Мышь Footpad прививки Модель для изучения вирусно-индуцированных нейровоспалительных реакций

Резюме

Модель прививки стопы является ценным инструментом для характеристики вирусных индуцированных нейровоспалительных реакций в vivo. В частности, он обеспечивает четкую оценку вирусной кинетики и связанных с ней иммунопатологических процессов, инициированных в периферической нервной системе.

Аннотация

Этот протокол описывает модель прививки, используемой для изучения инициации и развития нейровоспалительных реакций во время альфагерпепсвирусной инфекции у мышей. Поскольку альфагерпексвирусы являются основными захватчиками периферической нервной системы (PNS), эта модель подходит для характеристики кинетики вирусной репликации, ее распространения от PNS к ЦНС и связанных с ними нейровоспалительных реакций. Модель прививки стопы позволяет частицам вируса распространяться от первичного места инфекции в footpad эпидермис к сенсорным и симпатическим нервным волокнам, которые иннервировать эпидермис, потовые железы и дерму. Инфекция распространяется через седалищный нерв к спинной корневой ганглии (DRG) и в конечном итоге через спинной мозг к мозгу. Здесь, мышь footpad прививается с вирусом pseudorabies (PRV), альфагерпезвирус тесно связаны с вирусом простого герпеса (HSV) и вирус ветряной опоясывающий лишай (ВЗВ). Эта модель показывает, что PRV инфекция вызывает сильное воспаление, характеризуется инфильтрацией нейтрофила в подножку и DRG. Высокие концентрации воспалительных цитокинов впоследствии обнаруживаются в гомогенизированных тканях ELISA. Кроме того, наблюдается сильная корреляция между геном PRV и экспрессией белка (через qPCR и IF окрашивания) в DRG и производством провоспалительных цитокинов. Таким образом, модель прививки стопы обеспечивает лучшее понимание процессов, лежащих в основе нейропатий, вызванных альфагерпейвирусом, и может привести к разработке инновационных терапевтических стратегий. Кроме того, модель может направлять исследования на периферических невропатий, таких как рассеянный склероз и связанные с ними вирусные индуцированных повреждений PNS. В конечном счете, он может служить экономически эффективным инструментом in vivo для разработки лекарств.

Введение

Это исследование описывает модель прививки для исследования репликации и распространения вирусов от PNS до ЦНС и связанных с ними нейровоспалительных реакций. Модель прививки стопы интенсивно используется для изучения альфагерпейвирусной инфекции в нейронах^1,,2,,3. Основная цель этой модели заключается в том, чтобы позволить нейротропных вирусов путешествовать максимальное расстояние через PNS до достижения ЦНС. Здесь эта модель используется для получения новых идей в развитии конкретной невропатии (нейропатический зуд) у мышей, инфицированных вирусом псевдораби (PRV).

PRV является альфагерпезвирус, связанный с несколькими известными патогенами (на самом деле, герпес симокс типа 1 и 2 "HSV1 и HSV2" и вирус ветряной опоясывающий лишая, которые вызывают герпес, половые язвы, и ветряная оспа, соответственно⁴. Эти вирусы все пантропные и в состоянии заразить много различных типов клеток, не показывая сродство к определенному типу ткани. Тем не менее, все они проявляют характерный нейротропизм, вторгаясь в PNS (а иногда и ЦНС) видов-хозяев. Естественным хозяином является свинья, но PRV может заразить большинство млекопитающих. В этих не-естественных хостов, PRV заражает PNS и вызывает тяжелые зуд называется "безумный зуд", а затем peracute смерти^5,6. Роль нейроиммуна в клиническом исходе и патогенезе PRV инфекции было плохо изучено.

Модель прививки стопы позволяет PRV инициировать инфекцию в эпидермальных клетках стопы. Затем инфекция распространяется на сенсорные и симпатические нервные волокна, которые иннервирует эпидермис, потовые железы и дерму. Инфекция распространяется частицами вируса, движущимися через седалищный нерв к DRG в пределах приблизительно 60 ч. Инфекция распространяется через спинной мозг, в конечном счете, достигнув заднего мозга, когда животные становятся умирающими (82 ч после инфекции). В течение этого времени, образцы тканей могут быть собраны, обработаны и проанализированы для репликации вируса и маркеры иммунного ответа. Например, гистологическое обследование и количественная оценка вирусной нагрузки могут быть выполнены в различных тканях для установления корреляции между началом и развитием клинических, вирусологических и нейровоспалительных процессов в ВОЗ ПАТОГЕНеза PRV.

