Modelo de inoculación de la almohadilla del ratón para estudiar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por el viral

Resumen

El modelo de inoculación de la almohadilla es una herramienta valiosa para caracterizar las respuestas neuroinflamatorias inducidas por virus in vivo. En particular, proporciona una evaluación clara de la cinética viral y los procesos inmunopatológicos asociados iniciados en el sistema nervioso periférico.

Resumen

Este protocolo describe un modelo de inoculación de la almohadilla para pies utilizado para estudiar el inicio y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias durante la infección por alfaherpesvirus en ratones. Como los alfaherpesvirus son los principales invasores del sistema nervioso periférico (PNS), este modelo es adecuado para caracterizar la cinética de la replicación viral, su propagación desde el PNS al SNC, y las respuestas neuroinflamatorias asociadas. El modelo de inoculación de la almohadilla de pie permite que las partículas del virus se propaguen desde un sitio de infección primaria en la epidermis del pie a las fibras nerviosas sensoriales y simpáticas que invaden la epidermis, las glándulas sudoríparas y la dermis. La infección se propaga a través del nervio ciático a los ganglios de la raíz dorsal (DRG) y, en última instancia, a través de la médula espinal hasta el cerebro. Aquí, se inocula un reposapiés de ratón con el virus pseudorabies (PRV), un alfaherpesvirus estrechamente relacionado con el virus del herpes simple (VHS) y el virus de la varicela-zoster (VZV). Este modelo demuestra que la infección por PRV induce una inflamación grave, caracterizada por la infiltración de neutrófilos en el reposapiés y el DRG. Las altas concentraciones de citoquinas inflamatorias son posteriormente detectadas en tejidos homogeneizados por ELISA. Además, se observa una fuerte correlación entre el gen PRV y la expresión de proteínas (a través de la tinción qPCR e IF) en DRG y la producción de citoquinas proinflamatorias. Por lo tanto, el modelo de inoculación de la almohadilla de pie proporciona una mejor comprensión de los procesos subyacentes a las neuropatías inducidas por alfaherpesvirus y puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras. Además, el modelo puede guiar la investigación sobre neuropatías periféricas, como la esclerosis múltiple y el daño inducido por el virus asociado al PNS. En última instancia, puede servir como una herramienta in vivo rentable para el desarrollo de fármacos.

Introducción

Este estudio describe un modelo de inoculación de la almohadilla para investigar la replicación y propagación de virus desde el PNS al SNC y las respuestas neuroinflamatorias asociadas. El modelo de inoculación de la almohadilla de pie se ha utilizado intensamente para estudiar la infección por alfaherpesvirus en las neuronas^1,2,3. El objetivo principal de este modelo es permitir que los virus neurotrópicos viajen una distancia máxima a través del PNS antes de alcanzar el SNC. Aquí, este modelo se utiliza para obtener nuevos conocimientos en el desarrollo de una neuropatía particular (picazón neuropática) en ratones infectados con el virus pseudorabies (PRV).

El PRV es un alfaherpesvirus relacionado con varios patógenos conocidos (es decir, herpes simple tipo 1 y 2 [HSV1 y HSV2] y virus varicela-zoster [VZV]), que causan herpes labial, lesiones genitales y varicela, respectivamente⁴. Estos virus son todos pantrópicos y capaces de infectar muchos tipos de células diferentes sin mostrar afinidad por un tipo de tejido específico. Sin embargo, todos ellos exhiben un neurotropismo característico al invadir el PNS (y ocasionalmente, el SNC) de especies anfitrionas. El huésped natural es el cerdo, pero el PRV puede infectar a la mayoría de los mamíferos. En estos huéspedes no naturales, PRV infecta el PNS e induce un prurito severo llamado la "prurito loco", seguido de la muerte peraguta^5,6. El papel de la respuesta neuroinmune en el resultado clínico y la patogénesis de la infección por PRV ha sido mal entendido.

