşme, ciddi bir odak açığı; 4 = hiçbir spontan yürüyüş ve bilinç depresif düzeyi.
2. Berderson puan¹⁸
   1. Sıçanı kuyruğundan tut ve ön ayakların bir masaya uzanmasına izin ver. Puanları aşağıdaki gibi kaydedin: 0 = her iki uzuv tabloya ulaştı; 1 = sadece bir uzuv tabloya ulaşır.
   2. Hayvanı pürüzlü bir yüzeye yerleştirin. Puanları aşağıdaki gibi kaydedin: 0 = itildiğinde iyi bir direnç ile pürüzlü yüzeyüzerinde güçlü bir kavrama; 1 = sadece bir pençe görülen hafif bir direnç; 2 = tek bir yöne itildiğinde direnç yok.
   3. Kapalı bir alanda sıçan yerleştirin (18 × 36 içinde) ve serbestçe dolaşmak için izin. Puanları aşağıdaki gibi kaydedin: 0 = daire çizmeden kasanın tüm uzunluğu boyunca yürüyün; 1 = daire ile muhafaza tüm uzunluğu yürümek; 2 = muhafaza uzunluğu yürüyemez ama daire olabilir; 3 = çok hareket edemez. Her görevin değerlendirme puanlarının toplamını son değerlendirme puanı olarak kullanın.
3. Denge ışını testi¹⁹
   1. Cihazın 3 cm genişliğinde ve 70 cm uzunluğunda bir kirişden oluştuğundan ve yerden 20 cm yukarıda olduğundan emin olun. Dar bir giriş ile kirişin uzak ucuna koyu bir kutu yerleştirin.
   2. Kirişin başlangıcına beyaz bir gürültü jeneratörü ve parlak ışık kaynağı yerleştirin. Gürültü ve ışık, fareyi Kirişi geçmeye ve kale kutusuna girmeye motive etmek için kullanıldı.
   3. Hayvanlar karanlık kutuya girdiğinde uyaranları sonlandırın. Hedef kutusuna ulaşmak için gecikmeyi kaydedin (saniye cinsinden) ve Kirişi geçerken farenin ekuz performansını engelleyin.
   4. Her performans için puanları aşağıdaki gibi kaydedin: 0 = sabit duruş ile dengeler; 1 = Kirişin yan tarafını kavrar; 2 = hugs Kiriş ve 1 ekstremite kiriş düşer; 3 = sarılma demeti ve iki uzuv kiriş düşmek, ya da >60 s sonra kiriş üzerinde döner; 4 = Işın üzerinde denge çalışır ama sonra düşer >40 s; 5 = Işın üzerinde denge çalışır ama sonra düşer >20 s; ve 6 = düşer, dengelemek veya <20 s sonra ışın üzerine tutunmak için hiçbir girişim.
4. Yapışkan kaldırma somatosensoriyel test²⁰
   1. Fareleri açık bir pleksiglas kutuya yerleştirin ve 2 veya 3 dakika boyunca yeni ortamı keşfetmelerine izin verin.
   2. Her forelimb'in iç yüzeyine başparmak ve bilek üzerinde 10 mm çapında yeşil renkli yapışkan etiket yerleştirin.
   3. Fareleri pleksiglas kutuya geri ver.
   4. Farenin sırasıyla ilk etiketi ve diğer tüm etiketleri kaldırması için gereken süreyi kaydedin. En fazla 3 dk bekleyin. Test eğitimde 2x yapılmalıdır.
5. Ekstremite yerleştirme testi
   1. Sıçanları yatay bir pozisyonda tutun ve hareketi önleyin.
   2. Sıçan masa yüzeyi (pasif ekstremite hareketi) ile teması kaybettiğinde, masa kenarı ile pençeye dokunsal ve proprioseptif uyaranları uygulayın.
   3. Pençenin (başarı veya başarısız) masa kenarına yerleştirilmesini değerlendirin.
   4. Puanları aşağıdaki gibi kaydedin: 0 = yer yok; 0.5 = bitmemiş ve/veya gecikmiş yerleşim; 1 = hemen ve tam yerleştirme.

