Modelo de inoculação do footpad do mouse para estudar respostas neuroinflamatórias induzidas pelo viral

Resumo

O modelo de inoculação do footpad é uma ferramenta valiosa para caracterizar respostas neuroinflamatórias invulgadas pelo viral in vivo. Em particular, fornece uma avaliação clara da cinética viral e processos imunopatológicos associados iniciados no sistema nervoso periférico.

Resumo

Este protocolo descreve um modelo de inoculação de footpad usado para estudar a iniciação e o desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias durante a infecção por alphaherpesvírus em camundongos. Como os alfaherpesvírus são os principais invasores do sistema nervoso periférico (PNS), este modelo é adequado para caracterizar a cinética da replicação viral, sua disseminação da PNS para o CNS e respostas neuroinflamatórias associadas. O modelo de inoculação do footpad permite que partículas de vírus se espalhem de um local de infecção primária no pênco epiderme para fibras nervosas sensoriais e simpáticas que inervam a epiderme, glândulas sudoríparas e derme. A infecção se espalha através do nervo ciático para a gânglio raiz dorsal (DRG) e, finalmente, através da medula espinhal para o cérebro. Aqui, um footpad de rato é inoculado com o vírus pseudorabies (PRV), um alphaherpesvirus intimamente relacionado ao vírus herpes simplex (HSV) e ao vírus varicela-zoster (VZV). Este modelo demonstra que a infecção por PRV induz inflamação grave, caracterizada pela infiltração de neutrófilos no footpad e DRG. Altas concentrações de citocinas inflamatórias são posteriormente detectadas em tecidos homogeneizados pela ELISA. Além disso, observa-se uma forte correlação entre a expressão genética prv e proteína (via qPCR e se coloração) em DRG e a produção de citocinas pró-inflamatórias. Portanto, o modelo de inoculação do footpad proporciona uma melhor compreensão dos processos subjacentes às neuropatias induzidas pelo alfaherpesvírus e pode levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Além disso, o modelo pode orientar pesquisas sobre neuropatias periféricas, como esclerose múltipla e danos induzidos por virais associados à PNS. Em última análise, pode servir como uma ferramenta in vivo econômica para o desenvolvimento de medicamentos.

Introdução

Este estudo descreve um modelo de inoculação de footpad para investigar a replicação e disseminação de vírus da PNS para o CNS e respostas neuroinflamatórias associadas. O modelo de inoculação do footpad tem sido intensamente utilizado para estudar a infecção por alfaherpesvírus nos neurônios^1,,2,3. O principal objetivo deste modelo é permitir que os vírus neurotrópicos percorram uma distância máxima através da PNS antes de atingir o CNS. Aqui, este modelo é usado para obter novas percepções no desenvolvimento de uma neuropatia particular (coceira neuropática) em camundongos infectados com o vírus pseudorabies (PRV).

PRV é um alphaherpesvirus relacionado a vários patógenos conhecidos (ou seja, herpes simplex tipo 1 e 2 [HSV1 e HSV2] e vírus varicela-zoster [VZV]), que causam feridas frias, lesões genitais e catapora,^{respectivamente 4}. Esses vírus são todos pantrópicos e capazes de infectar muitos tipos de células diferentes sem mostrar afinidade por um tipo específico de tecido. No entanto, todos eles exibem um neurotropismo característico invadindo a PNS (e ocasionalmente, o CNS) de espécies hospedeiras. O hospedeiro natural é o porco, mas o PRV pode infectar a maioria dos mamíferos. Nesses hospedeiros não naturais, o PRV infecta a PNS e induz um prurido grave chamado "coceira louca", seguido de morte peraguada^5,6. O papel da resposta neuroimune no desfecho clínico e na patogênese da infecção pelo PRV tem sido mal compreendido.

