Modèle d’inoculation de tapis de souris pour étudier les réponses neuroinflammatoires virales induites

Résumé

Le modèle d’inoculation de la carte de pied est un outil précieux pour caractériser les réponses neuroinflammatoires induites par le virus in vivo. En particulier, il fournit une évaluation claire de la cinétique virale et des processus immunopathologiques associés initiés dans le système nerveux périphérique.

Résumé

Ce protocole décrit un modèle d’inoculation de pied-pad utilisé pour étudier l’initiation et le développement des réponses neuroinflammatoires pendant l’infection d’alphaherpesvirus chez la souris. Comme les alphaherpesvirus sont les principaux envahisseurs du système nerveux périphérique (PNS), ce modèle est approprié pour caractériser la cinétique de la réplication virale, sa propagation du PNS au SNC, et les réponses neuroinflammatoires associées. Le modèle d’inoculation de la carte de pied permet aux particules virales de se propager d’un site d’infection primaire dans l’épiderme du pavé du pied aux fibres nerveuses sensorielles et sympathiques qui innervate l’épiderme, les glandes sudoripares et le derme. L’infection se propage par l’intermédiaire du nerf sciatique aux ganglions de racine dorsale (DRG) et finalement par la moelle épinière au cerveau. Ici, un tapis de souris est inoculé avec le virus pseudorabies (PRV), un alphaherpesvirus étroitement lié au virus de l’herpès simplex (HSV) et au virus varicelle-zoster (VZV). Ce modèle démontre que l’infection de PRV induit l’inflammation grave, caractérisée par l’infiltration de neutrophile dans le pavé et le DRG. Des concentrations élevées de cytokines inflammatoires sont par la suite détectées dans les tissus homogénéisés par ELISA. En outre, une forte corrélation est observée entre le gène PRV et l’expression des protéines (via qPCR et si coloration) dans DRG et la production de cytokines pro-inflammatoires. Par conséquent, le modèle d’inoculation de la piéillère permet de mieux comprendre les processus sous-jacents aux neuropathies induites par l’alphaherpesvirus et peut mener à l’élaboration de stratégies thérapeutiques novatrices. En outre, le modèle peut guider la recherche sur les neuropathies périphériques, telles que la sclérose en plaques et les dommages induits par le virus associés à la PNS. En fin de compte, il peut servir d’outil in vivo rentable pour le développement de médicaments.

Introduction

Cette étude décrit un modèle d’inoculation de la paillère pour étudier la réplication et la propagation des virus du SNP au SNC et les réponses neuroinflammatoires associées. Le modèle d’inoculation de la passerelle a été intensivement utilisé pour étudier l’infection à l’alphaherpesvirus dans les neurones^1,2,3. L’objectif principal de ce modèle est de permettre aux virus neurotropes de parcourir une distance maximale à travers le PNS avant d’atteindre le SNC. Ici, ce modèle est utilisé pour obtenir de nouvelles idées dans le développement d’une neuropathie particulière (démangeaisons neuropathiques) chez les souris infectées par le virus pseudorabies (PRV).

Le PRV est un alphaherpesvirus lié à plusieurs agents pathogènes bien connus (c.-à-d. l’herpès simplex de type 1 et 2 [HSV1 et HSV2] et le virus varicelle-zoster [VZV]), qui causent respectivement des boutons de fièvre, des lésions génitales et la^{varicelle, respectivement 4}. Ces virus sont tous pantropes et capables d’infecter de nombreux types de cellules différents sans montrer d’affinité pour un type de tissu spécifique. Cependant, ils présentent tous un neurotropisme caractéristique en envahissant le PNS (et parfois, le SNC) des espèces hôtes. L’hôte naturel est le porc, mais le PRV peut infecter la plupart des mammifères. Dans ces hôtes non naturels, prv infecte le PNS et induit un prurit sévère appelé la « émite foll », suivie par la mort peracute^5,6. Le rôle de la réponse neuroimmune dans les résultats cliniques et la pathogénie de l’infection de PRV a été mal compris.