El modelo de inoculación de la almohadilla de pie permite que el PRV inicie la infección en las células epidérmicas de la almohadilla. Luego, la infección se propaga a las fibras nerviosas sensoriales y simpáticas que inerpen la epidermis, las glándulas sudoríparas y la dermis. La infección se propaga por partículas de virus que se mueven a través del nervio ciático al DRG dentro de aproximadamente 60 h. La infección se propaga a través de la médula espinal, llegando en última instancia al cerebro trasero cuando los animales se vuelven moribundos (82 h después de la infección). Durante este período de tiempo, las muestras de tejido se pueden recoger, procesar y analizar para la replicación del virus y los marcadores de la respuesta inmunitaria. Por ejemplo, el examen histológico y la cuantificación de la carga viral se pueden realizar en diferentes tejidos para establecer correlaciones entre la iniciación y el desarrollo de procesos clínicos, virológicos y neuroinflamatorios en la patogénesis del V PRV.

Utilizando el modelo de inoculación de la almohadilla, se pueden investigar los mecanismos celulares y moleculares del prurito inducido por PRV en ratones. Además, este modelo puede proporcionar una nueva visión de la iniciación y el desarrollo de la neuroinflamación inducida por el virus durante las infecciones por herpesvirus. Una mejor comprensión de los procesos subyacentes a las neuropatías inducidas por alfaherpesvirus puede conducir al desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras. Por ejemplo, este modelo es útil para investigar los mecanismos de la picazón neuropática en pacientes con lesiones post-herpéticas (por ejemplo, herpes zóster, herpes zóster) y probar nuevas dianas terapéuticas en ratones para las enfermedades humanas correspondientes.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con un protocolo (número 2083-16 y 2083-19) revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Princeton. Este trabajo se realizó siguiendo estrictamente los requisitos de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2), a los que tenemos un laboratorio totalmente equipado aprobado por el comité de bioseguridad de la Universidad de Princeton. Los procedimientos que incluyen la abrasión de la almohadilla del ratón, la inoculación viral, la disección de ratón y la recolección de tejidos se realizaron en un gabinete de seguridad biológica (BSC) en la sala de instalaciones de biocontención animal de la Universidad de Princeton. Aquellos que realizan el procedimiento llevaban batas desechables, cubierta para la cabeza, protección para los ojos, guantes estériles, máscaras quirúrgicas y fundas de zapatos.

1. Abrasión del teclado del ratón

1. Anestesiar un ratón C57BL/6 (5-7 semanas de edad) con anestésico de gas isoflurano, entregado a una dosis del 3% a través de un pequeño sistema de anestesia (cámara).
   1. Coloque el ratón en el plano quirúrgico de la anestesia en su espalda, antes de la inoculación, en el reposapiés trasero. Fije un cono nasal con un diafragma (una hendidura suficientemente grande para ajustar el hocico del animal) al ratón y entregue anestésico de gas isoflurano a una dosis constante de 1.5%–2.0%.
   2. Supervise de cerca el ratón para obtener una respuesta al estímulo doloroso creado por la pinza de la dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del objeto con fórceps.
2. Sujete ligeramente un pie trasero con fórceps planos.
   1. Abrasa suavemente la piel glabra de la almohadilla trasera aproximadamente 20x, entre el talón y las almohadillas para caminar, con una tabla de esmeril (100-180 de grano). No induzca el sangrado abrasando con demasiada frecuencia o aplicando demasiada presión.
   2. Usando fórceps finos, despegue lentamente el estrato córneo separado por abrasión para exponer el estrato basale.