Используя модель прививки стопы, можно исследовать клеточные и молекулярные механизмы PRV-индуцированного зуда у мышей. Кроме того, эта модель может дать новое представление о начале и развитии вирус-индуцированной нейровоспламеняющиеся во время герпесвирусных инфекций. Более глубокое понимание процессов, лежащих в основе нейропатий, вызванных альфагерпейвирусом, может привести к разработке инновационных терапевтических стратегий. Например, эта модель полезна для исследования механизмов невропатического зуда у пациентов с пост-герпетическими поражениями (например, опоясывающим герпесом, черепицей) и тестирует новые терапевтические цели у мышей на соответствующие заболевания человека.

протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с протоколом (номер 2083-16 и 2083-19), рассмотренным и одобренным Комитетом по уходу и использованию животных Института (МАКУК) Принстонского университета. Эта работа была выполнена строго в соответствии с требованиями уровня биобезопасности-2 (BSL-2), к которым мы имеем полностью оборудованную лабораторию, одобренную комитетом по биобезопасности Принстонского университета. Процедуры, включая ссадину стопы мыши, вирусную прививку, вскрытие мыши и сбор тканей, были выполнены в кабинете биологической безопасности (BSC) в комнате объекта биоконтейнмента Принстонского университета. Лица, выполняющие процедуру, носили одноразовые платья, головной убор, защиту глаз, стерильные перчатки, хирургические маски и бахилы.

1. Мышь footpad ссадины

1. Анестезия C57BL/6 мыши (5-7 недель) с изофлуран газ анестезии, поставляется в дозировке 3% через небольшую анестезию системы (камера).
   1. Поместите мышь в хирургическую плоскость анестезии на спине, до прививки, в заднюю подножку. Прикрепите носовой конус с диафрагмой (разрез достаточно размера, чтобы соответствовать морде животного) к мыши и доставить изофлуран газ анестетик при постоянной дозировке 1,5%-2,0%.
   2. Внимательно следите за мышью для ответа на болезненный стимул, созданный силовым щипать ног с щипцами.
2. Слегка хватает одну заднюю футурк с плоскими щипцами.
   1. Аккуратно абрадыть glabrous кожи задней панели около 20x, между пяткой и ходьбе колодки, с эмери борту (100-180 песка). Не индуцировать кровотечение путем abrading слишком часто или применения слишком большого давления.
   2. Используя тонкие щипцы, медленно снимите сослойный роговица, отделенную от ссадины, чтобы разоблачить базалей слоя.

2. прививка для ног PRV

1. Подготовка вируса инокулум разбавленной желаемого титера в DMEM средствмассовойинформации, содержащей 2% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин / стрептомицин ( Таблица материалов ).
   1. Количество количества бляшек формирования единиц (PFU) в вирусных запасов на PK15 клеток для расчета и стандартизации вирусной дозы и разбавления вирусного инокула соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, вирулентный штамм PRV (PRV-Becker) был использован в дозе 8 х 10⁶ PFU. Эта доза была оптимизирована в предыдущем предварительном эксперименте, чтобы убедиться, что все привитые животные показали клинические симптомы при 82 ч после прививки (hpi).
   2. Держите вирус инокулум на льду и аккуратно перемешать перед использованием.
2. Добавьте 20 капли вируса инокулум (8 х 10⁶ ПФУ) на абрадированную подножку (местное введение). Проводите макет прививки (только средние) параллельно.
3. Аккуратно руб 10x с валом иглы для облегчения адсорбции вируса. Избегайте царапин с точки иглы. Повторяйте этот шаг каждые 10 минут.
4. Держите мышь под наркозом в течение 30 минут, пока абрадированный подножье не высохнет.
5. После остановки анестезии, контролировать мышь, пока он не может поддерживать строгое лежание и поместить его в отдельную клетку для клинического наблюдения и отбора проб.

