JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במהלך מוות תאי הוא proinflammatory ותורם לדלקת. מדידת ecDNA באתר פציעה יכולה לקבוע את היעילות של הטיפול הטיפולי באיבר היעד. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכלי למידה של מחשב כדי להפוך את המדידה של ecDNA ברקמת הכליות.

Abstract

מוות של תאים פקוניים הוא תכונה פתולוגית של myeloperoxidase אנטי נויטרופילים cytoplasmic נוגדן הקשורים דלקת כלי דם (MPO-AAV). חומצת מסחטות (ecDNA) שוחררה במהלך צורות שונות של מוות תאים, כולל אפופטוזיס, נמק, נקרופסיס, מלכודות נויטרופילים ופירופסיס. מדידה של מוות זה תא הוא זמן רב עם מספר סמנים שונים הנדרשים כדי לזהות את הצורות הביוכימי השונים של מוות תאים. מדידה של ecDNA מתנהל בדרך כלל סרום ושתן כמו פונדקאית עבור נזק לכליות, לא באיבר היעד בפועל שבו הפציעה הפתולוגית מתרחשת. הקושי הנוכחי בחקירת ecdna בכליה הוא חוסר שיטות עבור הרקמה הקבועה של פורמלין מוטבע רקמת פרפין (ffpe) הן בניסויים והן בארכיון ביופסיה של כליות האדם. פרוטוקול זה מספק סיכום של השלבים הדרושים לכתם עבור ecDNA ברקמת FFPE (הן של האדם וגם murine), כיבוי באופן אוטומטי ולמדוד את ecDNA בתמונות וכתוצאה מכך באמצעות כלי למידה מכונה מתוך הזמין בפומבי הקוד הפתוח הפנויה ImageJ תוסף trainable Weka פילוח. פילוח Trainable Weka מוחל על ecDNA בתוך הפקאולי היכן התוכנית לומדת לסווג ecDNA. מסווג זה מוחל על תמונות כליות שנרכשו לאחר מכן, ומפחית את הצורך ביאורים ידניים של כל תמונה בודדת. הסתגלות של פילוח Weka trainable מוצג עוד יותר ברקמת הכליות מפני הניסוי הנסיוני האנטי-MPO של מורלין (GN), כדי לזהות רשתות וecMPO, תורמים פתולוגיים שכיחים לאנטי MPO GN. שיטה זו מספקת ניתוח אובייקטיבי של ecDNA ברקמת כליות המדגימה בבירור את היעילות שבה trainable Weka התוכנית פילוח יכול להבחין ecDNA בין רקמת כליה נורמלית בריאה ורקמות הכליה החולה. ניתן להתאים בקלות פרוטוקול זה לזיהוי ecDNA, רשתות וecMPO באיברים אחרים.

Introduction

הנוגדן Myeloperoxidase אנטי נויטרופילים cytoplasmic הקשורים דלקת כלי דם (MPO-aav) היא מחלה אוטואימונית כי תוצאות אי ספיקת כליות מפציעה פתולוגית משמעותית עם מוות תאים משמעותי ושחרור של חומצה deoxyribonucleic (DNA)1,2. הדנ א יכול להפעיל את המערכת. החיסונית בכך שהוא מתפקד כאות סכנה בתנאים בריאים נורמליים, המיקום הגרעיני של דנ א מציע הגנה מפני חשיפה למערכת החיסונית. Self-DNA כי הוא שוחרר extracellularly במהלך תהליכים פתוגניים או חסינות אוטומטית נתפסת על ידי המערכת החיסונית כמו נזק proinflammatory הקשורים מולקולרית חלבון מולקולרי (לח)3. נוסף DNA הסלולר (ecdna) הוא שוחרר מן התאים המתים באמצעות מנגנונים ברורים מספר כי הם נשלטים על ידי מסלולים ביוכימיים ברורים, כגון אפופטוזיס, נקרופזה נויטרופילים מסחטות היווצרות המלכודת (רשתות), נמק או פירופסיס4,5,6,7,8.

אנו מתארים בזאת שיטות לכתם ולמדוד ecdna שוחרר מתאי מתים במקטעים של פורמלין קבוע פרפין מוטבע (ffpe) הכליות של ניסיוני anti-MPO GN וביופסיות כליות מחולים עם MPO-aav9,10. שיטות מרובות קיימות לזיהוי של במחזור dna תקועים כפול (dsdna) ו-dna מכלולי משני הסרום והשתן ומחוץ לחדר המבחנה11,12. שיטות אלה, למרות מדויק בקביעת כמות ecDNA, לא קובעים היכן ecDNA שוחרר מבחינה אנטומית. ישנן שיטות המתארות מדידה ספציפית של ecdna כגון tunel עבור אפופטוזיס ומדידה של פסולת תא13,14. אין שיטה המתארת מדידת ecDNA הגיע לשיאו מכל צורות של מוות תאים בכליות FFPE שבו הנזק הפתולוגי מתרחשת. חשוב לקבוע אם הטיפולים הטיפוליים הניסיוניים מרוקנים את ה-Dna מאתרי הפציעה הפתולוגית באיבר היעד הממשי.