2. Inoculación de la almohadilla de pie PRV

1. Preparar el inóculo del virus diluido al título deseado en medios DMEM que contengan un 2% de suero bovino fetal (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina(Tabla de Materiales).
   1. Cantidade el número de unidades formadoras de placas (PFU) en el stock de virus en las células PK15 para calcular y estandarizar la dosis viral y diluir el inóculo viral en consecuencia.
      NOTA: En este estudio, se utilizó una cepa virulenta de PRV (PRV-Becker) a una dosis de 8 x 10⁶ PFU. Esta dosis se optimizó en un experimento preliminar anterior para garantizar que todos los animales inoculados mostraran síntomas clínicos a 82 h después de la inoculación (hpi).
   2. Mantenga el inóculo del virus sobre hielo y mezcle suavemente antes de usarlo.
2. Añadir una gota de 20 l de inóculo del virus (8 x 10⁶ PFU) a la almohadilla abrasada (administración tópica). Realice inoculaciones simuladas (solo medianas) en paralelo.
3. Frote suavemente 10x con el eje de una aguja para facilitar la adsorción del virus. Evite rascarse con el punto de la aguja. Repita este paso cada 10 minutos.
4. Mantenga el ratón bajo anestesia durante 30 minutos hasta que la almohadilla abrasada esté seca.
5. Después de detener la anestesia, monitoree el ratón hasta que pueda mantener la recumbencia esternal y colóquelo en una jaula individual para el seguimiento clínico y el muestreo.

3. Disección del ratón y recolección de tejidos

1. En los momentos apropiados después de la infección, eutanasiar el ratón por el método de asfixia (CO₂).
   NOTA: En este estudio, el punto final humano (cuando los animales comienzan a presentar síntomas terminales) para los ratones infectados por PRV-Becker es de 82 hpi. Eutanasia los animales de control en paralelo.
2. Coloque el lado ventral del ratón mirando hacia arriba sobre una estera quirúrgica usando agujas/pins. Asegure las extremidades del ratón con alfileres a una placa de espuma quirúrgica. Humedezca el lado ventral del ratón con 70% de etanol para minimizar la contaminación del pelaje.
3. Pinche la capa externa de piel y piel usando fórceps y haga una pequeña incisión inicial usando tijeras finas cerca de la abertura uretral.
   1. Desde esta abertura, continúe la incisión en el lado ventral medio hasta la barbilla.
   2. Extienda dos incisiones laterales hacia las extremidades de las extremidades delanteras y posteriores.
   3. Separe la piel de la capa muscular subyacente y ancle hacia abajo hacia un lado.
   4. Abra la cavidad abdominal e incíme hasta la base del tórax. Completar la apertura de la cavidad abdominal realizando dos incisiones transversales.
   5. Abra la cavidad torácica cortando el diafragma y las costillas en ambos lados laterales.
      NOTA: Cortar los lados de la caja torácica evita el riesgo de cortar el corazón.
   6. Recoger órganos expuestos, incluyendo corazón, pulmones, bazo, páncreas, hígado, riñones y vejiga en microtubos de 1,5 ml. Mantenga los tubos en hielo.
   7. Corte la almohadilla abrasada entre el talón y las almohadillas para caminar y coloque el trozo de tejido en un tubo como se describe en el paso 3.3.6.
4. Coloque el lado dorsal del ratón hacia arriba y moje el pelaje con 70% de etanol. Corte la capa de la piel para exponer la columna vertebral.
   1. Haga una pequeña incisión en la región de la pelvis. Retire la piel de las extremidades posteriores hacia la cabeza.
   2. Retire las piernas y los brazos cortando con tijeras paralelas y cerca de la columna vertebral en ambos lados.
   3. Cortar la cabeza en la base del cráneo (nivel C1–C2).
   4. Abre el cráneo con tijeras desde el foramen magnum hasta el hueso frontal.
   5. Tire de abrir el cráneo en direcciones laterales utilizando fórceps.
   6. Saque suavemente el cerebro usando fórceps y proceda como se describe en el paso 3.3.6.
5. Limpie la columna vertebral cortando músculo, grasa y tejidos blandos usando tijeras curvas. Corta la cola. Coloque la columna vertebral intacta en un tubo de 15 ml que contenga solución salina estéril con fosfato frío helado (PBS). Mantenga los tubos sobre hielo hasta una mayor disección de la médula espinal y el DRG.

4. Extracción de la médula espinal y el DRG

NOTA: Extraiga la médula espinal y el DRG de la columna de vértebras directamente después de la disección del ratón. El protocolo para la extracción de la médula espinal y la DRG ha sido adaptado de una publicación anterior⁷.

