Aprendizaje automático supervisado para la semi-cuantificación del ADN extracelular en glomerulonefritis

Resumen

El ADN extracelular (ADNC) liberado durante la muerte celular es proinflamatorio y contribuye a la inflamación. La medición del ADNc en el lugar de la lesión puede determinar la eficacia del tratamiento terapéutico en el órgano diana. Este protocolo describe el uso de una herramienta de aprendizaje automático para automatizar la medición de ECDNA en el tejido renal.

Resumen

La muerte celular glomerular es una característica patológica de la vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos con mieloperoxidasa (MPO-AAV). El ácido desoxirribonucleico extracelular (ADNc) se libera durante diferentes formas de muerte celular, incluyendo apoptosis, necrosis, necroptosis, trampas extracelulares de neutrófilos (NELL) y piroptosis. La medición de esta muerte celular consume mucho tiempo con varios biomarcadores diferentes necesarios para identificar las diferentes formas bioquímicas de muerte celular. La medición del ADNc generalmente se lleva a cabo en suero y orina como sustituto del daño renal, no en el órgano diana real donde se produce la lesión patológica. La dificultad actual para investigar el ADC en el riñón es la falta de métodos para el tejido incrustado de parafina fija de formalina (FFPE) tanto experimentalmente como en biopsias renales humanas archivadas. Este protocolo proporciona un resumen de los pasos necesarios para manchar para ecDNA en el tejido FFPE (tanto humano como murino), apagar la autofluorescencia y medir el ECDNA en las imágenes resultantes utilizando una herramienta de aprendizaje automático de la segmentación de Weka de código abierto disponible públicamente. La segmentación entrenable de Weka se aplica a ecDNA dentro de los glomérulos, donde el programa aprende a clasificar el ECDNA. Este clasificador se aplica a las imágenes renales adquiridas posteriores, lo que reduce la necesidad de anotaciones manuales de cada imagen individual. La adaptabilidad de la segmentación entrenable de Weka se demuestra aún más en el tejido renal de la glomerulonefritis experimental murina anti-MPO (GN), para identificar NETs y ecMPO, contribuyentes patológicos comunes a anti-MPO GN. Este método proporciona un análisis objetivo de la ADNc en el tejido renal que demuestra claramente la eficacia en la que el programa de segmentación de Weka entrenable puede distinguir el ADNc entre el tejido renal normal sano y el tejido renal enfermo. Este protocolo se puede adaptar fácilmente para identificar ECDNA, NETs y ecMPO en otros órganos.

Introducción

La vasculitis asociada a anticuerpos citoplasmáticos anti neutrófilos de mieloperoxidasa (MPO-AAV) es una enfermedad autoinmune que produce insuficiencia renal por lesión glomerular patológica con considerable muerte celular y liberación de ácido desoxirribonucleico (ADN)^1,2. El ADN puede activar el sistema inmunitario actuando como una señal de peligro. En condiciones saludables normales, la ubicación nuclear del ADN ofrece protección contra la exposición al sistema inmunitario. El auto-ADN que se libera extracelularmente durante los procesos patógenos o la autoinmunidad es visto por el sistema inmune como un potente daño proinflamatorio asociado a la autoprotesión molecular asociada (DAMP)³. El ADN celular adicional (ADNC) se libera de las células moribundas a través de varios mecanismos distintos que se rigen por distintas vías bioquímicas, como la apoptosis, la formación de trampas extracelulares de neutrófilos necrópticos (PT), necrosis o piroptosis^{4,,5,,6,,7,,8}.

Aquí describimos métodos para manchar y medir el ECDNA liberado de las células moribundas en secciones de los riñones de parafina fija de formalina (FFPE) de las biopsias experimentales anti-MPO GN y renales de pacientes con MPO-AAV^9,10. Existen múltiples métodos para la detección de ADN de doble cadena circulante (dsDNA) y complejos de ADN tanto de suero como de orina y de ensayos in vitro^11,12. Estos métodos, aunque precisos para determinar la cantidad de ADC, no determinan dónde se libera anatómicamente el ADC. Existen métodos que describen la medición específica del ECDNA, como la tuneltosis para la apoptosis y la medición de los desechos celulares^13,,14. No hay ningún método que describa la medición de ECDNA culminó de todas las formas de muerte celular en los riñones FFPE donde se produce el daño patológico. Esto es importante para determinar si los tratamientos terapéuticos experimentales están limpiando el ADNc de los sitios de lesión patológica en el órgano diana real.