רכישת תמונות מרובות מדגימות כליות יוצרת נפח גדול של נתונים שנותחו בדרך כלל על-ידי משתמש יחיד. זוהי עבודה אינטנסיבית, זמן רב והוא יכול להיות כפוף השגות מהימן על ידי משתמשים אחרים, עקב הטיית המשתמש. פילוח של Trainable weka הוא תוסף תוכנה לקוד פתוח עבור imagej המשתמש בכלים ביולוגיים מתקדמים כדי לסווג פיקסלים באמצעות אלגוריתמים15שללימוד מחשב 15,16. שיטה זו היא "trainable" לפיה היא לומדת מסיווג המשתמש של מקטעי פיקסלים ומחילה את הסיווג החדש למדו על תמונות אחרות. שיטה זו מסתמכת על כלי ניתוח נפוצים בתוך התוכנית ImageJ המשמשים "לסווג" כל פיקסל במקטע כשייכות ל"מחלקה" ספציפית. לאחר התוכנית לומדת את "מסווגים", הם יכולים לשמש כדי לזהות קטעים מסווגים דומים אחרים בתוך אותה תמונה. מודל זה נשמר ומוחל על קבוצות אחרות של תמונות בתוך אותו ניסוי.

המכשולים הנוכחיים כדי לקבוע ecDNA בתוך מקטעי כליות הוא אוטודוגני אוטומטי מקיבעון בפורמאלין ואת ניתוח אינטנסיבית העבודה של התמונות. אנו מתארים כאן כיצד להרוות את זה autoפלואורסצנטית, לזהות ecDNA, ולהשתמש פיקוח מחשב למידה מדידה תפוקה גבוהה של ecDNA. פרסמנו בעבר את המדידה של רשתות ומMPO (ecMPO) באמצעות מאקרו ב-ImageJ, אנו מדגימים כעת למחצה אוטומציה של שיטות אלה באמצעות מחשב מפוקח למידה1. אנו מדגימים את ההסתגלות של כלי הלמידה של המכונה, כדי לסווג כתם חלופי לרשתות ו ecMPO בתוך אותה תמונה. אלה כתמים שיטות המתוארות כאן לגילוי ecdna, רשתות ו ecMPO ניתן לתרגם איברים מוצק אחרים ומחלות שבו ecdna, רשתות ו ecMPO משחק תפקיד להנציח את המחלה כגון דלקת מפרקים שגרונית ולופוס17,18.

Protocol

שיטה זו מאפשרת זיהוי של פאן ecDNA מכל צורות של מוות תאים. אותה שיטה ונוגדנים משמשים לרקמת ביופסיה של האדם (משלב 4). כל החיות והנושאים האנושיים היה אישור האתיקה מאוניברסיטת מונש, ומונש בריאות, קלייטון, ויקטוריה, אוסטרליה.

