Mouse Footpad Modello di inoculazione per studiare risposte neuroinfiammatorie indotte da virus

Riepilogo

Il modello di inoculazione del footpad è uno strumento prezioso per caratterizzare le risposte neuroinfiammatorie indotte da virali in vivo. In particolare, fornisce una valutazione chiara della cinetica virale e dei processi immunopatologici associati avviati nel sistema nervoso periferico.

Abstract

Questo protocollo descrive un modello di inoculazione del footpad utilizzato per studiare l'avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l'infezione da alfaherpesvirus nei topi. Poiché gli alfaherppi sono i principali invasori del sistema nervoso periferico (PNS), questo modello è adatto a caratterizzare la cinetica della replicazione virale, la sua diffusione dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad consente alle particelle di virus di diffondersi da un sito di infezione primaria nell'epidermide del footpad alle fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l'epidermide, le ghiandole sudoripare e la dermide. L'infezione si diffonde attraverso il nervo sciatico ai gangli della radice dorsale (DRG) e, infine, attraverso il midollo spinale al cervello. Qui, un piede di topo è inoculato con pseudorabies virus (PRV), un virus alfaherpesvirus strettamente correlato al virus dell'herpes simplex (HSV) e del virus varicella-zoster . Questo modello dimostra che l'infezione da PRV induce una grave infiammazione, caratterizzata da infiltrazione di neutrofili nel footpad e DRG. Alte concentrazioni di citochine infiammatorie vengono successivamente rilevate nei tessuti omogeneizzati da ELISA. Inoltre, si osserva una forte correlazione tra l'espressione genica e proteica PRV (tramite qPCR e colorazione IF) nella DRG e la produzione di citochine pro-infiammatorie. Pertanto, il modello di inoculazione del footpad fornisce una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte da alfaancorato e può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Inoltre, il modello può guidare la ricerca sulle neuropatie periferiche, come la sclerosi multipla e il danno ai virali associato al PNS. In definitiva, può servire come uno strumento in vivo conveniente per lo sviluppo di farmaci.

Introduzione

Questo studio descrive un modello di inoculazione del footpad per studiare la replica e la diffusione dei virus dal PNS al SNC e le risposte neuroinfiammatorie associate. Il modello di inoculazione del footpad è stato utilizzato intensamente per studiare l'infezione da alfaherpesvirus nei neuroni^1,2,3. L'obiettivo principale di questo modello è quello di consentire ai virus neurotropici di percorrere una distanza massima attraverso il PNS prima di raggiungere il SNC. Qui, questo modello viene utilizzato per ottenere nuove intuizioni nello sviluppo di un particolare neuropatia (prurito neuropatico) in topi infettati da pseudorabies virus (PRV).

Il PRV è un alfaintovirus correlato a diversi patogeni ben noti (cioè herpes simplex di tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e virus varicella-zoster [VV]), che causano herpivi di freddo, lesioni genitali e varicella, rispettivamente⁴. Questi virus sono tutti pantropici e in grado di infettare molti diversi tipi di cellule senza mostrare affinità per un tipo di tessuto specifico. Tuttavia, tutti presentano un caratteristico neurotropismo invadendo il PNS (e occasionalmente, il CNS) delle specie ospiti. L'ospite naturale è il maiale, ma il PRV può infettare la maggior parte dei mammiferi. In questi ospiti non naturali, PRV infetta il PNS e induce un forte prurito chiamato "prurito pazzo", seguito da morte peracuta^5,6. Il ruolo della risposta neuroimmune nell'esito clinico e nella patogenesi dell'infezione da PRV è stato poco compreso.

Il modello di inoculazione del footpad consente a PRV di avviare l'infezione nelle cellule epidermiche del footpad. Quindi, l'infezione si diffonde in fibre nervose sensoriali e simpatiche che innervano l'epidermide, le ghiandole sudoripare e il derma. L'infezione si diffonde da particelle di virus che si muovono attraverso il nervo sciatico al DRG entro circa 60 h. L'infezione si diffonde attraverso il midollo spinale, raggiungendo infine il cervello posteriore quando gli animali diventano moribondi (82 h dopo l'infezione). Durante questa finestra temporale, i campioni di tessuto possono essere raccolti, elaborati e analizzati per la replicazione del virus e marcatori della risposta immunitaria. Ad esempio, l'esame istologico e la quantificazione del carico virale possono essere eseguiti in diversi tessuti per stabilire correlazioni tra l'avvio e lo sviluppo di processi clinici, virologici e nevrinfiammatori nella patogenesi PRV.