La adquisición de varias imágenes a partir de muestras de riñón crea un alto volumen de datos que es analizado comúnmente por un solo usuario. Esto requiere mucha mano de obra, consume mucho tiempo y puede estar sujeto a reproducibilidad poco fiable por parte de otros usuarios, debido al sesgo del usuario. Trainable Weka segmentation es un plugin de software de código abierto para ImageJ que utiliza herramientas bioinformáticas de vanguardia para clasificar píxeles utilizando algoritmos de aprendizaje automático^15,,16. Este método es "entrenable" por lo que aprende de la clasificación del usuario de segmentos de píxeles y aplica la nueva clasificación aprendida a otras imágenes. Este método se basa en herramientas de análisis comunes dentro del programa ImageJ que se utilizan para "clasificar" cada píxel de un segmento como perteneciente a una "clase" específica. Una vez que el programa aprende los "clasificadores", se pueden utilizar para identificar otros segmentos clasificados similares dentro de la misma imagen. A continuación, este modelo se guarda y se aplica a otros conjuntos de imágenes dentro del mismo experimento.

Los obstáculos actuales para determinar el ADC in situ en las secciones renales son la autofluorescencia endógena de la fijación en formalina y el análisis intensivo de mano de obra de las imágenes. Aquí describimos cómo apagar esta autofluorescencia, detectar ecDNA y usar el aprendizaje automático supervisado para la medición de alto rendimiento de ecDNA. Hemos publicado previamente la medición de NETs y MPO extracelular (ecMPO) utilizando una macro en ImageJ, ahora demostramos semi automatización de estos métodos utilizando el aprendizaje automático supervisado¹. Demostramos la adaptabilidad de la herramienta de aprendizaje automático, para clasificar una mancha alternativa para NETs y ecMPO dentro de la misma imagen. Estos métodos de tinción descritos aquí para detectar ECDNA, NETs y ecMPO se pueden traducir a otros órganos sólidos y enfermedades donde ecDNA, NETS y ecMPO desempeña un papel en la perpetuación de enfermedades como la artritis reumatoide y el lupus^17,,18.

Protocolo

Este método permite la detección de ecDNA pan a partir de todas las formas de muerte celular. El mismo método y anticuerpos se utilizan para el tejido de biopsia renal humana (del paso 4). Todos los sujetos animales y humanos tenían la aprobación ética de la Universidad de Monash, y Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.