1. צביעת עבור ecDNA עם DAPI ו β-Actin

  1. לגרום 20 יום מודל של אנטי myeloperoxidase פקניתיים (anti-MPO-GN) ב 8-10 שבוע הישן C57/Bl6 עכברים, עם פקדים9.
    1. להרוג את העכברים האנושי באמצעות חדר CO2 .
    2. הסרת הכליות על ידי ביצוע החתך הקדמי באמצע העור עם מספריים, ולאחר מכן בזהירות לחתוך את צפק ואת הסיכה חזרה על לוח לנתיחה. באמצעות מלקחיים לדחוף בצד את fascia הכליה הקדמית צפק הקודקודית ולחתוך את הכליה ללא תשלום על ידי ניתוק השופכה ואת כלי הדם (עורק הכליה והווריד) באגן הכליה. להסיר עם מלקחיים לחתוך כליות לחצי (משונן מטוס) עם גודל 22 אזמל.
    3. מניחים כליה בתיקונים (4% באגירה) עבור 16 שעות בטמפרטורת החדר (RT). להסיר ולהשרות כליה קבועה 30% אתנול למשך 24 שעות לפני העיבוד.
  2. עבד כליות באמצעות מחזור סטנדרטי של 6 שעות:
    70% אתנול במשך 15 דקות
    90% אתנול במשך 15 דקות
    100% אתנול במשך 15 דקות
    100% אתנול למשך 20 דקות
    100% אתנול במשך 25 דקות
    100% אתנול למשך 30 דקות
    קסילן עבור 20 דקות
    קסילן עבור 30 דקות
    קסילן עבור 40 דקות
    שעווה למשך 30 דקות
    שעווה עבור 35 דקות
    שעווה עבור 40 דקות
    הערה: חשוב כמו כליות לא צריך להיות נתון לחשיפה ממושכת לחום בשעווה, כפי שהוא יכול להרוס אנטיגנים של עניין.
  3. גזור 3 יקרומטר סעיפים על מיקרוטומה והר על מיקרוסקופ מסחרית זמין זכוכית שקופיות מצופה בתשלום חיובי. אפשר לייבש את הלילה.
  4. שים שקופיות זכוכית לתוך מתלה שקופיות לתוך תנור 60 ° c עבור 60 דקות.
    הערה: שלבים 1.3 ו-1.4 חיוניים כדי להבטיח מקטעים לא לרחף במהלך השלב אחזור אנטיגן.
  5. לטבול שקופיות בשני שינויים של הממס (קסילן או תחליף) עבור 40 דקות כל אחד, בתוך מכסה.
  6. מייבשים שקופיות ב 100% אתנול, 100% אתנול, 70% אתנול עבור 5 דקות כל אחד. רוחצים עבור 5 דקות במים ברז.
  7. מניחים צלחת חמה בתוך מכסה המנוע ומרתיחים הפתרון לאחזור אנטיגן (10 מ"מ Tris, 1 מ"מ EDTA pH 9.0) בסיר לחץ. ברגע הפתרון לאחזור אנטיגן מתחיל לרתוח, למקם את השקופיות בסיר אופקית באמצעות זוג מלקחיים ולנעול את המכסה. מרתיחים גבוה (שווה ערך ל 15 psi או 103 kPa) במשך 10 דקות.
    הערה: שלב זה הוא קריטי כפי שהוא מאחזר את האנטיגן של העניין על ידי הסרת המסיכה של האנטיגן (מקושרת באמצעות קיבעון פורמלין) כדי לאפשר לנוגדנים מוגדר הנוגדן קשירה מסוים לא יעבוד בלעדיו.
  8. להסיר סיר לחץ מהחום ולהסיר מכסה מיד על ידי הפעלת ברז קר על גבי המכסה בכיור. השאר שקופיות כדי לעבור 20 דקות בפתרון אחזור אנטיגן.
  9. לשטוף שקופיות פעמיים עבור 5 דקות ב 0.01 מלוחים מ פוספט באגירה (ה-PBS) (pH 7.4) על שייקר מסלולית.
  10. השתמש בעט הידרופובי לצייר עיגולים סביב רקמת הכליה להיזהר לא לתת כל רקמה להתייבש הפעם.
  11. הרקמה בלוק 10% עוף סרה ב 5% בסרום שור (BSA)/PBS (pH 7.4, 0.01 M) עבור 30 דקות, 60 μL לכל מקטע. אין לשטוף לאחר שלב זה אבל בזהירות להסיר את הפתרון חוסם באמצעות 60 μL הצינורות, אל תתנו את הסעיפים להתייבש.
  12. החלת קוקטייל הנוגדן העיקרי עבור β-actin מדולל 1/1000 בתוך 1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M), 60 μL לכל מקטע ו-דגירה לילה בחדר לחות ב 4 ° c.
  13. לשטוף שקופיות פעמיים עבור 5 דקות ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) על שייקר מסלולית.
  14. החלת נוגדן משני, עוף נגד ארנב 488 (1/200), 60 μL לכל מקטע מדולל ב 1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) עבור 40 דקות ב RT.
  15. לשטוף את השקופיות פעמיים עבור 5 דקות ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) על שייקר מסלולית.
  16. לטבול את השקופיות 0.3% סודן שחור ב 70% אתנול עבור 30 דקות בצנצנת Coplin.
    הערה: שלב זה חשוב כפי שהיא מקובטת את הקרינה האוטומטית הנגרמת על ידי קיבעון פורמלין.
  17. לשטוף את השקופיות במי ברז כדי להסיר את הזרז ולאחר מכן לטבול ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) עבור 10 דקות כדי למנוע שחור נוסף סודן מזרז להרכיב.
  18. הר השקופיות על שמיכות זכוכית קונפוקלית וקד באמצעות 3 60 μl טיפות של פתרון הרכבה עם dapi ו לאטום את הכיסויים עם לק ציפורניים על ידי החלת סביב המערכת של coverslips.
  19. אפשר לשקופיות לרפא למשך 24 שעות ב-RT (כדי לאפשר ל-DAPI לחדור) ולאחר מכן לאחסן ב-4 ° c מוגן מפני אור.
    הערה: חשוב לשמור בחושך כדי למנוע עמעום של בדיקה פלואורסצנטית.
  20. שקופיות תמונה באמצעות ראש סריקת לייזר קונפוקלית וקד מחובר למיקרוסקופ. לרגש שקופיות עם לייזר 405 עבור DAPI ו 488 לייזר עבור בטא Actin. לכידת מטוס יחיד 1024 x1024 פיקסל תמונות באמצעות שורה סדרתית לכידת ו 4-line בממוצע, אשר חיוני לגילוי ecDNA. 40x 1.0 NA המטרה שמן משמש.
    1. תמונה מינימום של 20 פקולי לכל מדגם. שמור תמונות כקבצי ND2.