Le modèle d’inoculation de la héliporte permet au PRV d’initier l’infection dans les cellules épidermiques du pavé. Ensuite, l’infection se propage dans les fibres nerveuses sensorielles et sympathiques qui innervate l’épiderme, les glandes sudoripares, et le derme. L’infection se propage par des particules virales se déplaçant via le nerf sciatique au DRG dans environ 60 h. L’infection se propage par la moelle épinière, atteignant finalement le cerveau postérieur lorsque les animaux deviennent moribondes (82 h après l’infection). Pendant cette période, des échantillons de tissus peuvent être prélevés, traités et analysés pour la réplication du virus et les marqueurs de la réponse immunitaire. Par exemple, l’examen histologique et la quantification de charge virale peuvent être exécutés dans différents tissus pour établir des corrélations entre l’initiation et le développement des processus cliniques, virologiques, et neuroinflammatoires dans la pathogénie de PRV.

À l’aide du modèle d’inoculation du pavé de pieds, les mécanismes cellulaires et moléculaires du prurit induit par le PRV chez la souris peuvent être étudiés. En outre, ce modèle peut fournir un nouvel aperçu de l’initiation et le développement de la neuroinflammation induite par le virus pendant les infections à herpèsvirus. Une meilleure compréhension des processus sous-jacents aux neuropathies induites par l’alphaherpesvirus peut mener à l’élaboration de stratégies thérapeutiques novatrices. Par exemple, ce modèle est utile pour étudier les mécanismes de démangeaisons neuropathiques chez les patients présentant des lésions post-herpétiques (par exemple, herpès zoster, zona) et tester de nouvelles cibles thérapeutiques chez les souris pour les maladies humaines correspondantes.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément à un protocole (numéro 2083-16 et 2083-19) examiné et approuvé par l’Institution Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Princeton. Ce travail a été effectué en suivant strictement les exigences de niveau de biosécurité 2 (BSL-2), auxquelles nous disposons d’un laboratoire entièrement équipé approuvé par le comité de biosécurité de l’Université de Princeton. Les procédures, y compris l’abrasion du tapis de souris, l’inoculation virale, la dissection de souris et la collecte des tissus, ont été effectuées dans un cabinet de sécurité biologique (BSC) dans la salle des installations pour animaux de biocontainment de l’Université de Princeton. Ceux qui effectuaient la procédure portaient des robes jetables, un couvre-chef, une protection oculaire, des gants stériles, des masques chirurgicaux et des couvre-chaussures.

1. Abrasion de tapis de souris

1. Anesthésiez une souris C57BL/6 (5 à 7 semaines) avec anesthésique au gaz isoflurane, livré à une dose de 3% via un petit système d’anesthésie (chambre).
   1. Placez la souris dans le plan chirurgical de l’anesthésie sur son dos, avant l’inoculation, dans le pavé arrière. Attachez un cône de nez avec un diaphragme (une fente suffisamment dimensionnée pour s’adapter au museau de l’animal) à la souris et délivrez un anesthésique au gaz isoflurane à une dose constante de 1,5%–2,0%.
   2. Surveillez de près la souris pour une réponse à un stimulus douloureux créé par le pincement puissant de l’orteil avec des forceps.
2. Saisissez légèrement un pavé arrière avec des forceps plats.
   1. Abrade doucement la peau glabrous du pavé arrière environ 20x, entre le talon et les garnitures de marche, avec une planche d’émeri (100–180 grain). N’induisez pas de saignements en abrasant trop fréquemment ou en appliquant trop de pression.
   2. À l’aide de forceps fines, éplucher lentement le corneum de strate détaché par abrasion pour exposer la couche basale.

2. Inoculation de la hpv

1. Préparer le virus inoculum dilué au ditre souhaité dans les milieux DMEM contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine (Tableau des matériaux).
   1. Quantiter le nombre d’unités de formation de plaques (PFU) dans le stock de virus sur les cellules PK15 pour calculer et normaliser la dose virale et diluer l’inoculum viral en conséquence.
      NOTE : Dans cette étude, la souche virulente de PRV-Becker a été employée à une dose de 8 x 10⁶ PFU. Cette dose a été optimisée dans une expérience préliminaire précédente pour s’assurer que tous les animaux inoculés ont montré des symptômes cliniques à 82 h après l’inoculation (hpi).
   2. Gardez le virus inoculum sur la glace et mélangez doucement avant utilisation.
2. Ajouter une gouttelette de virus de 20 μL (8 x 10⁶ PFU) sur le pavé abrasé (administration topique). Effectuer des inoculations simulées (moyennes seulement) en parallèle.
3. Frottez doucement 10x avec l’arbre d’une aiguille pour faciliter l’adsorption du virus. Évitez de gratter avec le point d’aiguille. Répétez cette étape toutes les 10 minutes.
4. Gardez la souris sous anesthésie pendant 30 min jusqu’à ce que le pavé est sec.
5. Après l’arrêt de l’anesthésie, surveiller la souris jusqu’à ce qu’elle puisse maintenir le réumbétrie sternale et la placer dans une cage individuelle pour le suivi clinique et l’échantillonnage.