1. Retire la columna de vértebras del tubo PBS helado y retire los tejidos blandos restantes, lo que se vuelve más fácil después de la refrigeración.
2. Realice tres cortes transversales en la columna a través de las vértebras (niveles T1, L1 y S2) utilizando una cuchilla de afeitar. Coloque las tres piezas en un plato de Petri de 15 mm que contenga PBS al hielo estéril. Realice un seguimiento y marque el origen de los segmentos para su posterior análisis.
3. Tome un segmento y asegúrelo entre fórceps, lado dorsal hacia arriba. Haga un único corte longitudinal a través de la línea media usando una cuchilla de afeitar, dividiendo la columna en dos mitades iguales.
4. Coloque ambas mitades en un nuevo plato de Petri que contenga un nuevo PBS estéril helado. Asegurar la orientación correcta del segmento para poder distinguir los lados izquierdo y derecho.
5. Bajo un microscopio diseccionando, pela suavemente la médula espinal de la columna de las vértebras de cada mitad en una dirección rostral a caudal usando fórceps finos.
6. Recoger ambas mitades de la médula espinal en microtubos de 1,5 ml que contengan 500 l de PBS estéril helado. Mantenga los tubos en hielo.
7. Retire suavemente las meninges de un lado de la columna vertebral al otro para exponer el DRG.
8. Retire cada DRG individualmente agarrando el nervio espinal expuesto y sácalo suavemente de la columna vertebral. Coloque el DRG recogido en un plato de Petri de 15 mm que contenga PBS helado. Cosecha todo el DRG ipsilateral y contralateral por separado del segmento de la columna vertebral y proceda como se describe en el paso 4.5.
   NOTA: El DRG es visible como una estructura transparente redonda a lo largo del nervio espinal blanco.
9. Repita los pasos 4.3–4.7 usando los otros dos segmentos de columna vertebral dentro de 30–45 min.
10. Centrifugar todos los tubos a alta velocidad (17.900 x g) durante 3 min a 4oC.
11. Aspirar tubos de sobrenadantes y de congelación de flash en nitrógeno líquido. Almacene los tubos a -80 oC para una mayor homogeneización del tejido.
12. Alternativamente, fije y seccione el DRG limpio y otros tejidos de ratón para análisis histopatológicos y/o tinción de inmunofluorescencia después del paso 4.9.

5. Homogeneización de tejidos

1. Descongelar los tubos que contienen muestras de tejido congelado sobre hielo.
2. Pesar 100 mg de tejido y colocarlo en un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga un cordón de acero estéril y 500 l de tampón RIPA que contenga 0,5 M EDTA (pH a 8,0), 1 M Tris-HCl (pH a 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS e inhibidores de cócteles proteasas.
3. Interrumpir los tejidos a temperatura ambiente (RT) utilizando un homogeneizador a 20 ciclos/s durante 2 min, seguido de un período de espera de 1 min, luego 20 ciclos/s durante 2 min.
4. Centrifugar el tubo a alta velocidad (17.900 x g)durante 10 min en RT.
5. Recoger el sobrenadante (500 l) en un tubo nuevo y almacenarlo a -20 oC hasta realizar ELISA y qPCR para cuantificar los marcadores inflamatorios y las cargas virales, respectivamente.
   NOTA: Para qPCR, recoja todas las muestras con material libre de RNase (es decir, perlas, tubos, etc.) y interrumpa los tejidos con tampón de lice yissis de ARN que contengan 1% de betamercaptoetanol(Tabla de materiales).