2. ניתוח DAPI וβ-Actin

  1. התקנת ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. בדוק כי פילוח Weka trainable זמין תחת תוספים | פילוח | Trainable Ka פילוח.
  3. שחרר את התמונה לתוך סרגל הכלים ImageJ. לחץ על תמונה | צבע | פצל ערוצים. תמונה אחת עם DAPI בצבע כחול מכתים את כל הגרעינים יופיעו ו 1 תמונה עם β-actin בירוק יופיע, אשר מתארת את הגלואראולי.
    1. צור קובץ ממוזג של התמונות היחידות כדי לצייר אזור מעניין (ROI) עבור הפקעית על ידי לחיצה על צבע | מזג ערוצים. תיבה מוקפצת תבקש להקצות צבע לכל ערוץ. לאחר הקצאת כל ערוץ לצבע, סמן את התיבה צור מורכב והתיבה שמור תמונות מקור ולחץ על אישור. תופיע תמונה מורכבת וממוזגת.
    2. שימוש β-actin מכתים כמדריך, לצייר ROI סביב המכונה הפקפה. השאר תמונה זו בצד כדי להשתמש ב-ROI בסוף פרוטוקול זה.
  4. ביצוע טשטוש גאוס בתמונת DAPI הכחולה הבודדת. לחץ על תהליך | מסננים | ' טשטוש לפי עקומת גאוס', הכניסו ב2.00. התמונה תיראה עכשיו קצת מטושטש, אבל הגרעינים הם עכשיו חלק הרקע התרכך.
    הערה: שלב זה מראש כדי להסיר את הרעש כדי לנקות את התמונה מחפצים שעלולים למנוע זיהוי רלוונטי של תכונות תמונה כדי להיות מנותח.
  5. לחץ על תוספים | פילוח | Trainable Ka פילוח.
  6. שימוש בכלי הקו בסרגל הכלים ב-ImageJ, מעקב ראשון סביב גרעינים שלמים באמצעות כלי היד בחינם (יש אפשרויות קו, מעגלי, ומרובע הזמינות לבחירה) ולאחר מכן להוסיף להוסיף מחלקה 1 box.
  7. השימוש בכלי השורה בסרגל הכלים ב-ImageJ מהתוות אזורים של רקע לתיבה Class 2 .
  8. לחץ על תווית הלחצן ' צור מחלקה חדשה ' בחלון הפילוח של weka ובתווית "ecdna". השתמש בכלי הקו (מסרגל הכלים ImageJ) כדי להתוות extranuclear DNA מוכתם על ידי DAPI.
  9. לחץ על לחצן מסווג הרכבת בתפריט הדרכה בחלון Trainable weka פילוח.
    הערה: לחצן העצירה יופיע במקום לחצן מסווג הרכבת ותישאר עד לסיום ההכשרה. אין ללחוץ על כפתור זה במהלך האימון כמו התהליך יפריעו.
  10. לחץ על ליצור לחצן התוצאה כדי ליצור תמונה עם כל הרכיבים המסווגים, המורכב של גרעיני שלם, את הרקע זיהה ecdna.
  11. לחץ על לחצן ' קבל הסתברות '. החלף את העכבר כדי להעניק תמונה שחורה ולבנה של כל המחלקות עם אובייקט הבחירה המסומן בלבן.
  12. שכפל תמונה זו על-ידי לחיצה על התמונה | . בסדר, שכפל
  13. החלף את המסך באמצעות לחצן העכבר המכיל את ה-ecDNA. החל סף כדי לקבל רק את מה שזוהה כ-ecDNA. לחץ על החל כאשר הסף מספיק.
  14. אם לאחר סף, ישנם תחומים נוספים של DNA כי הם לא ecDNA, לחזור לתמונה הכשרה המקורי, להוסיף מסווג יותר, ולחזור על שלבים 2.1-2.13.
  15. לחץ על תמונה | התאמת תמונה | הפוך לבינארי. העתק את התשואה הפקפיות שבוצעו בשלב 2.3 ולחץ על Ctrl + Shift + E. הפעל את חלון Weka על-ידי עריכה | בחירות | שחזור, אשר משחזר את הבחירה. לחץ על לנתח חלקיקים, אשר למדוד רק את חלקיקי ecdna בתוך הפקעית.
    הערה: גליון תוצאות מחושב עם ספירת החלקיקים, האזור, ממוצע הפיקסלים ואחוז הפקעית המכילה ecDNA. ניתן לייצא תוצאות אלה לגיליון אלקטרוני ולשמור אותן, לניתוח סטטיסטי מאוחר יותר.
  16. שמור את המסווג כ-ecDNA. מסווג על-ידי לחיצה על שמור מסווג מתפריט האפשרויות לתוך היישום imagej בשולחן העבודה. לאחר מכן לחץ על שמירת נתונים מתפריט האפשרויות ושמור כ-ecdna. arff בתיקיה imagej. ההחזר יצטרך להתווסף באופן ידני בכל פעם כמו בגודל וצורה של גלואראולוס ישתנה, אולם התוכנית למדה מה ecDNA היא.
  17. כדי להחיל מחדש את המודל על תמונות עוקבות, חזור על שלבים 2.1-2.5 עם תמונה חדשה. לחץ על טען מסווג מתפריט האפשרויות ולאחר מכן Ecdnamodel. מסווג בתיקיה imagej משלב 2.16. תפריט יומן הרישום יופיע ויפעל באמצעות הדגם.
  18. לאחר הפעלת המודל, לחץ על טעינת נתונים בתפריט אפשרויות ובחר בקובץ ecdna. arff שנשמר בתיקיה imagej משלב 2.16. לחץ על יצירת תוצאה. אם התמונה המתקבלת נכשלה לאסוף את כל גרעיני, רקע או ecDNA לחץ על מסווג הרכבת מחדש ולהוסיף מסווג יותר ולשמור את המודל החדש. השלם את תהליך הניתוח על-ידי שלבים חוזרים 2.9-2.16.
    הערה: ניתן להשתמש במספר תמונות כדי להפיק את המודל הסופי המשמש לזיהוי ecDNA. הדבר מושג על-ידי החלת המודל על התמונות העוקבות, הוספת מידע מסווג יותר ושמירת הדגם החדש והנתונים בתיקיה ImageJ. זה יכול להיות חשוב במיוחד כאשר דגימות שונות יש רקע גבוה יותר. התוכנית ' פילוח של Weka ' תואמת גם לשפת המאקרו ImageJ המאפשרת לרבים מהפקודות להיות מאקרו לצריבה כדי להפוך חלק מהשלבים.