1. Tinción de ECDNA con DAPI y Actin

1. Inducir un modelo de 20 días de glomerulonefritis anti-mieloperoxidasa (anti-MPO-GN) en ratones C57/Bl6 de 8-10 semanas de edad, con controles⁹.
   1. Eutanasia los ratones humanamente usando una cámara de_CO2.
   2. Retire los riñones haciendo una incisión de línea media anterior a través de la piel con tijeras, y luego corte cuidadosamente el peritoneo y vuelva a fijar en una tabla de disección. El uso de fórceps empuja a un lado la fascia renal anterior y el peritoneo parietal y corta el riñón libre cortando el uréter y los vasos sanguíneos (arteria renal y vena) en la pelvis renal. Retirar con fórceps y cortar los riñones por la mitad (plano sagital) con un bisturí de tamaño 22.
   3. Colocar el riñón en fijador (4% de formalina tamponada) durante 16 horas a temperatura ambiente (RT). Retire y remoje el riñón fijo en etanol al 30% durante 24 horas antes del procesamiento.
2. Procesar los riñones usando un ciclo estándar de 6 horas:
   70% etanol durante 15 min
   90% etanol durante 15 min
   100% etanol durante 15 min
   100% etanol durante 20 min
   100% etanol durante 25 min
   100% etanol durante 30 min
   Xileno durante 20 min
   Xileno durante 30 min
   Xileno durante 40 min
   Cera durante 30 min
   Cera durante 35 min
   Cera durante 40 min
   NOTA: Esto es importante ya que los riñones no deben ser sometidos a una exposición prolongada al calor en la cera, ya que puede destruir antígenos de interés.
3. Corte las secciones de 3 m en un microtoma y monte en diapositivas de microscopio de vidrio disponibles en el exterior recubiertas con una carga positiva. Dejar secar durante la noche.
4. Coloque los portaobjetos de vidrio en un portaobjetos en un horno de 60 oC durante 60 min.
   NOTA: Los pasos 1.3 y 1.4 son cruciales para garantizar que las secciones no floten durante el paso de recuperación del antígeno.
5. Sumerja los portaobjetos en dos cambios de disolvente (xileno o sustituto) durante 40 minutos cada uno, en una campana de humo.
6. Rehidratar diapositivas en 100% etanol, 100% etanol, 70% etanol durante 5 min cada uno. Lavar durante 5 minutos en agua del grifo.
7. Coloque una placa caliente en una campana de humo y preboil solución de recuperación de antígenos (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) en una olla a presión. Tan pronto como la solución de recuperación de antígenos comience a hervir, coloque las diapositivas en la olla horizontalmente usando un par de pinzas y bloquee la tapa. Hervir en alto (equivalente a 15 psi o 103 kPa) durante 10 min.
   NOTA: Este paso es crucial ya que recupera el antígeno de interés al desenmascarar el epitopo del antígeno (cruzado unido a través de la fijación de formalina) para permitir la unión específica del anticuerpo de epítopo de la posterior tinción no funcionará sin él.
8. Retire la olla a presión del fuego y retire la tapa inmediatamente ejecutando un grifo frío en la parte superior de la tapa en un fregadero. Deje que las diapositivas se equilibren durante 20 minutos en la solución de recuperación de antígenos.
9. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 minutos en solución salina tamponada de fosfato de 0,01 M (PBS) (pH 7.4) en un agitador orbital.
10. Utilice una pluma hidrófoba para dibujar círculos alrededor del tejido renal teniendo cuidado de no dejar que ningún tejido se seque en este tiempo.
11. Bloquear el tejido en un 10% de suero de pollo en 5% de albúmina sérica bovina (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) durante 30 min, 60 ml por sección. No lavar después de este paso, pero retirar cuidadosamente la solución de bloqueo con una pipeta de 60 l, no dejar que las secciones se sequen.
12. Aplicar un cóctel de anticuerpos primarios para la actina diluida 1/1000 en un 1% de BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 ml por sección e incubar durante la noche en una cámara de humedad a 4oC.
13. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 minutos en PBS (pH 7.4, 0.01 M) en un agitador orbital.
14. Aplicar anticuerpo secundario, pollo antiej conejo 488 (1/200), 60 ml por sección diluido en 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) durante 40 min a RT.
15. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 minutos en PBS (pH 7.4, 0.01 M) en un agitador orbital.
16. Sumérgete en un 0,3% de Sudán Negro en un 70% de etanol durante 30 min en un tarro de Coplin.
    NOTA: Este paso es importante ya que apaga la autofluorescencia causada por la fijación de formalina.
17. Lave los portaobjetos en agua del grifo para eliminar el precipitado y luego sumerja en PBS (pH 7.4, 0.01 M) durante 10 minutos para evitar que se formen más sudaneses negros.
18. Monte las correderas en los cubreobjetos de vidrio confocal utilizando tres gotas de 60 l de solución de montaje con DAPI y selle los cubreobjetos con esmalte de uñas aplicando alrededor del perímetro del cubreobjetos.
19. Permita que los portaobjetos se curen durante 24 horas en RT (para permitir que DAPI penetre) y luego almacene a 4 oC protegidos de la luz.
    NOTA: Importante mantener en la oscuridad para evitar el desvanecimiento de las sondas fluorescentes.
20. Diapositivas de imagen utilizando un cabezal de escaneo láser confocal conectado a un microscopio. Emociona las diapositivas con el láser 405 para DAPI y el láser 488 para Beta Actin. Capture imágenes de un solo plano de 1024 x 1024 píxeles mediante la captura secuencial de línea y el promedio de 4 líneas, lo que es esencial para detectar ecDNA. Se utiliza el objetivo de aceite 40x 1.0 NA.
    1. Imagen de un mínimo de 20 glomérulos por muestra. Guarde las imágenes como archivos ND2.