4. MRG ile enfarkt onayı

1. Ameliyattan 24 saat sonra MRI taraması yapın.
2. Isofluran ile sıçan anestezik (indüksiyon için% 5, bakım için% 1-1.5).
3. Fare kafasını fare beyin dizi bobinine sabitle ve sadece iletim hacmi bobiniyle birleştirin.
4. Bobini ve sıçanı MR Tarayıcısı'na yerleştirin. Diş ve kulak çubuklarını kullanarak fareyi beşiğin içinde sabitle.
5. MR tarama işlemi sırasında kapalı devre termal ceket kullanarak vücut ısısını 37 °C ± 0,5 °C'de koruyun.
6. Doğru geometriyi sağlamak için bir pilot sıra kullanın.
7. Hızlı dönüş yankı dizisi kullanarak T2 ağırlıklı taramaları toplayın: yankı süresi (TE) = 33 ms; tekrarlama süresi (TR) = 8.000 ms; görüş alanı = 30 mm x 30 mm; edinme matrisi = 512 × 512; 50 dilim; 0.4 mm kalınlığında.
8. Dört çekimspin-echo düzlemsel görüntüleme DWI taramaları toplamak: yankı süresi = 30.5 ms; tekrarlama süresi = 8000 ms; matris = 96 × 96; görüş alanı = 25 mm x 25 mm; üç yön = x, y, z; B değerleri = 0 1.000 s/mm² ve 1.000 s/mm^2; 50 bitişik eksenel dilim; 0.4 mm kalınlığında.
9. Fareleri kafese geri ver.

5. TTC boyama ile enfarkt onayı

1. Fareleri deneysel tasarıma göre zaman noktasında kurban edin. Bu deneyde, fareleri ameliyattan 24 saat sonra kurban ettik.
2. Kurban etmeden önce %2'lik bir TTC çözeltisi hazırlayın. 10 mL 0,01 M PBS'ye 0,2 g TTC tozu ekleyin (pH 7,4). Seyreltme gümüş kağıt la kaplı ve bir su banyosunda 37 °C önceden ısıtılmış bir 10 cm çanak aktarın.
3. Bilinç kaybına kadar sıçanı %5 isoflurane maruz bırak. Daha sonra, solunum durana kadar fareyi CO_2'ye (her dakika kafeshacminin %20-%30'u) maruz bırakın, ardından 2 dk CO₂ maruziyetini koruyun.
4. Ölümü onaylamak için aşağıdaki işaretleri kullanın: göğüste yükselme ve düşme yok, hissedilir kalp atışı yok, kötü mukoza rengi, ayak ucutuya yanıt yok, renk değişikliği veya gözlerde opaklık yok.
5. Servikal çıkığı gerçekleştirin.
6. Steril bir platform üzerinde pençeleri bantlayarak hayvanları güvenli. Köprücük kemiğinden hipogastriuma orta hat kesisi ve göğüs kafesi boyunca sola ksifoidden lateral bir kesi oluşturun. Göğüs kafesi boyunca diyafram da bir kesim ve kalp ortaya çıkarmak için bir toraks orta hat kesi olun.
7. İğneucunu (27 G) sol ventrikülde 4 °C'de 0,01 M PBS içeren bir perfüzyon pompasına bağlayın.
   NOT: Atriyuma girmemek için ucu ventrikülün sol kenarı boyunca ilerletin. Ucun sol ventrikülde olduğundan emin olmak için perfüzyon pompasını açın ve sağ atriyumu kesin. Burun deliğinden sıvı boşalırsa, uç atriyumdadır ve ayarlanması veya yeniden takılması gerekir.
8. Perfüzyon için 4 °C'de tutulan 0,01 M PBS'nin yaklaşık 100 mL'sini kullanın. Karaciğer beyaza dönene kadar perfüzyon pompasını kapatın.
9. Farelerin kafasını kes ve makas ve forceps kullanarak tüm beyinleri parçala. Lekeleme kağıdı ile beyin yüzeyinden herhangi bir su çıkarın.
10. Tüm beyni 1 dk boyunca -80 °C'de saklayın (donduktan sonra beyin kesitlerini kesmek daha kolaydır).
    NOT: Beyin bölümleri donmadan iyi kesilebiliyorsa bu adım atlanabilir.
11. Beyin kadar dorsal tarafı ile matris içine beyin yerleştirin.
12. Şekil 1G'de gösterildiği gibi beyin yüzeyindeki deliği tanımlayın ve 0,21 mm kalınlığında paslanmaz çelik bir bıçak takın. Genellikle enfarktüs en büyük alanı sonda düzlemindedir; bu nedenle, bir bıçak bu bölgeye takılmalıdır.
13. Diğer bıçakları 2 mm aralıkla takın.
14. Aynı anda bıçakları bir seferde matristen çıkarın ve tüm beyni ttc çözeltisindeki bıçaklarla çanakta yerleştirin. Bıçakları dikkatlice çıkarın.
    NOT: Burada beyin bölümleri sıvıdan kolayca çıkarılmadı çünkü bazdaki bazı pia mater'in kesite müdahale edilmesine neden oldu. Matriste kalan herhangi bir bölüm varsa, bunları tabağa aktarmak için küçük bir spatula kullanın.
15. TTC çözeltisi ve beyin kesitleri ile çanak 37 °C'de bir su banyosuyerleştirin.
16. Her 5 dakikada bir çanak kontrol edin ve bölümlerin örtüşme emin olun.
17. TTC reaksiyonu sona erdirmek için çanak% 4 paraformaldehit çözeltisi 10 mL ekleyin.
18. Rostral'dan kaudal'a kadar olan bölümleri yönlendirin ve fotoğraf çekin.