3. מדידה של מלכודות נויטרופילים מסחטות ו ecMPO

הערה: שיטה זו מזהה רשתות על-ידי לוקליזציה של דנ א של מסחטות, peptidyl של היארגל 4 (PAD4) ו-MPO.

  1. לגרום 20 יום מודל של אנטי myeloperoxidase פקניתיים (anti-MPO-GN) ב 8-10 שבוע הישן C57/Bl6 עכברים, עם פקדים9.
    1. להרוג את העכברים האנושי באמצעות חדר CO2 .
    2. הסרת הכליות על ידי ביצוע החתך הקדמי באמצע העור עם מספריים, ולאחר מכן בזהירות לחתוך את צפק ואת הסיכה חזרה על לוח לנתיחה. באמצעות מלקחיים לדחוף בצד את fascia הכליה הקדמית צפק הקודקודית ולחתוך את הכליה ללא תשלום על ידי ניתוק השופכה ואת כלי הדם (עורק הכליה והווריד) באגן הכליה. להסיר עם מלקחיים לחתוך כליות לחצי (משונן מטוס) עם גודל 22 אזמל.
    3. מניחים כליה בתיקונים (4% באגירה) עבור 16 שעות בטמפרטורת החדר (RT). להסיר ולהשרות כליה קבועה 30% אתנול למשך 24 שעות לפני העיבוד.
  2. עבד כליות באמצעות מחזור סטנדרטי של 6 שעות:
    70% אתנול במשך 15 דקות
    90% אתנול במשך 15 דקות
    100% אתנול במשך 15 דקות
    100% אתנול למשך 20 דקות
    100% אתנול במשך 25 דקות
    100% אתנול למשך 30 דקות
    קסילן עבור 20 דקות
    קסילן עבור 30 דקות
    קסילן עבור 40 דקות
    שעווה למשך 30 דקות
    שעווה עבור 35 דקות
    שעווה עבור 40 דקות
    הערה: הכליות לא צריכות להיות חשופים לחשיפה ממושכת לחום בשעווה, כפי שהיא יכולה להרוס אנטיגנים של עניין.
  3. גזור 3 יקרומטר סעיפים על מיקרוטומה והר על מיקרוסקופ מסחרית זמין זכוכית שקופיות מצופה בתשלום חיובי. לאפשר ייבוש לילה
  4. שים שקופיות זכוכית לתוך מתלה שקופיות לתוך תנור 60 ° c עבור 60 דקות.
    הערה: שלבים 3.3-3.4 חיוניים כדי להבטיח מקטעים לא צף במהלך השלב אחזור אנטיגן.
  5. לטבול שקופיות בשני שינויים של הממס (קסילן או תחליף) עבור 40 דקות כל אחד, בתוך מכסה.
  6. מייבשים שקופיות ב 100% אתנול, 100% אתנול, 70% אתנול עבור 5 דקות כל אחד.
  7. רוחצים עבור 5 דקות במים ברז.
  8. מניחים צלחת חמה בתוך מכסה המנוע ומרתיחים הפתרון לאחזור אנטיגן (10 מ"מ Tris-1 מ"מ EDTA pH 9.0) בסיר לחץ. ברגע הפתרון לאחזור אנטיגן מתחיל להרתיח את המקום את השקופיות בסיר אופקית באמצעות זוג מלקחיים ולנעול את המכסה. מרתיחים גבוה (שווה ערך ל 15 psi או 103 kPa) במשך 10 דקות.
    הערה: שלב זה מאחזר את האנטיגן של הריבית על ידי הסרת המסיכה של האנטיגן (מקושרת באמצעות קיבעון פורמלין) כדי לאפשר לנוגדן כריכה מסוימת הכריכה הבאה לא תפעל ללא שלב זה.
  9. להסיר את סיר הלחץ מהחום ולהסיר את המכסה מיד על ידי הפעלת ברז קר על גבי המכסה בכיור. השאר שקופיות כדי לעבור 20 דקות בפתרון אחזור אנטיגן.
  10. לשטוף שקופיות פעמיים עבור 5 דקות ב מלוחים באגירה פוספט (ה-PBS) (pH 7.4, 0.01 M) על שייקר מסלולית.
  11. השתמש בעט הידרופובי לצייר עיגולים סביב רקמת הכליה להיזהר לא לתת כל רקמה להתייבש הפעם.
  12. הרקמה בלוק 10% עוף סרה ב 5% בסרום שור (BSA)/PBS (pH 7.4, 0.01 M) עבור 30 דקות, 60 μL לכל מקטע. אין לשטוף לאחר צעד זה אך בזהירות להסיר את הפתרון חסימת באמצעות הצינורות 60 μL. אל תתנו לסעיפים להתייבש.
  13. הפוך קוקטייל של הנוגדנים העיקריים מדולל 1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) בצינור 1. החל 60 μL לכל מקטעי כליה. הריכוז של הנוגדנים העיקריים הוא כדלקמן:
    ארנב נגד אדם/עכבר H3Cit 1/100
    עכבר נגד אדם/עכבר PAD4 1/50
    עז נגד אדם/עכבר MPO 1/200
  14. המלון משלב בין לילה ב -4 ° c בחדר לחות.
  15. לשטוף שקופיות פעמיים עבור 5 דקות ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) על שייקר מסלולית.
  16. הפוך קוקטייל של הנוגדנים המשניים בשפופרת אחת. נוגדנים משניים מוחלים ב 1% BSA/PBS, 60 μL לכל מקטע באופן הבא:
    עוף נגד ארנב 488 1/200.
    עוף נגד העכבר 647 1/200.
    עוף נגד עז 594 1/200.
  17. דגירה ב RT עבור 40 דקות.
  18. לשטוף שקופיות פעמיים עבור 5 דקות ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) על שייקר מסלולית.
  19. החלת נוגדן משני 1:200 ב 1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) עבור 40 דקות ב-RT 60 μL לכל מקטע.
  20. לשטוף שקופיות פעמיים עבור 5 דקות ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) על שייקר מסלולית.
  21. לטבול שקופיות ב 0.3% סודן שחור ב 70% אתנול עבור 30 דקות.
  22. לשטוף את השקופיות במי ברז כדי להסיר את הזרז ולאחר מכן לטבול ב-PBS (pH 7.4, 0.01 M) עבור 10 דקות כדי למנוע עוד סודן שחור מזרז מיצירת.
  23. הר השקופיות על שמיכות זכוכית קונפוקלית וקד באמצעות 3 60 μl טיפות של פתרון הרכבה עם dapi. לאטום את הכיסויים עם לק ציפורניים על ידי החלת סביב המערכת של שמיכות.
  24. אפשר לשקופיות לרפא למשך 24 שעות ב-RT (כדי לאפשר ל-DAPI לחדור) ולאחר מכן לאחסן ב-4 ° c מוגן מפני אור. לשמור בחושך כדי למנוע עמעום של בדיקה פלורסנט.
  25. שקופיות תמונה באמצעות ראש סריקת לייזר קונפוקלית וקד מחובר למיקרוסקופ. לרגש שקופיות עם לייזר 405 עבור DAPI ו 488 לייזר עבור H3Cit, 561 עבור MPO, ו 647 עבור PAD4. לכידת מטוס יחיד 1024x1024 תמונות פיקסל באמצעות שורה סדרתית לכידת ו 4-line בממוצע אשר חיוני לגילוי ecDNA. השתמש במטרה הנפט 40x 1.0 NA. תמונה מינימום של 20 פקולי לכל מדגם. שמור תמונות כקבצי ND2.