2. Análisis DAPI y -Actin

1. Instalar ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. Compruebe que la segmentación de Weka entrenable está disponible en Plugins . Segmentación ? Segmentación Weka entrenable.
3. Suelte la imagen en la barra de herramientas de ImageJ. Haga clic en Imagen ( Image) Color ? Dividir canales. Aparecerá una imagen con DAPI en la tinción azul todos los núcleos y aparecerá 1 imagen con é-actin en verde, que delinea los glomérulos.
   1. Cree un archivo combinado de las imágenes individuales para dibujar una región de interés (ROI) para el glomérulo haciendo clic en Color . Combinar canales. Un cuadro emergente le pedirá que asigne un color a cada canal. Después de asignar un color a cada canal, marque la casilla Crear compuesto y la casilla Mantener imágenes de origen y haga clic en Aceptar. Aparecerá una imagen compuesta combinada.
   2. Usando la tinción de actina como guía, dibuje un ROI alrededor del mechón glomerular. Mantenga esta imagen a un lado para utilizar el ROI al final de este protocolo.
4. Realice un desenfoque gaussiano en la imagen DAPI azul única. Haga clic en Proceso de proceso ( Process) Filtros ? Desenfoque gaussiano,poner en 1-2.00. La imagen ahora se verá un poco borrosa, pero los núcleos ahora son suaves y el fondo se suaviza.
   NOTA: Este paso está preformado para eliminar el ruido y limpiar la imagen de artefactos que pueden impedir la detección relevante de atributos de imagen que se analizarán.
5. Haga clic en Plugins (Plugins) Segmentación ? Segmentación Weka entrenable.
6. Usando la herramienta de línea en la barra de herramientas en ImageJ, primero trace alrededor de núcleos intactos usando las herramientas de mano libre (hay opciones de herramientas de línea, circulares y cuadradas disponibles para elegir) y luego agregue al cuadro Agregar clase 1.
7. Con la herramienta de línea de la barra de herramientas de ImageJ, defina las áreas de fondo en el cuadro Clase 2.
8. Haga clic en la etiqueta del botón Crear nueva clase en la ventana de segmentación de Weka y etiquete "ecDNA." Utilice la herramienta de línea (desde la barra de herramientas ImageJ) para delinear adn extranuclear manchado por DAPI.
9. Haga clic en el botón Clasificador de trenes en el menú de entrenamiento en la ventana de segmentación de Weka entrenable.
   NOTA: El botón STOP aparecerá en lugar del botón Clasificador de trenes y permanecerá hasta que el entrenamiento haya terminado. No haga clic en este botón durante el entrenamiento, ya que el proceso se interrumpirá.
10. Haga clic en el botón Crear resultado para crear una imagen con todos los componentes clasificados, que consta de núcleos intactos, el fondo y ecDNA identificado.
11. Haga clic en el botón Obtener probabilidad. Alternar el ratón para dar una imagen en blanco y negro de todas las clases con el objeto de selección resaltado en blanco.
12. Duplicar esta imagen haciendo clic en Imagen ? Duplicar.
13. Cambie a la pantalla con el botón del ratón que contiene el ECDNA. Aplique un umbral para obtener solamente lo que se ha identificado como ECDNA. Haga clic en Aplicar cuando el umbral sea suficiente.
14. Si después del umbral, hay más áreas de ADN que no son ecDNA, volver a la imagen entrenada original, agregar más clasificadores y repetir los pasos 2.1-2.13.
15. Haga clic en Imagen ( Image) Ajuste de la imagen ? Hacer binario. Copie el ROI glomerular realizado en el paso 2.3 y haga clic en Ctrl+Mayús+E. Active la ventana de Weka mediante Editar ? Selecciones de selección ? Restaurar, que restaura la selección. Haga clic en Analizar partículas, que solo medirá las partículas de ADNc dentro del glomérulo.
    NOTA: Una hoja de resultados se calcula con el recuento de partículas, el área, los píxeles promedio y el porcentaje del glomeróbulo que contiene ECDNA. Estos resultados se pueden exportar a una hoja de cálculo y guardarse, para su posterior análisis estadístico.
16. Guarde el clasificador como ecDNA.classifier haciendo clic en Guardar clasificador en el menú de opciones en la aplicación ImageJ del escritorio. A continuación, haga clic en Guardar datos en el menú de opciones y guárdelos como ecDNA.arff en la carpeta ImageJ. El ROI tendrá que ser añadido manualmente cada vez que el tamaño del glotemulo y la forma cambien, sin embargo el programa ha aprendido lo que es ecDNA.
17. Para volver a aplicar el modelo a imágenes posteriores, repita los pasos 2.1-2.5 con una nueva imagen. Haga clic en Cargar clasificador en el menú de opciones y, a continuación, ecDNAmodel.classifier en la carpeta ImageJ del paso 2.16. El menú de registro aparecerá y ejecutará el modelo.
18. Una vez que el modelo se haya ejecutado, haga clic en Cargar datos en el menú de opciones y seleccione el archivo ecDNA.arff guardado en la carpeta ImageJ del paso 2.16. Haga clic en Crear resultado. Si la imagen resultante no ha podido recoger todos los núcleos, el fondo o el ecDNA, haga clic en volver a entrenar clasificador y agregue más clasificadores y guarde el nuevo modelo. Complete el proceso de análisis repitiendo los pasos 2.9-2.16.
    NOTA: Se pueden utilizar varias imágenes para generar el modelo final utilizado para detectar ecDNA. Esto se logra aplicando el modelo a imágenes posteriores, agregando más clasificadores y guardando el nuevo modelo y datos en la carpeta ImageJ. Esto puede ser particularmente importante cuando diferentes muestras tienen un fondo más alto. El programa de segmentación Weka también es compatible con el lenguaje de macros ImageJ, lo que permite que muchos de los comandos sean macro grabables para automatizar algunos de los pasos.