O modelo de inoculação do footpad permite que o PRV inicie a infecção nas células epidérmicas do footpad. Em seguida, a infecção se espalha em fibras nervosas sensoriais e simpáticas que inervam a epiderme, as glândulas sudoríparas e a derme. A infecção se espalha por partículas de vírus movendo-se através do nervo ciático para o DRG dentro de aproximadamente 60 h. A infecção se espalha pela medula espinhal, atingindo o cérebro traseiro quando os animais ficam moribundos (82 h pós-infecção). Durante esta janela de tempo, amostras de tecido podem ser coletadas, processadas e analisadas para replicação de vírus e marcadores da resposta imune. Por exemplo, o exame histológico e a quantificação da carga viral podem ser realizados em diferentes tecidos para estabelecer correlações entre o início e o desenvolvimento de processos clínicos, virológicos e neuroinflamatórios na patogênese prv.

Utilizando o modelo de inoculação do footpad, os mecanismos celulares e moleculares do prurido induzido pelo PRV em camundongos podem ser investigados. Além disso, este modelo pode fornecer uma nova visão sobre a iniciação e desenvolvimento da neuroinflamação induzida pelo vírus durante infecções por herpesvírus. Uma melhor compreensão dos processos subjacentes a neuropatias induzidas por alphaherpesvírus pode levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. Por exemplo, este modelo é útil para investigar os mecanismos de coceira neuropática em pacientes com lesões pós-herpéticas (por exemplo, herpes zoster, telhas) e testar novos alvos terapêuticos em camundongos para as doenças humanas correspondentes.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com um protocolo (número 2083-16 e 2083-19) revisado e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados e Uso de Animais da Instituição (IACUC) da Universidade de Princeton. Este trabalho foi feito seguindo rigorosamente os requisitos de nível 2 (BSL-2) de biossegurança, aos quais temos um laboratório totalmente equipado aprovado pelo comitê de biossegurança da Universidade de Princeton. Os procedimentos, incluindo abrasão do pé do rato, inoculação viral, dissecção de camundongos e coleta de tecidos foram realizados em um gabinete de segurança biológica (BSC) na sala de biocontenção de animais da Universidade de Princeton. Os que realizaram o procedimento usavam vestidos descartáveis, cobertura da cabeça, proteção ocular, luvas estéreis, máscaras cirúrgicas e capas de sapato.

1. Abrasão do footpad do mouse

1. Anestesia um rato C57BL/6 (5-7 semanas de idade) com anestésico de gás isoflurane, entregue a uma dosagem de 3% através de um pequeno sistema de anestesia (câmara).
   1. Coloque o rato no plano cirúrgico da anestesia nas costas, antes da inoculação, no fundo do pé traseiro. Conecte um cone de nariz com um diafragma (uma fenda suficientemente dimensionada para caber a focinheira do animal) ao rato e entregue anestésico de gás isoflurane a uma dose constante de 1,5%-2,0%.
   2. Monitore de perto o mouse para uma resposta a estímulos dolorosos criados por beliscões forçadas do dedo do dedo do dedo com fórceps.
2. Segure levemente um footpad traseiro com fórceps planos.
   1. Abrade suavemente a pele glabrous do footpad traseiro aproximadamente 20x, entre o calcanhar e as almofadas de caminhada, com uma placa emery (100-180 grão). Não induza o sangramento por abradas com muita frequência ou aplicando muita pressão.
   2. Usando fórceps finos, retire lentamente o estrato corneum destacado pela abrasão para expor o basale estrato.