Utilizzando il modello di inoculazione del pedebole, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari del prurito indotta da PRV nei topi. Inoltre, questo modello può fornire nuove informazioni sull'avvio e lo sviluppo di neuroinfiammazioni indotte da virus durante le infezioni da herpesvirus. Una migliore comprensione dei processi alla base delle neuropatie indotte dall'alfadante può portare allo sviluppo di strategie terapeutiche innovative. Ad esempio, questo modello è utile per studiare i meccanismi del prurito neuropatico nei pazienti con lesioni post-epetiche (ad esempio, herpes zoster, heringles) e testare nuovi bersagli terapeutici nei topi per le corrispondenti malattie umane.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità a un protocollo (numero 2083-16 e 2083-19) esaminato e approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Istituzione (IACUC) dell'Università di Princeton. Questo lavoro è stato fatto seguendo rigorosamente i requisiti di livello di biosicurezza-2 (BSL-2), a cui abbiamo un laboratorio completamente attrezzato approvato dal comitato per la biosicurezza dell'Università di Princeton. Le procedure, tra cui l'abrasione del piede del topo, l'inoculazione virale, la dissezione del topo e la raccolta dei tessuti, sono state eseguite in un mobile di sicurezza biologica (BSC) nella sala per animali di biocontenimento dell'Università di Princeton. Coloro che eseguivano la procedura indossavano abiti usa e getta, copricapo, protezione degli occhi, guanti sterili, maschere chirurgiche e copriscarpe.

1. Abrasione del piede del mouse

1. Anestetizza un topo C57BL/6 (5-7 settimane) con anestetico a gas isoflurano, consegnato ad un dosaggio del 3% tramite un piccolo sistema di anestesia (camera).
   1. Posizionare il topo nel piano chirurgico dell'anestesia sulla schiena, prima dell'inoculazione, nel piede posteriore. Fissare un cono naso con un diaframma (una scianda sufficientemente dimensionata per adattarsi al muso dell'animale) al topo e fornire anestetico gasisco isoflurane a un dosaggio costante di 1,5%–2,0%.
   2. Monitorare attentamente il mouse per una risposta allo stimolo doloroso creato da un forte pizzico della punta con pinze.
2. Afferra leggermente un pedana posteriore con pinze piatte.
   1. Abrade delicatamente la pelle glavante del piede posteriore circa 20x, tra il tallone e le pastiglie, con una tavola emery (100–180 grinta). Non indurre il sanguinamento da abradere troppo frequentemente o applicando troppa pressione.
   2. Utilizzando pinze sottili, lentamente staccare lo strato corneo staccato dall'abrasione per esporre lo strato basale.

2. Inoculazione del pedolo PRV

1. Preparare l'inoculum del virus diluito al timetro desiderato nel supporto DMEM contenente 2% siero bovino fetale (FBS) e 1% penicillina/streptomycin (Tabella dei materiali).
   1. Quantificate il numero di unità di formazione di placche (PFU) nello stock di virus sulle cellule PK15 per calcolare e standardizzare la dose virale e diluire di conseguenza l'inoculo virale.
      NOTA: In questo studio, ceppo virulento di PRV (PRV-Becker) è stato utilizzato ad una dose di 8 x 10⁶ PFU. Questa dose è stata ottimizzata in un precedente esperimento preliminare per garantire che tutti gli animali inoculati mostrasse sintomi clinici a 82 ore dopo l'inoculazione (hpi).
   2. Mantenere il virus inoculum sul ghiaccio e mescolare delicatamente prima dell'uso.
2. Aggiungere una goccia di 20 litri di inoculum del virus (8 x 10⁶ PFU) sul footpad abrato (amministrazione topica). Eseguire inoculazioni fittizie (solo medie) in parallelo.
3. Strofinare delicatamente 10x con l'albero di un ago per facilitare l'adsordimento del virus. Evitare di graffiare con l'ago. Ripetere questo passaggio ogni 10 min.
4. Tenere il mouse sotto anestesia per 30 min fino a quando il piede abrabraded è asciutto.
5. Dopo aver interrotto l'anestesia, monitorare il mouse fino a quando non può mantenere la recumbenza sternale e posizionarlo in una gabbia individuale per il follow-up clinico e il campionamento.