3. Dissection de souris et collecte de tissus

1. Aux moments appropriés après l’infection, euthanasier la souris par la méthode d’asphyxie (CO₂).
   NOTE : Dans cette étude, le critère d’évaluation humain (lorsque les animaux commencent à présenter des symptômes terminaux) pour les souris infectées par le PRV-Becker est de 82 hpi. Euthanasier les animaux de contrôle en parallèle.
2. Placez le côté ventral de la souris vers le haut sur un tapis chirurgical à l’aide d’aiguilles/broches. Fixer les membres de la souris avec des épingles à une planche de mousse chirurgicale. Mouiller le côté ventral de la souris avec 70% d’éthanol pour minimiser la contamination par la fourrure.
3. Pincez la couche externe de fourrure et de peau à l’aide de forceps et faites une petite incision initiale à l’aide de ciseaux fins près de l’ouverture urétrale.
   1. De cette ouverture, continuer l’incision sur le côté ventral milieu jusqu’au menton.
   2. Étendre deux incisions latérales vers les extrémités des membres antérieurs et des membres postérieurs.
   3. Séparez la peau de la couche musculaire sous-jacente et épinglez vers le bas sur le côté.
   4. Ouvrez la cavité abdominale et incisez jusqu’à la base du thorax. Terminez l’ouverture de la cavité abdominale en faisant deux incisions transversales.
   5. Ouvrez la cavité thoracique en coupant le diaphragme et les côtes des deux côtés latéraux.
      REMARQUE : Couper les côtés de la cage thoracique empêche le risque de couper le cœur.
   6. Recueillir les organes exposés, y compris le cœur, les poumons, la rate, le pancréas, le foie, les reins et la vessie dans des microtubes de 1,5 mL. Gardez les tubes sur la glace.
   7. Coupez le pavé abrasé entre le talon et les coussinets de marche et placez le morceau de tissu dans un tube tel que décrit à l’étape 3.3.6.
4. Placez le côté dorsal de la souris vers le haut et mouillez la fourrure avec 70% d’éthanol. Coupez la couche cutanée pour exposer la colonne vertébrale.
   1. Faire une petite incision dans la région du bassin. Dépouiller la peau des membres postérieurs vers la tête.
   2. Retirez les jambes et les bras en coupant avec des ciseaux parallèles et proches de la colonne vertébrale des deux côtés.
   3. Couper la tête à la base du crâne (niveau C1–C2).
   4. Ouvrez le crâne avec des ciseaux du magnum foramen à l’os frontal.
   5. Ouvrez le crâne dans des directions latérales à l’aide de forceps.
   6. Retirez doucement le cerveau à l’aide de forceps et procédez comme décrit à l’étape 3.3.6.
5. Nettoyez la colonne vertébrale en coupant les muscles, les graisses et les tissus mous à l’aide de ciseaux incurvés. Coupez la queue. Placez la colonne vertébrale intacte dans un tube de 15 ml contenant de la solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) Gardez les tubes sur la glace jusqu’à ce que la dissection de la moelle épinière et DRG.

4. Extraction de la moelle épinière et du DRG

REMARQUE : Extraire la moelle épinière et le DRG de la colonne des vertèbres suivant directement la dissection de souris. Le protocole pour l’extraction de la moelle épinière et du DRG a été adapté d’une publication précédente⁷.