2. Inoculação do bloco de rodas PRV

1. Prepare o vírus inóculo diluído ao titer desejado em mídia DMEM contendo 2% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina(Tabela de Materiais).
   1. Quantita o número de unidades formadoras de placas (PFU) no estoque de vírus em células PK15 para calcular e padronizar a dose viral e diluir o inóculo viral em conformidade.
      NOTA: Neste estudo, foi utilizada cepa virulenta de PRV-Becker (PRV-Becker) em dose de 8 x 10⁶ PFU. Esta dose foi otimizada em um experimento preliminar anterior para garantir que todos os animais vacinados apresentassem sintomas clínicos em 82 h pós-inoculação (hpi).
   2. Mantenha o vírus inóculo no gelo e misture suavemente antes de usar.
2. Adicione uma gotícula de 20 μL de inóculo do vírus (8 x 10⁶ PFU) no footpad abraded (administração tópica). Realizar inoculações simuladas (somente médias) em paralelo.
3. Esfregue suavemente 10x com o eixo de uma agulha para facilitar a adsorção do vírus. Evite coçar com o ponto da agulha. Repita este passo a cada 10 minutos.
4. Mantenha o rato sob anestesia por 30 minutos até que o bloco de pés abrasado esteja seco.
5. Depois de parar a anestesia, monitore o camundongo até que ele possa manter a recumbência severa e colocá-lo em uma gaiola individual para acompanhamento clínico e amostragem.

3. Dissecção de ratos e coleta de tecidos

1. Em momentos apropriados após a infecção, eutanize o camundongo pelo método de asfixia (CO₂).
   NOTA: Neste estudo, o ponto final humano (quando os animais começam a apresentar sintomas terminais) para camundongos infectados pelo PRV-Becker é de 82 hpi. Eutanize animais de controle em paralelo.
2. Coloque o lado ventral do mouse voltado para cima em um tapete cirúrgico usando agulhas/pinos. Fixar os membros do rato com pinos em uma placa de espuma cirúrgica. Molhe o lado ventral do mouse com 70% de etanol para minimizar a contaminação da pele.
3. Aperte a camada externa de pele e pele usando fórceps e faça uma pequena incisão inicial usando uma tesoura fina perto da abertura uretral.
   1. A partir desta abertura, continue a incisão no lado ventral médio até o queixo.
   2. Estenda duas incisões laterais em direção às extremidades dos membros dianteiros e traseiros.
   3. Separe a pele da camada muscular subjacente e fixe para baixo para o lado.
   4. Abra a cavidade abdominal e incise até a base do tórax. Complete a abertura da cavidade abdominal fazendo duas incisões transversais.
   5. Abra a cavidade torácica cortando o diafragma e as costelas em ambos os lados laterais.
      NOTA: Cortar as laterais da caixa torácica evita o risco de cortar o coração.
   6. Coletar órgãos expostos, incluindo coração, pulmões, baço, pâncreas, fígado, rins e bexiga em microtubos de 1,5 mL. Mantenha os tubos no gelo.
   7. Corte o bloco de pé abrasado entre o calcanhar e as almofadas de caminhada e coloque o pedaço de tecido em um tubo, conforme descrito na etapa 3.3.6.
4. Coloque o lado dorsal do rato para cima e molhe a pele com 70% de etanol. Corte a camada da pele para expor a coluna vertebral.
   1. Faça uma pequena incisão na região da pélvis. Retire a pele dos membros traseiros em direção à cabeça.
   2. Remova as pernas e braços cortando com uma tesoura paralela e próxima à coluna vertebral de ambos os lados.
   3. Corte a cabeça na base do crânio (nível C1-C2).
   4. Abra o crânio com uma tesoura do forame magnum até o osso frontal.
   5. Puxe o crânio em direções laterais usando fórceps.
   6. Retire suavemente o cérebro usando fórceps e prossiga como descrito na etapa 3.3.6.
5. Limpe a coluna vertebral cortando músculos, gorduras e tecidos moles usando tesouras curvas. Corte a cauda. Coloque a coluna vertebral intacta em um tubo de 15 mL contendo soro fisiológico estéril tamponado com fosfato (PBS). Mantenha os tubos no gelo até uma dissecção adicional da medula espinhal e drg.