3. Dissezione del topo e raccolta dei tessuti

1. Nei momenti appropriati dopo l'infezione, eutanasia il topo con il metodo di asfissia (CO₂).
   NOTA: In questo studio, l'endpoint umano (quando gli animali iniziano a presentare sintomi terminali) per i topi infetti da PRV-Becker è 82 hpi. Eutanasia controllare gli animali in parallelo.
2. Posizionare il lato ventrale del topo rivolto verso l'alto su un tappetino chirurgico utilizzando aghi/spill. Fissare gli arti del topo con perni a una scheda di schiuma chirurgica. Sorrida il lato ventrale del topo con il 70% di etanolo per ridurre al minimo la contaminazione della pelliccia.
3. Pizzicare lo strato esterno di pelliccia e pelle con pinze e fare una piccola incisione iniziale utilizzando forbici fini vicino all'apertura uretrale.
   1. Da questa apertura, continuare l'incisione sul lato ventrale medio fino al mento.
   2. Estendere due incisioni laterali verso le estremità degli arti anteriori e degli arti posteriori.
   3. Separare la pelle dallo strato muscolare sottostante e fissare verso il basso di lato.
   4. Aprire la cavità addominale e incise fino alla base del torace. Completare l'apertura della cavità addominale facendo due incisioni trasversali.
   5. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma e le costole su entrambi i lati laterali.
      NOTA: Tagliare i lati della gabbia toracica previene il rischio di tagliare il cuore.
   6. Raccogliere organi esposti, tra cui cuore, polmoni, milza, pancreas, fegato, reni, e vescica in 1,5 mL microtubi. Tenere i tubi sul ghiaccio.
   7. Tagliare il piede abraso tra il tallone e le pastiglie e posizionare il pezzo di tessuto in un tubo come descritto al punto 3.3.6.
4. Posizionare il lato dorsale del topo verso l'alto e umidare la pelliccia con il 70% di etanolo. Tagliare lo strato della pelle per esporre la colonna vertebrale.
   1. Fare una piccola incisione nella regione del bacino. Strisciare la pelle dagli arti posteriori verso la testa.
   2. Rimuovere le gambe e le braccia tagliando con le forbici parallele e vicine alla colonna vertebrale su entrambi i lati.
   3. Tagliare la testa alla base del cranio (livello C1-C2).
   4. Tagliare il cranio con le forbici dal forame magnum all'osso frontale.
   5. Tirare aprire il cranio in direzioni laterali utilizzando pinze.
   6. Scoop delicatamente il cervello utilizzando la pinze e procedere come descritto nel passaggio 3.3.6.
5. Pulire la colonna vertebrale tagliando muscoli, grassi e tessuti molli utilizzando forbici curve. Taglia la coda. Collocare la colonna vertebrale intatta in un tubo da 15 mL contenente una salina sterile con tamponamenti di fosfato a freddo ghiaccio (PBS). Tenere i tubi sul ghiaccio fino a quando non ulteriore dissezione del midollo spinale e DRG.

4. Estrazione del midollo spinale e DRG

NOTA: Estrarre il midollo spinale e il DRG dalla colonna vertebrale direttamente dopo la dissezione del mouse. Il protocollo per l'estrazione del midollo spinale e drG è stato adattato da una precedente pubblicazione⁷.