6. İstatistik

1. Bir Öğrencinin t-testini gerçekleştirmek için istatistiksel analiz yazılımLarını (örneğin, GraphPad Prism) kullanın. t
   NOT: Tüm veriler ortalama ± SE olarak ifade edilir. Gruplar arasındaki farklar iki kuyruklu Öğrencinin t-testleriile belirlenir (p < 0.05 istatistiksel anlamlılık olarak tanımlanır).

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan ameliyat protokolüne altı hayvan tabi tutuldu. Şekil 4'te gösterildiği gibi kontrol grubu altı sıçandan oluşuyordu. Şekil 4'te gösterilen beyin dilimleri grup başına bir sıçandan elde edilmiştir.

MRG taraması enfarktüsün pons(Şekil 4A)temelinde bulunduğunu gösterdi. Sonda orta hattın 2 mm soluna enjekte edildiği için enfarktüs yanal olarak saptandı. Bu enfa...

Tartışmalar

Bu çalışma akut pontin enfarktüs sıçan modeli oluşturmak için bir protokol sağlar. Bu model pontin inme hastalarında prognoz ve rehabilitasyon (inme sonrası kronik ağrı dahil) üzerine araştırmalar da kullanılabilir.

Bu yöntemin çeşitli güçlü yönleri vardır. İlk olarak, gelecekteki çalışmalar için akut pontin enfarktüsü bir sıçan modeli sağlar. Yukarıda da belirtildiği gibi pontin enfarktüsü daha az dikkat çeken yaygın bir inme alt tipidir. İnme araşt?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 sucture	Shanghai Jinzhong		Surgical instruments
Adhesive tape	Shanghai Jinzhong		Surgical instruments
Animal anesthesia system	RWD		Wear mask when using the system
Bone cement	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Cured clamp	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
General tissue scissors	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
IndoPhors	Guoyao of China		Sterilization
Isoflurane	RWD	217181101
Lesion Making Device	Shanghai Yuyan		Making a lesion
MRI system	Bruker Biospin		Confirmation of infarction in vivo
Needle holder	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Penicilin	Guoyao of China		Infection Prevention
Probe	Anke		Need some modification
Q-tips	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Shearing scissors	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Stereotaxic apparatus	RWD
Suture needle	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
Tissue holding forcepts	Shanghai Jinzhong		Surgical instrument
TTC	Sigma-Aldrich	BCBW5177	For infarction confirmation in vitro