4. מלכודות מסחטות וניתוח ecMPO

  1. התקנת ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. בדוק כי פילוח Weka trainable זמין תחת תוספים | פילוח | Trainable Ka פילוח.
  3. שחרר את התמונה לתוך ImageJ. לחץ על תמונה | צבע | פצל ערוצים. תמונה אחת עם DAPI בצבע כחול מכתים את כל הגרעינים יופיעו, תמונה אחת עם H3Cit בירוק, תמונה אחת עם MPO באדום, ותמונה אחת עם PAD4 בלבן יופיע.
    1. צור קובץ ממוזג של תמונות בודדות כדי לצייר ROI עבור הפקעית על ידי לחיצה על צבע | מזג ערוצים. תיבה מוקפצת תבקש להקצות צבע לכל ערוץ. לאחר הקצאת כל ערוץ לצבע, סמן את התיבה צור מורכב והתיבה שמור תמונות מקור ולחץ על אישור. מופיעה תמונה ממוזגת. שלא כמו פרוטוקול ecDNA בעבר נשתמש בתמונה ללא הפרדות צבע כדי לבצע את שאר השלבים.
  4. ביצוע טשטוש גאוס בתמונה המורכבת. זה מאפשר החלקה של הגרעינים. לחץ על תהליך | מסננים | טשטוש גאוסיאני, שים ב-1.00-2.00. התמונה נראית עכשיו קצת מטושטשת אבל הגרעינים הם עכשיו חלק הרקע התרכך.
    הערה: שלב זה מראש כדי להסיר את הרעש כדי לנקות את התמונה מחפצים שעלולים למנוע זיהוי רלוונטי של תכונות תמונה כדי להיות מנותח.
  5. לחץ על תוספים | פילוח | Trainable Ka פילוח. חלון חדש לגמרי יופיע עם התמונה כדי להיות מנותח ו Weka פילוח כלי תפריט ספציפיים.
  6. באמצעות כלי הקו בסרגל הכלים (ב-ImageJ), המעקב הראשון סביב הגרעין השלם אינו חיובי עבור כל 4 רכיבי NET (MPO, PAD4, DAPI ו H3Cit) באמצעות הכלי יד חופשית ולאחר מכן להוסיף לתיבה הוסף מחלקה 1 .
  7. שימוש בכלי הקו בסרגל הכלים ImageJ מהתוות אזורי רקע לתיבה Class 2 .
  8. לחץ על תווית הלחצן צור מחלקה חדשה בתפריט התווית והתווית "רשתות". השתמש בכלי הקו כדי להתוות רשתות המזוהות באמצעות לוקליזציה משותפת DAPI (כחול), MPO (אדום), PAD4 (לבן) ומסגרות השחזה (ירוק).
  9. לחץ על תווית הלחצן ' צור מחלקה חדשה ' בתפריט התוויות ובתווית "ecMPO". השתמש בכלי קו כדי להתוות MPO (אדום) כי הוא תא פנוי.
  10. לחץ על לחצן מסווג הרכבת בתפריט הדרכה בחלון Trainable Weka פילוח.
    הערה: לחצן העצירה יופיע במקום לחצן מסווג הרכבת ותישאר עד לסיום ההכשרה. אין ללחוץ על לחצן זה במהלך האימון והתהליך נקטע.
  11. לחץ על לחצן צור תוצאה בתפריט הדרכה ותמונה נוצרת עם כל הרכיבים המסווגים, המורכב של גרעינים שלמים, את הרקע ומה זוהה כמו ecMPO.
  12. לחץ על לחצן ' קבל הסתברות ' בתפריט הדרכה. החלף את העכבר כדי להעניק תמונה שחורה ולבנה של כל המחלקות עם אובייקט הבחירה המסומן בלבן.