3. Вскрытие мышей и коллекция тканей

1. В соответствующее время после заражения усыпить мышь методом удушья (CO_2)..
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании, гуманная конечная точка (когда животные начинают проявлять терминальные симптомы) для PRV-Becker инфицированных мышей составляет 82 л.с. Euthanize контроля животных параллельно.
2. Поместите мышь брюшной вентральной стороны вверх на хирургический коврик с помощью иглы / булавки. Защитите конечности мыши булавкой с булавками к хирургической пенной доске. Влажные брюшной стороны мыши с 70% этанола, чтобы свести к минимуму загрязнение меха.
3. Pinch внешний слой меха и кожи с помощью щипцов и сделать небольшой первоначальный разрез с помощью тонких ножниц вблизи уретрального отверстия.
   1. С этого отверстия, продолжить разрез на средней вентральной стороне до подбородка.
   2. Расширьте два боковых разреза к конечностям передних конечностей и задних конечностей.
   3. Отделите кожу от лежащего мышечного слоя и прикрепите вниз к стороне.
   4. Откройте брюшную полость и процой до основания грудной клетки. Завершите открытие брюшной полости, сделав два поперечного разреза.
   5. Откройте грудную полость, разрезав диафрагму и ребра на обеих боковых сторонах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резка по бокам грудной клетки предотвращает риск разрезания сердца.
   6. Собирайте открытые органы, включая сердце, легкие, селезенку, поджелудочную железу, печень, почки и мочевой пузырь в микротрубках 1,5 мл. Держите трубки на льду.
   7. Вырезать abraded footpad между пяткой и ходьбе колодки и поместите кусок ткани в трубку, как описано в шаге 3.3.6.
4. Поместите мышь спинной стороне вверх и мокрый мех с 70% этанола. Вырезать слой кожи, чтобы разоблачить позвоночного столба.
   1. Сделайте небольшой разрез в области таза. Снимите кожу с задних конечностей к голове.
   2. Удалите ноги и руки, разрезая ножницами параллельно и близко к позвоночнику с обеих сторон.
   3. Отрежьте голову у основания черепа (уровень C1-C2).
   4. Отрежьте череп ножницами от форамен магнума до лобной кости.
   5. Вытяните череп в боковых направлениях с помощью щипцов.
   6. Аккуратно вычерпывать мозг с помощью щипцов и продолжить, как описано в шаге 3.3.6.
5. Очистите позвоночник, разрезая мышцы, жир и мягкие ткани с помощью изогнутых ножниц. Отрежьте хвост. Поместите неповрежденный позвоночник в трубку 15 мЛ, содержащую стерильные ледяные фосфатно-буферизированные солевой раствор (PBS). Держите трубки на льду до дальнейшего вскрытия спинного мозга и DRG.

4. Спинной мозг и DRG извлечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките спинной мозг и DRG из позвонков столба непосредственно после вскрытия мыши. Протокол для извлечения спинного мозга и DRG был адаптирован из предыдущей публикации⁷.

1. Удалите столб позвонков из холодной трубки PBS и удалите оставшиеся мягкие ткани, что становится легче после охлаждения.
2. Сделайте три поперечных разреза в колонне через позвонки (уровни T1, L1 и S2) с помощью лезвия бритвы. Поместите три части в 15 мм Петри блюдо, содержащее стерильные ледяной PBS. Следите за происхождением сегментов и отметьте их для последующего анализа.
3. Возьмите один сегмент и закрепите его между щипцами, спинной стороной вверх. Сделать один, продольный вырезать через средней линии с помощью лезвия бритвы, разделив колонку на две равные половинки.
4. Поместите обе половинки в новую чашку Петри, содержащую новые стерильные ледяные PBS. Обеспечьте правильную ориентацию сегмента, чтобы иметь возможность различать левую и правую стороны.
5. Под рассекающим микроскопом аккуратно снимите спинной мозг из колонны позвонков от каждой половины в ростовском направлении до хвостового направления с помощью тонких щипцов.
6. Соберите обе половинки спинного мозга в микротрубки 1,5 мл, содержащие 500 мл стерильных ледяных х/л PBS. Держите трубки на льду.
7. Аккуратно удалите очинки с одной стороны позвоночника на другую, чтобы разоблачить DRG.
8. Удалите каждый DRG индивидуально, схватив открытый спинномозговой нерв и вытяните его осторожно из позвоночника. Поместите собранный DRG в 15-мм чашку Петри, содержащую ледяной PBS. Урожай все ipsilateral и контралатеральных DRG отдельно от спинного сегмента колонки и приступить, как описано в шаге 4.5.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DRG виден как круглая прозрачная структура вдоль белого спинного нерва.
9. Повторите шаги 4.3-4.7, используя два других сегмента позвоночника в течение 30-45 мин.
10. Центрифуга все трубки на высокой скорости (17900 х г) в течение 3 мин при 4 градусов по Цельсию.
11. Аспирировать супернатант и флэш-заморозки труб в жидком азоте. Храните трубки при -80 градусов по Цельсию для дальнейшей гомогенизации тканей.
12. Кроме того, исправить и раздел очищены DRG и других тканей мыши для гистопатологических анализов и / или иммунофлуоресценции окрашивания после шага 4.9.