1. Retirez la colonne des vertèbres du tube de PBS glacé et retirez les tissus mous restants, ce qui devient plus facile après la réfrigération.
2. Faire trois coupes transversales dans la colonne à travers les vertèbres (niveaux T1, L1 et S2) à l’aide d’une lame de rasoir. Placer les trois morceaux dans une boîte de Pétri de 15 mm contenant des PBS stériles glacés. Gardez une trace et marquez l’origine des segments pour une analyse ultérieure.
3. Prenez un segment et fixez-le entre les forceps, côté dorsal orienté vers le haut. Faire une coupe simple et longitudinale à travers la ligne médiane à l’aide d’une lame de rasoir, en divisant la colonne en deux moitiés égales.
4. Placer les deux moitiés dans une nouvelle boîte de Pétri contenant de nouveaux PBS stériles glacés. Assurez-vous de l’orientation correcte du segment pour être en mesure de distinguer les côtés gauche et droit.
5. Sous un microscope disséquant, peler doucement la moelle épinière de la colonne des vertèbres de chaque moitié dans une direction rostral à caudale en utilisant des forceps fins.
6. Recueillir les deux moitiés de la moelle épinière dans des microtubes de 1,5 mL contenant 500 μL de PBS stériles glacés. Gardez les tubes sur la glace.
7. Retirez doucement les méninges d’un côté de la colonne vertébrale à l’autre pour exposer le DRG.
8. Retirez chaque DRG individuellement en saisissant le nerf spinal exposé et tirez-le doucement hors de la colonne vertébrale. Placez le DRG collecté dans une boîte de Pétri de 15 mm contenant du PBS glacé. Récoltez tous les DRG ipsilateral et contralatéral séparément du segment de la colonne vertébrale et procédez comme décrit à l’étape 4.5.
   REMARQUE : Le DRG est visible sous forme de structure transparente ronde le long du nerf rachidien blanc.
9. Répétez les étapes 4.3–4.7 à l’aide des deux autres segments de colonne vertébrale dans un délai de 30 à 45 min.
10. Centrifuge tous les tubes à grande vitesse (17 900 x g)pendant 3 min à 4 °C.
11. Remplacer les tubes supernatants et le gel éclair dans l’azote liquide. Conserver les tubes à -80 °C pour d’autres homogénéisations tissulaires.
12. Alternativement, fixer et sectionr le DRG nettoyé et d’autres tissus de souris pour les analyses histopathologiques et/ou la coloration d’immunofluorescence après l’étape 4.9.

5. Homogénéisation des tissus

1. Décongeler les tubes contenant des échantillons de tissus congelés sur la glace.
2. Pesez 100 mg de tissu et placez-le dans un tube de microcentrifuge de 2 ml contenant une perle d’acier stérile et 500 μL de tampon RIPA contenant 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 1 M Tris-HCl (pH = 8,0), 5 M NaCl, 10% SDS, et comprimés de cocktail protease.
3. Perturber les tissus à température ambiante (RT) à l’aide d’un homogénéisant à 20 cycles/s pendant 2 min, suivi d’une période d’attente de 1 min, puis 20 cycles/s pendant 2 min.
4. Centrifuger le tube à grande vitesse (17 900 x g)pendant 10 min à RT.
5. Recueillir le supernatant (500 μL) dans un nouveau tube et le stocker à -20 °C jusqu’à ce qu’il effectue des ELISA et des qPCR pour quantifier les marqueurs inflammatoires et les charges virales, respectivement.
   REMARQUE : Pour qPCR, prélever tous les échantillons avec du matériel sans RNase (c.-à-d. perles, tubes, etc.) et perturber les tissus avec tampon de lyse d’ARN contenant 1% de bêtamercaptoéthanol (Table des matériaux).