1. Rimuovere la colonna vertebrale dal tubo PBS ghiacciato e rimuovere i tessuti molli rimanenti, che diventa più facile dopo la refrigerazione.
2. Fai tre tagli trasversali nella colonna attraverso le vertebre (livelli T1, L1 e S2) usando una lama di rasoio. Mettere i tre pezzi in una teglia Petri da 15 mm contenente pbS sterile freddo ghiaccio. Tieni traccia e contrassegna l'origine dei segmenti per un'analisi successiva.
3. Prendi un segmento e fissalo tra le pinze, il lato dorsale rivolto verso l'alto. Fare un singolo, longitudinale tagliato attraverso la linea mediana utilizzando una lama di rasoio, dividendo la colonna in due metà uguali.
4. Collocare entrambe le metà in una nuova parabola Petri contenente un nuovo PBS sterile ghiacciato. Assicurarsi che sia corretto l'orientamento del segmento per poter distinguere i lati sinistro e destro.
5. Sotto un microscopio dissecinte, sbucciare delicatamente il midollo spinale dalla colonna vertebrale da ogni metà in una direzione rostrale a caudale utilizzando pinze sottili.
6. Raccogliere entrambe le metà del midollo spinale in microtubi da 1,5 mL contenenti 500 - L di PBS sterile a freddo ghiaccio. Tenere i tubi sul ghiaccio.
7. Rimuovere delicatamente le meningi da un lato della colonna vertebrale all'altro per esporre il DRG.
8. Rimuovere ogni DRG singolarmente afferrando il nervo spinale esposto e tirarlo delicatamente fuori dalla colonna vertebrale. Collocare il DRG raccolto in una piastra Petri da 15 mm contenente PBS ghiacciato. Raccogliere tutte le DRG ipsilaterali e contralaterali separatamente dal segmento della colonna vertebrale e procedere come descritto al punto 4.5.
   NOTA: Il DRG è visibile come una struttura rotonda trasparente lungo il nervo spinale bianco.
9. Ripetere i passaggi da 4,3 a 4,7 utilizzando gli altri due segmenti della colonna vertebrale entro 30-45 min.
10. Centrifugare tutti i tubi ad alta velocità (17.900 x g) per 3 min a 4 gradi centigradi.
11. Tubi supernatali aspirati e flash-congelano in azoto liquido. Conservare i tubi a -80 gradi centigradi per un'ulteriore omogeneizzazione dei tessuti.
12. In alternativa, fissare e sezionare il DRG pulito e altri tessuti del topo per le analisi istopatologiche e/o la colorazione dell'immunofluorescenza dopo il passaggio 4.9.

5. omogeneizzazione dei tessuti

1. Scongelare i tubi contenenti campioni di tessuto congelato sul ghiaccio.
2. Pesare 100 mg di tessuto e posizionarlo in un tubo di microcentrifuga da 2 mL contenente un tallone d'acciaio sterile e 500 -L di buffer RIPA contenente 0,5 M EDTA (pH 8,0), 1 M Tris-HCl (pH - 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS e compresse di inibitori protease cocktail.
3. Interrompere i tessuti a temperatura ambiente (RT) utilizzando un omogeneizzatore a 20 cicli / s per 2 min, seguito da un periodo di attesa di 1 min, poi 20 cicli / s per 2 min.
4. Centrifugare il tubo ad alta velocità (17.900 x g) per 10 min a RT.
5. Raccogliere supernatali (500 ) in un nuovo tubo e conservarlo a -20 gradi centigradi fino a quando non esegue ELISA e qPCR per quantificare i marcatori infiammatori e i carichi virali, rispettivamente.
   NOTA: Per qPCR, raccogliere tutti i campioni con materiale privo di RNase (ad esempio, perline, tubi, ecc.) e interrompere i tessuti con buffer di lisiRNA contenente 1% betamercaptoetanolo (Tabella dei materiali).