4. Extração da medula espinhal e DRG

NOTA: Extrair medula espinhal e DRG da coluna vertebral após a dissecção do rato. O protocolo para extração da medula espinhal e DRG foi adaptado de uma publicação anterior⁷.

1. Remova a coluna de vértebras do tubo PBS gelado e remova os tecidos moles restantes, o que se torna mais fácil após a refrigeração.
2. Faça três cortes transversais na coluna através das vértebras (níveis T1, L1 e S2) usando uma lâmina de barbear. Coloque as três peças em uma placa de Petri de 15 mm contendo PBS estéril e gelada. Acompanhe e marque a origem dos segmentos para análise posterior.
3. Pegue um segmento e fixe-o entre fórceps, lado dorsal voltado para cima. Faça um único corte longitudinal através da linha média usando uma lâmina de barbear, dividindo a coluna em duas metades iguais.
4. Coloque ambas as metades em uma nova placa de Petri contendo novo PBS gelado estéril. Certifique-se de que a orientação correta do segmento seja capaz de distinguir os lados esquerdo e direito.
5. Sob um microscópio dissecando, retire suavemente a medula espinhal da coluna vertebral de cada metade em uma direção rostral para caudal usando fórceps finos.
6. Colete as duas metades da medula espinhal em microtubos de 1,5 mL contendo 500 μL de PBS gelado estéril. Mantenha os tubos no gelo.
7. Remova suavemente as meninges de um lado da coluna vertebral para o outro para expor o DRG.
8. Remova cada DRG individualmente, agarrando o nervo espinhal exposto e puxe-o suavemente para fora da coluna vertebral. Coloque o DRG coletado em uma placa de Petri de 15 mm contendo PBS gelada. Colher todos os DRG ipsilaterais e contralaterais separadamente do segmento da coluna vertebral e proceder conforme descrito na etapa 4.5.
   NOTA: O DRG é visível como uma estrutura transparente redonda ao longo do nervo espinhal branco.
9. Repetir as etapas 4.3-4.7 usando os dois outros segmentos da coluna vertebral dentro de 30-45 min.
10. Centrifugar todos os tubos em alta velocidade (17.900 x g) por 3 min a 4 °C.
11. Aspirar tubos supernascidas e flash-freeze em nitrogênio líquido. Armazene tubos a -80 °C para maior homogeneização tecidual.
12. Alternativamente, fixe e se sectionia os tecidos drg limpos e outros camundongos para análises histopatológicas e/ou coloração de imunofluorescência após a etapa 4.9.

5. Homogeneização de tecidos

1. Descongele os tubos contendo amostras de tecido congelado no gelo.
2. Pesar 100 mg de tecido e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo uma conta de aço estéril e 500 μL de tampão RIPA contendo 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS, e comprimidos inibidores de coquetel de protease.
3. Interrompa os tecidos à temperatura ambiente (RT) usando um homogeneizador a 20 ciclos/s por 2 minutos, seguido por um período de espera de 1 min, depois 20 ciclos/s por 2 min.
4. Centrifugar o tubo em alta velocidade (17.900 x g) por 10 min no RT.
5. Colete supernasal (500 μL) em um novo tubo e armazene-o a -20 °C até realizar ELISA e qPCR para quantificar marcadores inflamatórios e cargas virais, respectivamente.
   NOTA: Para qPCR, colete todas as amostras com material livre de RNase (ou seja, contas, tubos, etc.) e interrompa tecidos com tampão de lla lysis de RNA contendo 1% de betamercaptoetanol(Tabela de Materiais).