6. Coloration de préparation et d’immunofluorescence des sections congelées de DRG

1. Traitement des tissus
   1. Fixer le DRG disséqué et nettoyé dans 1% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 2 h à RT.
   2. Transférer le tissu dans un tube de 15 ml avec 10% de saccharose dans PBS. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   3. Transférer le tissu dans un tube de 15 ml avec 20% de saccharose dans PBS. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   4. Transférer le tissu dans un tube de 15 ml avec 30% de saccharose dans PBS. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   5. Incorporer les tissus dans les PTOM à l’aide d’un cryomold et placer des blocs dans de la glace sèche pour un gel rapide.
   6. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à l’utilisation.
2. Préparation de cryosection
   1. Retirer le bloc gelé de -80 °C et laisser équilibrer à la température de la chambre cryostat pendant 30 min.
   2. Cryosection du DRG à une épaisseur de 15 μm et monter les sections sur des lames.
   3. Utilisez un stylo pour dessiner un cercle hydrophobe autour du tissu monté sur diapositives.
   4. Conserver les lames à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient tachées.
3. Coloration d’immunofluorescence
   1. Laver les sections DRG 3x dans PBS pendant 10 min à RT.
   2. Incuber les sections avec 100 μL d’anticorps primaires désirés (p. ex., anticorps de souris contre la glycoprotéine B de PRV) pendant 1 h à 37 °C. Diluer l’anticorps primaire dans pbs contenant 10% de sérum de chèvre négatif.
   3. Répétez l’étape 6.3.1.
   4. Incuber les sections avec 100 μL d’anticorps secondaires désirés (anti-souris de chèvre Alexa Fluor 488) pendant 50 min à 37 °C. Diluer l’anticorps secondaire dans PBS seulement.
   5. Ajouter 100 μL de colorant DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) dilué dans PBS sur la section. D’autres échantillons d’incubation 10 min à 37 °C.
   6. Répétez l’étape 6.3.1.
   7. Monter les échantillons à l’aide d’un milieu de montage de fluorescence sur des lames de verre et fixer et couvrir avec couvercle.

7. Préparation et coloration H&E des sections de tissus incorporés paraffine

1. Fixer le tissu dans 10% de formaline pendant 24 h à 4 °C.
2. Effectuer un calendrier de traitement standard pour l’incorporation et la section de tissus fixes paraffine. Transférer les tissus fixes à 70 % d’éthanol et les traiter par des alcools améliorés en xylène suivis de la paraffine, comme décrit précédemment⁸.
   REMARQUE : Utilisez des éponges en polyester pour conserver de petits échantillons de tissus tels que DRG à l’intérieur des cassettes.
3. Effectuer la déparaffinisation standard suivie de la coloration H&E des sections de tissus, comme décrit précédemment⁹.

Résultats

Le modèle d’inoculation du tapis de souris permet la caractérisation de l’immunopathogenèse de l’infection à l’alphaherpesvirus in vivo, y compris la réplication et la propagation de l’infection du pavé de pied inoculé au système nerveux et l’induction de réponses neuroinflammatoires spécifiques.

Dans cette étude, nous avons d’abord abrasé le tapis arrière de souris et soit simulé-inoculé ou inoculé la région abrasée avec une souche virulente de PRV (PRV-Becker)...

Discussion

Le modèle d’inoculation de la piétinement décrit ici est utile pour étudier l’initiation et le développement de réponses neuroinflammatoires pendant l’infection à alphaherpesvirus. En outre, ce modèle in vivo est utilisé pour établir la cinétique de la réplication et la propagation de l’alphaherpesvirus du PNS au SNC. Il s’agit d’une alternative à d’autres modèles d’inoculation, tels que le modèle d’inoculation de la peau du flanc, qui repose sur le grattage dermique profond

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody anti-PRV gB	Made by the lab		1/500 dilution
Aqua-hold2 pap pen red	Fisher scientific	2886909
Compact emery boards-24 count (100/180 grit nail files)	Revlon
Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	11836170001
C57BL/6 mice (5-7 weeks)	The Jackson Laboratories
DAPI solution (1mg/ml)	Fisher scientific	62248	1/1000 dilution
Disposable sterile polystyrene petri dish 100 x 15 mm	Sigma-Aldrich	P5731500
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30022
Dulbecco's Phophate Buffer Saline (PBS) solution	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30028
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone, GE Healthcare life Sciences	SH30088
Fine curved scissors stainless steel	FST	14095-11
Fluoromount-G mounting media	Fisher scientific	0100-01
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Isothesia Isoflurane	Henry Schein	NDC 11695-6776-2
Microcentrifuge tube 2ml	Denville Scientific	1000945
Microtube 1.5ml	SARSTEDT	72692005
Negative goat serum	Vector	S-1000
Penicillin/Streptomycin	Gibco	154022
Precision Glide needle 18G	BD	305196
Razor blades steel back	Personna	9412071
RNA lysis buffer (RLT)	Qiagen	79216
Stainless Steel Beads, 5 mm	Qiagen	69989
Superfrost/plus microscopic slides	Fisher scientific	12-550-15
Tissue lyser LT	Qiagen	69980
Tissue-Tek OCT	Sakura	4583
488 (goat anti-mouse)	Life Technologies	A11029	1/2000 dilution