5. Гомогенизация тканей

1. Оттепель труб, содержащих замороженные образцы тканей на льду.
2. Взвесьте 100 мг ткани и поместите ее в 2 мл микроцентрифуги трубку, содержащую стерильную стальную бусинку и 500 мл буфера RIPA, содержащего 0,5 М EDTA (рН 8,0), 1 M Tris-HCl (рН 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS и ингибиторы протеазы.
3. Нарушить ткани при комнатной температуре (RT) с помощью гомогенизатора при 20 циклов / с в течение 2 мин, а затем 1 мин период ожидания, то 20 циклов / с в течение 2 мин.
4. Центрифуга трубки на высокой скорости (17900 х г) в течение 10 минут на RT.
5. Соберите супернатант (500 мл) в новой трубке и храните его при -20 градусов по Цельсию до выполнения ELISA и qPCR для количественной оценки воспалительных маркеров и вирусных нагрузок, соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для qPCR, собрать все образцы с RNase-бесплатно материала (т.е., бисер, трубки и т.д.) и нарушить ткани с RNA лизис буфер, содержащий 1% бетамеркаптоэтанола(Таблица материалов).

6. Подготовка и иммунофлуоресценция окрашивания замороженных секций DRG

1. Обработка тканей
   1. Исправить расчлененные и очищенные DRG в 1% параформальдегида (PFA) для 2 ч на RT.
   2. Перенесите ткань в трубку 15 мЛ с 10% сахарозой в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
   3. Перенесите ткань в трубку 15 мЛ с 20% сахарозой в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
   4. Перенесите ткань в трубку 15 мЛ с 30% сахарозой в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
   5. Встраивайте ткани в OCT с помощью криомолда и размещайте блоки в сухом льду для быстрого замораживания.
   6. Храните образцы при -80 градусов по Цельсию до использования.
2. Криозекционная подготовка
   1. Снимите замороженный блок с -80 градусов по Цельсию и дайте ему уравнять температуру криостатной камеры в течение 30 мин.
   2. Криоэнекция DRG толщиной 15 мкм и смонтировать разделы на слайды.
   3. Используйте ручку, чтобы нарисовать гидрофобный круг вокруг слайд-монтажной ткани.
   4. Держите слайды на уровне 4 градусов по Цельсию до окрашивания.
3. Окрашивание иммунофлуоресценции
   1. Вымойте разделы DRG 3x в PBS в течение 10 минут на RT.
   2. Инкубировать разделы с 100 мл желаемого первичного антитела (например, антитела мыши против PRV гликопротеина В) в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию. Разбавить первичное антитело в PBS, содержащее 10% отрицательную козью сыворотку.
   3. Повторите шаг 6.3.1.
   4. Инкубировать разделы с 100 мл желаемого вторичного антитела (коза анти-мышь Alexa Fluor 488) в течение 50 мин при 37 градусов по Цельсию. Разбавить вторичные антитела только в PBS.
   5. Добавьте на секцию краситель DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Дальнейшие инкубировать образцы 10 мин при 37 градусов по Цельсию.
   6. Повторите шаг 6.3.1.
   7. Установите образцы с помощью флуоресценции монтажа среды на стеклянные горки и безопасной и крышкой с крышкой.

7. Подготовка и Окрашивание фрагментов ткани, встроенных в парафин

1. Закрените ткань 10% формалином на 24 ч при 4 градусах Цельсия.
2. Выполните стандартный график обработки парафина для встраивания парафина и секционого сечения фиксированных тканей. Передача фиксированных тканей на 70% этанола и процесс через модернизированные спирты до ксилена следуют парафин, как описано ранее⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте полиэфирные губки, чтобы держать небольшие образцы тканей, такие как DRG внутри кассет.
3. Выполните стандартную депараффинизацию с последующим окрашивание секций тканей, как описано ранее⁹.

Результаты

Модель прививки стопы мыши позволяет олицеделять иммунопатогенез альфагерпезвирусной инфекции in vivo, включая репликацию и распространение инфекции от привитой стопы к нервной системе и индукции специфических нейровоспалительных реакций.

В этом исследовании, мы сначал...

Обсуждение

Модель прививки, описанная здесь, полезна для исследования инициирования и развития нейровоспалительных реакций во время альфагерпейвирусной инфекции. Кроме того, эта модель in vivo используется для установления кинетики репликации и распространения альфагерпезвируса от PNS до ЦНС. Это ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-PRV gB	Made by the lab		1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red	Fisher scientific	2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)	Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks)	The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml)	Fisher scientific	62248	1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm	Sigma-Aldrich	P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
Fine curved scissors stainless steel	FST	14095-11
Fluoromount-G mounting media	Fisher scientific	0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Isothesia Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml	Denville Scientific	1000945
Microtube 1.5ml	SARSTEDT	72692005
Negative goat serum	Vector	S-1000
Penicillin/Streptomycin	Gibco	154022
Precision Glide needle 18G	BD	305196
Razor blades steel back	Personna	9412071
RNA lysis buffer (RLT)	Qiagen	79216
Stainless Steel Beads, 5 mm	Qiagen	69989
Superfrost/plus microscopic slides	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029	1/2000 dilution