6. Preparazione e colorazione dell'immunofluorescenza delle sezioni DRG congelate

1. Lavorazione dei tessuti
   1. Fissare il DRG sezionato e pulito in 1% paraformaldeide (PFA) per 2 h a RT.
   2. Trasferire il tessuto in un tubo da 15 mL con saccarosio al 10% in PBS. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
   3. Trasferire il tessuto in un tubo da 15 mL con il 20% di saccarosio in PBS. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
   4. Trasferire il tessuto in un tubo da 15 mL con il 30% di saccarosio in PBS. Incubare per tutta la notte a 4 gradi centigradi.
   5. Incorporare i tessuti nello Strumento di personalizzazione di Office utilizzando un criomuffone e posizionare blocchi nel ghiaccio secco per un congelamento rapido.
   6. Conservare i campioni a -80 gradi centigradi fino all'uso.
2. Preparazione alla criosezione
   1. Togliere il blocco congelato da -80 gradi e lasciarlo eclacazione nella temperatura della camera criostat per 30 min.
   2. Criosezione il DRG con uno spessore di 15 m e montare le sezioni su vetrini.
   3. Utilizzare una penna per disegnare un cerchio idrofobico intorno al tessuto montato su scivolo.
   4. Tenere i vetrini a 4 gradi centigradi fino a colorazione.
3. Colorazione immunofluorescenza
   1. Lavare le sezioni DRG 3x in PBS per 10 min a RT.
   2. Incubare le sezioni con 100 l dell'anticorpo primario desiderato (ad esempio, anticorpo murino contro glicoproteina B PRV) per 1 h a 37 gradi centigradi. Diluire l'anticorpo primario in PBS contenente il 10% di siero di capra negativo.
   3. Ripetere il passaggio 6.3.1.
   4. Incubare le sezioni con 100 l dell'anticorpo secondario desiderato (capra anti-topo Alexa Fluor 488) per 50 min a 37 gradi centigradi. Diluire l'anticorpo secondario solo in PBS.
   5. Aggiungere 100 -L di colorante DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) diluito in PBS sulla sezione. Ulteriori campioni di incubatura 10 min a 37 .
   6. Ripetere il passaggio 6.3.1.
   7. Montare i campioni utilizzando un supporto di montaggio a fluorescenza su vetrini di vetro e fissare e coprire con coverslip.

7. Preparazione e colorazione H&E delle sezioni di tessuto incorporate in paraffina

1. Fissare il tessuto in formalina del 10% per 24 h a 4 gradi centigradi.
2. Eseguire la pianificazione di elaborazione standard per l'incorporamento paraffina e la sezionamento di tessuti fissi. Trasferire tessuti fissi al 70% di etanolo e processo attraverso alcoli aggiornati a xilene seguito da paraffina, come descritto in precedenza⁸.
   NOTA: Utilizzare spugne in poliestere per tenere piccoli campioni di tessuto come DRG all'interno delle cassette.
3. Eseguire la deparaffinizzazione standard seguita dalla colorazione H&E delle sezioni di tessuto, come descritto in precedenza⁹.

Risultati

Il modello di inoculazione del piede del mouse consente la caratterizzazione dell'immunopatogenesi dell'infezione da alfarevirus in vivo, compresa la replicazione e la diffusione dell'infezione dal footpad inoculato al sistema nervoso e l'induzione di specifiche risposte neuroinfiammatorie.

In questo studio, abbiamo prima abraso il piede posteriore del topo e sia finto-inoculato o inoculato la regione abrasa con un ceppo virulento di PRV (PRV-Becker). Il sito di abrasione era visibile nella pe...

Discussione

Il modello di inoculazione del footpad descritto qui è utile per studiare l'avvio e lo sviluppo di risposte neuroinfiammatorie durante l'infezione da alfaherpesvirus. Inoltre, questo modello in vivo viene utilizzato per stabilire la cinetica della replicazione e la diffusione di alfaherpesvirus dal PNS al SNC. Si tratta di un'alternativa ad altri modelli di inoculazione, come il modello di inoculazione della pelle del fianco, che si basa su graffi dermici profondi¹³, o il percorso intracranico, c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-PRV gB	Made by the lab		1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red	Fisher scientific	2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)	Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks)	The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml)	Fisher scientific	62248	1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm	Sigma-Aldrich	P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
Fine curved scissors stainless steel	FST	14095-11
Fluoromount-G mounting media	Fisher scientific	0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Isothesia Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml	Denville Scientific	1000945
Microtube 1.5ml	SARSTEDT	72692005
Negative goat serum	Vector	S-1000
Penicillin/Streptomycin	Gibco	154022
Precision Glide needle 18G	BD	305196
Razor blades steel back	Personna	9412071
RNA lysis buffer (RLT)	Qiagen	79216
Stainless Steel Beads, 5 mm	Qiagen	69989
Superfrost/plus microscopic slides	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029	1/2000 dilution