3. Medición de trampas extracelulares de neutrófilos y ecMPO

NOTA: Este método identifica los TIL mediante la colocación del ADN extracelular, las histonas citrulinadas peptidil arginasa 4 (PAD4) y MPO.

1. Inducir un modelo de 20 días de glomerulonefritis anti-mieloperoxidasa (anti-MPO-GN) en ratones C57/Bl6 de 8-10 semanas de edad, con controles⁹.
   1. Eutanasia los ratones humanamente usando una cámara de_CO2.
   2. Retire los riñones haciendo una incisión de línea media anterior a través de la piel con tijeras, y luego corte cuidadosamente el peritoneo y vuelva a fijar en una tabla de disección. El uso de fórceps empuja a un lado la fascia renal anterior y el peritoneo parietal y corta el riñón libre cortando el uréter y los vasos sanguíneos (arteria renal y vena) en la pelvis renal. Retirar con fórceps y cortar los riñones por la mitad (plano sagital) con un bisturí de tamaño 22.
   3. Colocar el riñón en fijador (4% de formalina tamponada) durante 16 horas a temperatura ambiente (RT). Retire y remoje el riñón fijo en etanol al 30% durante 24 horas antes del procesamiento.
2. Procesar los riñones usando un ciclo estándar de 6 horas:
   70% etanol durante 15 min
   90% etanol durante 15 min
   100% etanol durante 15 min
   100% etanol durante 20 min
   100% etanol durante 25 min
   100% etanol durante 30 min
   Xileno durante 20 min
   Xileno durante 30 min
   Xileno durante 40 min
   Cera durante 30 min
   Cera durante 35 min
   Cera durante 40 min
   NOTA: Los riñones no deben ser sometidos a una exposición prolongada al calor en la cera, ya que puede destruir antígenos de interés.
3. Corte las secciones de 3 m en un microtoma y monte en diapositivas de microscopio de vidrio disponibles en el exterior recubiertas con una carga positiva. Dejar secar durante la noche
4. Coloque los portaobjetos de vidrio en un portaobjetos en un horno de 60 oC durante 60 min.
   NOTA: Los pasos 3.3-3.4 son cruciales para garantizar que las secciones no floten durante el paso de recuperación del antígeno.
5. Sumerja los portaobjetos en dos cambios de disolvente (xileno o sustituto) durante 40 minutos cada uno, en una campana de humo.
6. Rehidratar diapositivas en 100% etanol, 100% etanol, 70% etanol durante 5 min cada uno.
7. Lavar durante 5 minutos en agua del grifo.
8. Coloque una placa caliente en una campana de humo y preboil solución de recuperación de antígenos (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) en una olla a presión. Tan pronto como la solución de recuperación de antígenos comience a hervir, coloque las diapositivas en la olla horizontalmente usando un par de pinzas y bloquee la tapa. Hervir en alto (equivalente a 15 psi o 103 kPa) durante 10 min.
   NOTA: Este paso recupera el antígeno de interés desenmascarando el epítopo del antígeno (cruzado unido a través de la fijación de formalina) para permitir la unión específica de anticuerpos de epítopo, la tinción posterior no funcionará sin este paso.
9. Retire la olla a presión del fuego y retire la tapa inmediatamente ejecutando un grifo frío en la parte superior de la tapa en un fregadero. Deje que las diapositivas se equilibren durante 20 minutos en la solución de recuperación de antígenos.
10. Lave las diapositivas dos veces durante 5 minutos en solución salina tamponada de fosfato (PBS) (pH 7.4, 0.01 M) en un agitador orbital.
11. Utilice una pluma hidrófoba para dibujar círculos alrededor del tejido renal teniendo cuidado de no dejar que ningún tejido se seque en este tiempo.
12. Bloquear el tejido en un 10% de suero de pollo en 5% de albúmina sérica bovina (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) durante 30 min, 60 ml por sección. No lave después de este paso, pero retire cuidadosamente la solución de bloqueo con una pipeta de 60 l. No deje que las secciones se sequen.
13. Hacer un cóctel de los anticuerpos primarios diluidos en 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) en 1 tubo. Aplicar 60 l por secciones renales. La concentración de los anticuerpos primarios es la siguiente:
    Conejo anti humano/ratón H3Cit 1/100
    Ratón anti humano/ratón PAD4 1/50
    Cabra anti humano/ratón MPO 1/200
14. Incubar durante la noche a 4oC en una cámara de humedad.
15. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 minutos en PBS (pH 7.4, 0.01 M) en un agitador orbital.
16. Haga un cóctel de los anticuerpos secundarios en 1 tubo. Los anticuerpos secundarios se aplican en 1% de BSA/PBS, 60 ml por sección de la siguiente manera:
    Pollo antiej conejo 488 1/200.
    Pollo anti ratón 647 1/200.
    Pollo anti cabra 594 1/200.
17. Incubar en RT durante 40 min.
18. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 minutos en PBS (pH 7.4, 0.01 M) en un agitador orbital.
19. Aplicar anticuerpos secundarios 1:200 en 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) durante 40 min a RT 60 l por sección.
20. Lave los portaobjetos dos veces durante 5 minutos en PBS (pH 7.4, 0.01 M) en un agitador orbital.
21. Sumerja diapositivas en 0.3% Sudán Negro en 70% etanol durante 30 min.
22. Lave los portaobjetos en agua del grifo para eliminar el precipitado y luego sumerja en PBS (pH 7.4, 0.01 M) durante 10 minutos para evitar que se formen más sudaneses negros.
23. Monte las correderas en los cubreobjetos de vidrio confocal utilizando tres gotas de 60 l de solución de montaje con DAPI. Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas aplicando alrededor del perímetro del cubreobjetos.
24. Permita que los portaobjetos se curen durante 24 horas en RT (para permitir que DAPI penetre) y luego almacene a 4 oC protegidos de la luz. Mantener en la oscuridad para evitar el desvanecimiento de las sondas fluorescentes.
25. Diapositivas de imagen utilizando un cabezal de escaneo láser confocal conectado a un microscopio. Emociona las diapositivas con el láser 405 para DAPI y el láser 488 para H3Cit, 561 para MPO y 647 para PAD4. Capture imágenes de un solo plano de 1024 x 1024 píxeles mediante la captura secuencial de línea y el promedio de 4 líneas, que es esencial para detectar ecDNA. Utilice un objetivo de aceite de 40x 1.0 NA. Imagen de un mínimo de 20 glomérulos por muestra. Guarde las imágenes como archivos ND2.