6. Preparação e coloração de imunofluorescência de seções de DRG congelados

1. Processamento de tecidos
   1. Fixar o DRG dissecado e limpo em 1% de paraformaldeído (PFA) por 2 h no RT.
   2. Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 10% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.
   3. Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 20% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.
   4. Transfira o tecido para um tubo de 15 mL com 30% de sacarose em PBS. Incubar durante a noite a 4 °C.
   5. Incorpore tecidos em OUTUBRO usando uma criomold e coloque blocos em gelo seco para congelamento rápido.
   6. Armazene as amostras a -80 °C até usar.
2. Preparação de criosectioning
   1. Remova o bloco congelado a partir de -80 °C e deixe-o equilibrar na temperatura da câmara criostat por 30 minutos.
   2. Criosection o DRG a uma espessura de 15 μm e montar as seções em slides.
   3. Use uma caneta para desenhar um círculo hidrofóbico em torno do tecido montado em slides.
   4. Mantenha os slides a 4 °C até coloração.
3. Coloração de imunofluorescência
   1. Lave as seções DRG 3x em PBS por 10 minutos no RT.
   2. Incubar as seções com 100 μL de anticorpo primário desejado (por exemplo, anticorpo do rato contra glicoproteína PRV B) por 1 h a 37 °C. Diluir o anticorpo primário em PBS contendo soro de cabra 10% negativo.
   3. Repita o passo 6.3.1.
   4. Incubar as seções com 100 μL de anticorpo secundário desejado (anti-rato de cabra Alexa Fluor 488) por 50 min a 37 °C. Diluir anticorpo secundário apenas na PBS.
   5. Adicione 100 μL de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenildole) diluído em PBS na seção. Incubar ainda amostras 10 min a 37 °C.
   6. Repita o passo 6.3.1.
   7. Monte as amostras usando um meio de montagem de fluorescência em lâminas de vidro e proteja e cubra com tampa.

7. Preparação e coloração de H&E de seções de tecido embarcadas parafina

1. Fixar o tecido em 10% de formalina por 24 h a 4 °C.
2. Realize o cronograma de processamento padrão para incorporação e secção de tecidos fixos. Transferir tecidos fixos para 70% de etanol e processar através de álcoois atualizados para xileno seguido de parafina, como descrito anteriormente⁸.
   NOTA: Use esponjas de poliéster para manter pequenas amostras de tecido, como DRG dentro de fitas.
3. Realizar a desparafinação padrão seguida de coloração de H&E de seções teciduais, como descrito anteriormente⁹.

Resultados

O modelo de inoculação do pé do mouse permite a caracterização da imunopagênese da infecção alfaherpesvírus in vivo, incluindo a replicação e disseminação da infecção do bloco de pés inoculado para o sistema nervoso e a indução de respostas neuroinflamatórias específicas.

Neste estudo, primeiro abrasamos o pé traseiro do rato e, seja simulado ou inoculado na região abradada, com uma cepa virulenta de PRV-Becker. O local de abrasão era visível no bloco de controle. Uma c...

Discussão

O modelo de inoculação do footpad descrito aqui é útil para investigar a iniciação e o desenvolvimento de respostas neuroinflamatórias durante a infecção por alfaherpesvírus. Além disso, este modelo in vivo é usado para estabelecer a cinética da replicação e disseminação do alphaherpesvirus da PNS para o CNS. Trata-se de um alternado para outros modelos de inoculação, como o modelo de inoculação da pele flanco, que conta com arranhões dérmicos profundos¹³, ou a rota intracra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-PRV gB	Made by the lab		1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red	Fisher scientific	2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)	Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks)	The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml)	Fisher scientific	62248	1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm	Sigma-Aldrich	P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
Fine curved scissors stainless steel	FST	14095-11
Fluoromount-G mounting media	Fisher scientific	0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Isothesia Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml	Denville Scientific	1000945
Microtube 1.5ml	SARSTEDT	72692005
Negative goat serum	Vector	S-1000
Penicillin/Streptomycin	Gibco	154022
Precision Glide needle 18G	BD	305196
Razor blades steel back	Personna	9412071
RNA lysis buffer (RLT)	Qiagen	79216
Stainless Steel Beads, 5 mm	Qiagen	69989
Superfrost/plus microscopic slides	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029	1/2000 dilution