6. Preparación y tinción de inmunofluorescencia de secciones DRG congeladas

1. Procesamiento de tejidos
   1. Fijar el DRG diseccionado y limpiado en 1% de paraformaldehído (PFA) durante 2 h en RT.
   2. Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con 10% de sacarosa en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.
   3. Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con una sacarosa del 20% en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.
   4. Transfiera el tejido a un tubo de 15 ml con una sacarosa al 30% en PBS. Incubar durante la noche a 4oC.
   5. Incruste los tejidos en el PTU usando un criomold y coloque bloques en hielo seco para una rápida congelación.
   6. Conservar las muestras a -80 oC hasta su uso.
2. Preparación de criocisión
   1. Retirar el bloque congelado de -80 oC y dejar que se equilibre en la temperatura de la cámara del criostato durante 30 min.
   2. Cryosection el DRG a un espesor de 15 m y montar las secciones en diapositivas.
   3. Utilice una pluma para dibujar un círculo hidrófobo alrededor del tejido montado en la diapositiva.
   4. Mantenga los portaobjetos a 4 oC hasta que se manches.
3. Tinción de inmunofluorescencia
   1. Lavar las secciones DRG 3x en PBS durante 10 min en RT.
   2. Incubar las secciones con 100 ml de anticuerpo primario deseado (p. ej., anticuerpo de ratón contra la glicoproteína B) durante 1 h a 37oC. Diluir el anticuerpo primario en PBS que contiene 10% de suero de cabra negativo.
   3. Repita el paso 6.3.1.
   4. Incubar las secciones con 100 ml de anticuerpo secundario deseado (antiratón de cabra Alexa Fluor 488) durante 50 min a 37oC. Diluir anticuerpo secundario solo en PBS.
   5. Añadir 100 l de colorante DAPI (4o,6-diamidino-2-fenilíndole) diluido en PBS en la sección. Incubar más muestras a 10 min a 37oC.
   6. Repita el paso 6.3.1.
   7. Monte las muestras utilizando un medio de montaje de fluorescencia en diapositivas de vidrio y asegúrela y cúbrala con cubreobjetos.

7. Preparación y tinción H&E de secciones de tejido incrustadas en parafina

1. Fijar el tejido en 10% de formalina durante 24 h a 4 oC.
2. Realizar un cronograma de procesamiento estándar para la incrustación de parafina y sección de tejidos fijos. Transfiera los tejidos fijos al 70% de etanol y procese a través de alcoholes mejorados al xileno seguido de parafina, como se describió anteriormente⁸.
   NOTA: Utilice esponjas de poliéster para mantener pequeñas muestras de tejido como DRG dentro de los casetes.
3. Realizar la desparafinación estándar seguida de la tinción H&E de secciones de tejido, como se describió anteriormente⁹.

Resultados

El modelo de inoculación del ratón para el reposapiés permite caracterizar la inmunopatogénesis de la infección por alfaherpesvirus in vivo, incluida la replicación y propagación de la infección desde la almohadilla inoculada hasta el sistema nervioso y la inducción de respuestas neuroinflamatorias específicas.

En este estudio, primero abrasamos el pie trasero del ratón y nos maglegráramos o inoculamos la región abrasada con una cepa virulenta de PRV (PRV-Becker). El sitio de abra...

Discusión

El modelo de inoculación de la almohadilla de pie descrito aquí es útil para investigar el inicio y desarrollo de respuestas neuroinflamatorias durante la infección por alfaherpesvirus. Además, este modelo in vivo se utiliza para establecer la cinética de la replicación y propagación del alfaherpesvirus desde el PNS al SNC. Se trata de un suplente de otros modelos de inoculación, como el modelo de inoculación de la piel del flanco, que se basa en el rascado dérmico profundo^13,o la ruta ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-PRV gB	Made by the lab		1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red	Fisher scientific	2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)	Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks)	The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml)	Fisher scientific	62248	1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm	Sigma-Aldrich	P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
Fine curved scissors stainless steel	FST	14095-11
Fluoromount-G mounting media	Fisher scientific	0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Isothesia Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml	Denville Scientific	1000945
Microtube 1.5ml	SARSTEDT	72692005
Negative goat serum	Vector	S-1000
Penicillin/Streptomycin	Gibco	154022
Precision Glide needle 18G	BD	305196
Razor blades steel back	Personna	9412071
RNA lysis buffer (RLT)	Qiagen	79216
Stainless Steel Beads, 5 mm	Qiagen	69989
Superfrost/plus microscopic slides	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029	1/2000 dilution