4. Trampas extracelulares de neutrófilos y análisis ecMPO

1. Instalar ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. Compruebe que la segmentación de Weka entrenable está disponible en Plugins . Segmentación ? Segmentación Weka entrenable.
3. Suelte la imagen en ImageJ. Haga clic en Imagen ( Image) Color ? Dividir canales. Aparecerá una imagen con DAPI en azul que mancha todos los núcleos, una imagen con H3Cit en verde, una imagen con MPO en rojo y una imagen con PAD4 en blanco.
   1. Cree un archivo combinado de las imágenes individuales para dibujar un ROI para el glomérulo haciendo clic en Color . Combinar canales. Un cuadro emergente le pedirá que asigne un color a cada canal. Después de asignar un color a cada canal, marque la casilla Crear compuesto y la casilla Mantener imágenes de origen y haga clic en Aceptar. Aparece una imagen combinada. A diferencia del protocolo para ecDNA anteriormente, usaremos la imagen compuesta para realizar el resto de los pasos.
4. Realice un desenfoque gaussiano en la imagen compuesta. Esto permite suavizar los núcleos. Haga clic en Proceso de proceso ( Process) Filtros ? Desenfoque gaussiano, poner en 1.00-2.00. La imagen ahora se verá un poco borrosa, pero los núcleos ahora son suaves y el fondo se suaviza.
   NOTA: Este paso está preformado para eliminar el ruido y limpiar la imagen de artefactos que pueden impedir la detección relevante de atributos de imagen que se analizarán.
5. Haga clic en Plugins (Plugins) Segmentación ? Segmentación Weka entrenable. Aparecerá una ventana completamente nueva con la imagen que se analizará y las herramientas de menú específicas de segmentación de Weka.
6. Usando la herramienta de línea en la barra de herramientas (en ImageJ), primero trace alrededor de núcleos intactos no positivo para los 4 componentes NET (MPO, PAD4, DAPI y H3Cit) usando la herramienta de mano libre y luego agregue al cuadro Agregar clase 1.
7. Mediante la herramienta de línea de la barra de herramientas ImageJ delinea las áreas de fondo al cuadro Clase 2.
8. Haga clic en la etiqueta del botón Crear nueva clase en el menú de etiquetas y en la etiqueta "NETs". Utilice la herramienta de línea para delinear NETS identificados como DAPI de co-localización (azul), MPO (rojo), PAD4 (blanco) e histonas citrulinadas (verde).
9. Haga clic en la etiqueta del botón Crear nueva clase en el menú de etiquetas y en la etiqueta "ecMPO". Utilice la herramienta de línea para delinear MPO (rojo) que está libre de celdas.
10. Haga clic en el botón Clasificador de trenes en el menú de entrenamiento en la ventana Segmentación de Weka entrenable.
    NOTA: El botón STOP aparecerá en lugar del botón Clasificador de trenes y permanecerá hasta que el entrenamiento haya terminado. No haga clic en este botón durante el entrenamiento y el proceso se interrumpirá.
11. Haga clic en el botón Crear resultado en el menú de entrenamiento y se crea una imagen con todos los componentes clasificados, que consisten en núcleos intactos, el fondo y lo que se identificó como ecMPO.
12. Haga clic en el botón Obtener probabilidad en el menú de entrenamiento. Alternar el ratón para dar una imagen en blanco y negro de todas las clases con el objeto de selección resaltado en blanco.
13. Duplicar tanto la probabilidad de NET como la imagen de probabilidad de ecMPO haciendo clic en Imagen . Duplicar.
14. Cambie a la pantalla con el botón del ratón que contiene NETs. Aplique un umbral para asegurarse de que solo se resalten los NT identificados. En la barra de herramientas del menú ImageJ, haga clic en Imagen ? Ajustar ? Umbral. Mueva las barras de alternancia deslizantes hasta que se resalten los componentes de NET. Haga clic en Aplicar cuando esté satisfecho con el umbral. Repita los mismos pasos para ecMPO.
15. Si después del umbral todavía hay áreas de detección de ecMPO o NETs, vuelva a la imagen entrenada original y agregue más clasificadores y vuelva a aplicar los pasos 4.1-4.14.
16. Haga clic en Imagen ( Image) Ajuste de la imagen ? Hacer binario. Copie el ROI glomerular realizado en el paso 4.3, haga clic en Ctrl+Mayús+E. Activar la ventana de Weka mediante Editar ? Selecciones de selección ? Restaurar, que restaura la selección. Haga clic en Analizar partículas para medir solo las partículas NET dentro del glomérulo.
17. Cambie a la pantalla con el botón del ratón que contiene ecMPO. Aplique un umbral para asegurarse de que solo se obtiene ecMPO identificado. Haga clic en Aplicar cuando esté satisfecho con el umbral. Repita el paso 4.16 anterior.
    NOTA: Una hoja de resultados se calcula con el recuento de partículas, el área, el promedio de píxeles y el porcentaje del glomeróbulo que contiene tanto NET como ecMPO. Estos resultados se pueden colocar en una hoja de cálculo y guardarse, para su posterior análisis estadístico.
18. Guarde el clasificador como NETs.classifier haciendo clic en Guardar clasificador en el menú de opciones y guarde el archivo en la aplicación ImageJ del escritorio (carpeta ImageJ). A continuación, haga clic en Guardar datos en el menú de opciones y guárdelos como archivo NETs.arff. El ROI glomerular tendrá que ser añadido manualmente cada vez como tamaño y forma del glomérulo cambiará, pero el programa ha aprendido lo que son tanto NET como ecMPO.
19. Para volver a aplicar el modelo a imágenes posteriores, repita los pasos 4.1-4.5 con una nueva imagen. Haga clic en Cargar clasificador en el menú de opciones. Haga clic en Nets.classifier en la carpeta ImageJ. El menú de registro aparecerá y ejecutará el modelo, una vez que el modelo se haya ejecutado, haga clic en Cargar datos en el menú de opciones y seleccione el archivo NETs.arff.
    1. Haga clic en Crear resultado. Si la imagen resultante no ha podido recoger todos los núcleos, el fondo o el ecDNA, haga clic en volver a entrenar clasificador y agregue más clasificadores y guarde el nuevo modelo. Complete el proceso de análisis repitiendo los pasos 4.11-4.19.
       NOTA: Se pueden utilizar varias imágenes para generar el modelo final utilizado para detectar ecDNA, ecMPO y NETs. Esto se logra aplicando el modelo a imágenes posteriores, agregando más clasificadores y guardando el nuevo modelo y datos en la carpeta ImageJ. Esto puede ser particularmente importante cuando diferentes muestras tienen un fondo más alto. El programa de segmentación Weka es compatible con el lenguaje de macros ImageJ, lo que permite que muchos de los comandos sean macro grabables para automatizar algunos de los pasos.