  13. שכפל גם את ההסתברות NET ואת תמונת ההסתברות ecMPO על-ידי לחיצה על התמונה | . בסדר, שכפל
  14. עבור למסך באמצעות לחצן העכבר המכיל רשתות. החל סף כדי להבטיח הדגשה של רשתות מזוהות בלבד. בסרגל הכלים של תפריט ImageJ, לחץ על תמונה | כוונן | . אנימבין. הזז את הסרגלים המסומנים למצב הזזה עד שרכיבי NET יסומנו. לחץ על החל כאשר הסף מרוצה. חזור על אותם שלבים עבור ecMPO.
  15. אם לאחר סף יש עדיין זיהוי אזורים של ecMPO או רשתות, לחזור לתמונה הכשרה המקורי ולהוסיף מיותר מסווג ולהחיל מחדש את השלבים 4.1-4.14.
  16. לחץ על תמונה | התאמת תמונה | הפוך לבינארי. העתק את התשואה הפקפיות שבוצעו בשלב 4.3, לחץ על Ctrl + Shift + E. הפעל חלון Weka על ידי עריכת | בחירות | שחזור, אשר משחזר את הבחירה. לחץ על ניתוח חלקיקים כדי למדוד רק את חלקיקי NET בתוך הגלועית.
  17. עבור למסך באמצעות לחצן העכבר המכיל את ecMPO. החל סף כדי להבטיח שרק מזוהים ecMPO מתקבלים. לחץ על החל כאשר הסף מרוצה. חזור על שלב 4.16 לעיל.
    הערה: גליון תוצאות מחושב עם ספירת החלקיקים, האזור, ממוצע הפיקסלים ואחוז הפקעית המכילים הן רשתות והן ecMPO. לאחר מכן ניתן להכניס תוצאות אלה לגיליון אלקטרוני ולשמור אותן, לניתוח סטטיסטי מאוחר יותר.
  18. שמור את המסווג כרשתות. מסווג על-ידי לחיצה על שמור מסווג מתפריט האפשרויות ושמור את הקובץ ביישום imagej בשולחן העבודה (התיקיה imagej). לאחר מכן לחץ על שמירת נתונים מתפריט האפשרויות ושמירה כקובץ רשתות. arff. התשואה הפקעית יהיה להוסיף באופן ידני בכל פעם כמו בגודל וצורה של גלואראולוס ישתנה, אבל התוכנית למדה מה הן רשתות והן ecMPO.
  19. כדי להחיל מחדש את המודל על תמונות עוקבות, חזור על שלבים 4.1-4.5 עם תמונה חדשה. לחץ על טען מסווג מתפריט האפשרויות. לחץ על רשתות. מסווג בתיקיה imagej. תפריט יומן הרישום יופיע ויפעל במודל, לאחר שהמודל יפעל לחיצה על טעינת נתונים בתפריט אפשרויות ובחר בקובץ net. arff.
    1. לחץ על יצירת תוצאה. אם התמונה המתקבלת נכשלה לאסוף את כל גרעיני, רקע או ecDNA לחץ על מסווג הרכבת מחדש ולהוסיף מסווג יותר ולשמור את המודל החדש. השלם את תהליך הניתוח על-ידי שלבים חוזרים 4.11-4.19.
      הערה: ניתן להשתמש במספר תמונות כדי להפיק את המודל הסופי המשמש לזיהוי ecDNA, ecMPO ורשתות. הדבר מושג על-ידי החלת המודל על התמונות העוקבות, הוספת מידע מסווג יותר ושמירת הדגם החדש והנתונים בתיקיה ImageJ. זה יכול להיות חשוב במיוחד כאשר דגימות שונות יש רקע גבוה יותר. התוכנית ' פילוח Weka ' תואמת לשפת המאקרו ImageJ המאפשרת לרבות מהפקודות להיות מאקרו לצריבה כדי להפוך חלק מהשלבים.