Resultados

Estas imágenes representan los múltiples pasos necesarios para utilizar con éxito la segmentación de Weka entrenable para minimizar la medición manual intensiva en mano de obra de ecDNA en tejido renal FFPE manchado fluorescentemente de un ratón con GN anti-MPO inducido. Estos pasos se resumen en la Figura 1 y la Figura 2 con imágenes tomadas directamente del programa de segmentación de Weka, delineando cada paso en el pr...

Discusión

Existen múltiples protocolos que miden los marcadores proinflamatorios en el suero y la orina tanto de los pacientes como de los modelos de ratón de glomerulonefritis. Este protocolo descrito permite el análisis de los productos de la muerte celular (ECDNA, NETs y ecMPO) directamente dentro del glomerulo. Los pasos más cruciales en este protocolo son la preparación de tejidos y la toma de imágenes. El principal elemento restrictivo del uso de un método de tinción fluorescente para el análisis es la autofluoresce...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A2153	5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera	SIGMA	C5405	Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM	SIGMA	E6758	Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100%	Chem Supply	UN1170	Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)	TRAJAN	NBF-500	Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	TRAJAN	J3800AM4	Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody	R&D	AF3667	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol	Clini Pure	CPL HISTOSOL 08	Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen	VECTOR Labs	H-400	Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)	ABCAM	ab128086	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope	Coherent Scientific		Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline	SIGMA	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless	Tefal	GSA-P2530738	Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody	ABCAM	ab8227	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody	ABCAM	ab5103	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides	ProScitech	H4465	Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B	SIGMA	199664	0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM	SIGMA	T4661	Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene	Trajan	XL005/20	Must be use used in a fume hood