תוצאות

תמונות אלה מייצגות את השלבים המרובים הדרושים כדי להשתמש בהצלחה פילוח Weka trainable כדי למזער את המדידה הידנית של העבודה אינטנסיבית של ecDNA ברקמת כליות FFPE ויטראז ' מתוך עכבר עם המושרה anti-MPO GN. שלבים אלה מסוכמים באיור 1 ובאיור 2 עם תמונות שצולמו ישיר?...

Discussion

פרוטוקולים מרובים קיימים כי למדוד סמנים proinflammatory בסרום ושתן של שני חולים ומודלים של העכבר של glomerulonephritis. הפרוטוקול המתואר מאפשר ניתוח של המוצרים של מוות תאים (ecDNA, רשתות ו-ecMPO) בתוך הפקולוס ישירות. הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הם הכנת רקמות והדמיה. האלמנט העיקרי הגבלת שימוש בשיטת פלורס...

Disclosures

. אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מכירים את מונש מיקרו הדמיה לשימוש של ניקון C1 זקוף לייזר מיקרוסקופ מערכת סריקה בלייזר ואת פלטפורמת מונש היסטולוגיה לעיבוד של רקמת כליה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine Serum AlbuminSIGMAA21535% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken seraSIGMAC5405Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mmAzerscientificES0107222#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mMSIGMAE6758Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100%Chem SupplyUN1170Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)TRAJANNBF-500Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mmTRAJANJ3800AM4Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibodyR&DAF3667Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic penVECTOR LabsH-400Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)ABCAMab128086Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted MicroscopeCoherent ScientificAliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered SalineSIGMAP381350.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainlessTefalGSA-P2530738Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibodyABCAMab8227Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibodyABCAMab5103Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slidesProScitechH4465Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black BSIGMA1996640.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mMSIGMAT4661Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
XyleneTrajanXL005/20Must be use used in a fume hood

References

  1. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  2. Jennette, J. C., Falk, R. J., Hu, P., Xiao, H. Pathogenesis of antineutrophil cytoplasmic autoantibody-associated small-vessel vasculitis. Annual Review of Pathology. 8, 139-160 (2013).
  3. Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. Programmed cell death as a defence against infection. Nat Rev Immunol. 17 (3), 151-164 (2017).
  4. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  5. Wyllie, A. H., Kerr, J. F., Currie, A. R. Cell death: the significance of apoptosis. International Review of Cytology. 68, 251-306 (1980).
  6. Fiers, W., Beyaert, R., Declercq, W., Vandenabeele, P. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage. Oncogene. 18 (54), 7719-7730 (1999).
  7. Pasparakis, M., Vandenabeele, P. Necroptosis and its role in inflammation. Nature. 517 (7534), 311-320 (2015).
  8. Fink, S. L., Cookson, B. T. Caspase-1-dependent pore formation during pyroptosis leads to osmotic lysis of infected host macrophages. Cellular Microbiology. 8 (11), 1812-1825 (2006).
  9. Ooi, J. D., Gan, P. Y., Odobasic, D., Holdsworth, S. R., Kitching, A. R. T cell mediated autoimmune glomerular disease in mice. Current Protocols in Immunology. 107, 15.27.11-15.27.19 (2014).
  10. Ruth, A. J., et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies and effector CD4+ cells play nonredundant roles in anti-myeloperoxidase crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (7), 1940-1949 (2006).
  11. Nagler, M., Insam, H., Pietramellara, G., Ascher-Jenull, J. Extracellular DNA in natural environments: features, relevance and applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (15), 6343-6356 (2018).
  12. Burnham, P., et al. Urinary cell-free DNA is a versatile analyte for monitoring infections of the urinary tract. Nature Communications. 9 (1), 2412 (2018).
  13. Gobe, G. Identification of apoptosis in kidney tissue sections. Methods in Molecular Biology. 466, 175-192 (2009).
  14. Olander, M., Handin, N., Artursson, P. Image-Based Quantification of Cell Debris as a Measure of Apoptosis. Analytical Chemistry. 91 (9), 5548-5552 (2019).
  15. Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: a machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases. Nature Reviews Rheumatology. 14 (8), 467-475 (2018).
  18. Chapman, E. A., et al. Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Frontiers in Immunology. 10, 423 (2019).
  19. Oliveira, V. C., et al. Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections. Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).
  20. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).
  21. Schreiber, A., et al. Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).
  22. Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis. Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved