Glomerülonefritte Hücre Dışı DNA'nın Yarı Nicelikselleştirilmesi için Denetimli Makine Öğrenimi

Özet

Hücre ölümü sırasında salınan ekstrasellüler DNA (ekDNA) proinflamatuar ve inflamasyona katkıda bulunur. Yaralanma yerinde ekDNA ölçümü hedef organda terapötik tedavinin etkinliğini belirleyebilir. Bu protokol böbrek dokusunda ekDNA ölçümü otomatikleştirmek için bir makine öğrenme aracı nın kullanımını açıklar.

Özet

Glomerüler hücre ölümü miyeloperoksidaz anti nötrofil sitoplazmik antikor ilişkili vaskülitin patolojik bir özelliğidir (MPO-AAV). Ekstrasellüler deoksiribonükleik asit (ekDNA) apoptoz, nekroz, nekroz, nötrofil ekstrasellüler tuzaklar (Nets) ve piroptoz gibi hücre ölümü farklı formları sırasında serbest bırakılır. Bu hücre ölümünün ölçümü, hücre ölümünün farklı biyokimyasal formlarını belirlemek için gerekli olan birkaç farklı biyobelirteçle zaman alıcıdır. EkDNA ölçümü genellikle serum ve idrarda böbrek hasarı için taşıyıcı anne olarak yapılır, patolojik yaralanmanın meydana geldiği gerçek hedef organda değil. Böbrekte ekDNA'nın araştırılmasındaki mevcut zorluk, hem deneysel hem de arşivlenmiş insan böbrek biyopsilerinde formalin sabit parafin gömülü doku (FFPE) yöntemlerinin olmamasıdır. Bu protokol FFPE dokusunda ekDNA için leke için gerekli adımların bir özetini sağlar (hem insan hem de murine), otofloresan sökmek ve kamuya açık kaynak ImageJ plugin eğitilebilir Weka segmentasyonu bir makine öğrenme aracı kullanarak ortaya çıkan görüntülerde ekDNA ölçmek. Eğitilebilir Weka segmentasyonu, programın ekDNA sınıflandırmayı öğrendiği glomerüli içinde ekDNA'ya uygulanır. Bu sınıflandırıcı sonraki elde edilen böbrek görüntüleri uygulanır, her bir görüntümanuel ek açıklamalar için ihtiyacı azaltarak. Eğitilebilir Weka segmentasyonunun uyarlanabilirliği, deneysel murine anti-MPO glomerülonefrit (GN) böbrek dokusunda, anti-MPO GN'ye ortak patolojik katkıda bulunan NET'leri ve ecMPO'yu tanımlamak için daha fazla gösterilmiştir. Bu yöntem, eğitilebilir Weka segmentasyon programının sağlıklı normal böbrek dokusu ile hastalıklı böbrek dokusu arasında ekDNA'yı ayırt edebilmesinin etkinliğini açıkça gösteren böbrek dokusundaki ekDNA'nın objektif analizini sağlar. Bu protokol diğer organlardaki ecDNA, NET ve ECMPO'ları tanımlamak için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Myeloperoksidaz anti nötrofil sitoplazmik antikor ilişkili vaskülit (MPO-AAV) önemli hücre ölümü ve deoksiribonükleik asit salınımı ile patolojik glomerüler yaralanma böbrek yetmezliği ile sonuçlanan bir otoimmün hastalıktır (DNA)^1,2. DNA bir tehlike sinyali gibi davranarak bağışıklık sistemini aktive edebilir. Normal sağlıklı koşullar altında, DNA'nın nükleer konumu bağışıklık sistemine maruz kalma koruma sağlar. Patojenik süreçler veya otoimmünite sırasında hücre dışı olarak salınan kendi KENDINE DNA bağışıklık sistemi tarafından moleküler öz protein (DAMP) ile ilişkili güçlü bir proinflamatuar hasar olarak görülür³. Ekstra hücresel DNA (ekDNA) apoptoz, nektoz nötrofil ekstrasellüler tuzak oluşumu (NET), nekroz veya piroptoz^4,,5,6,7,8gibi farklı biyokimyasal yollar tarafından yönetilen çeşitli farklı mekanizmalar aracılığıyla ölmekte olan hücrelerden serbest bırakılır.

Burada, deneysel anti-MPO GN ve MPO-AAV^9,hastalarından alınan böbrek biyopsilerinden formalin sabit parafin (FFPE) böbrekbölümlerinde ölmekte olan hücrelerden salınan ekDNA'yı boyama ve ölçme yöntemlerini tanımlıyoruz,¹⁰. Birden fazla yöntem çift iplikçikli DNA (dsDNA) ve DNA kompleksleri hem serum ve idrar ve in vitro tahliller^11,,12dolaşan tespiti için var . Bu yöntemler, ekDNA miktarını belirlemede doğru olmakla birlikte, ekDNA'nın anatomik olarak nerede salınacağını belirlemez. Apoptoz için tunel ve hücre enkazı ölçümü^13,14gibi ecDNA özel ölçüm açıklayan yöntemler vardır. Patolojik hasarın meydana geldiği FFPE böbreklerinde hücre ölümünün her türlüsden kaynaklanan ekDNA ölçümü ile sonuçlanan bir yöntem yoktur. Bu deneysel terapötik tedaviler gerçek hedef organpatolojik yaralanma sitelerinden ekDNA temizleyerek olup olmadığını belirlemek için önemlidir.

Böbrek örneklerinden birden fazla görüntü elde edilmesi, tek bir kullanıcı tarafından yaygın olarak analiz edilen yüksek hacimli veri oluşturur. Bu emek yoğun, zaman alıcı ve diğer kullanıcılar tarafından güvenilmez tekrarlanabilirlik tabi olabilir, kullanıcı önyargı nedeniyle. Trainable Weka segmentasyon machine learning algoritmaları^15,16kullanarak piksel sınıflandırmak için kesme kenarı biyoinformatik araçları kullanan ImageJ için bir açık kaynak yazılım eklentisi . Bu yöntem, kullanıcının piksel segmentlerini sınıflandırmasından ders aldığı ve yeni öğrenilen sınıflandırmayı diğer görüntülere uyguladığı "eğitilebilir"dir. Bu yöntem, ImageJ programında, bir segmentteki her pikseli belirli bir "sınıfa" ait olarak "sınıflandırmak" için kullanılan ortak çözümleme araçlarına dayanır. Program "sınıflandırıcıları" öğrendikten sonra, aynı görüntü deki diğer benzer sınıflandırılmış bölümleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu model daha sonra kaydedilir ve aynı denemedeki diğer görüntü kümelerine uygulanır.

Böbrek kesitlerinde yerinde ekDNA'nın belirlenmesinin önündeki mevcut engeller formalinde fiksasyondan kaynaklanan endojen otofloresans ve görüntülerin emek yoğun analizidir. Burada bu otofloresansı nasıl bastırabileceğimizi, ekDNA'yı nasıl tespit edebileceğimizi ve ekDNA'nın yüksek iş elde ölçümü için denetimli makine öğrenimini nasıl kullanacağımızı burada açıklıyoruz. Biz daha önce ImageJ bir makro kullanarak NETs ve ekstrasellüler MPO (ecMPO) ölçümü yayınladık, şimdi denetlenen makine öğrenme¹kullanarak bu yöntemlerin yarı otomasyon göstermek. Biz aynı görüntü içinde NETs ve ecMPO için alternatif bir leke sınıflandırmak için, makine öğrenme aracının adaptasyon yeteneğini göstermektedir. EcDNA, NET'lerin ve ecMPO'nun saptanması için burada açıklanan bu boyama yöntemleri, ekDNA, NETS ve ecMPO'nun romatoid artrit ve lupus gibi hastalıkların devamında rol oynadığı diğer katı organlara ve hastalıklara^{,18çevrilebilir.}

Protokol

Bu yöntem, hücre ölümünün her türlü pan ekDNA'sının saptanmasını sağlar. Aynı yöntem ve antikorlar insan böbrek biyopsi stoyonu için de kullanılmaktadır (4. basamaktan). Tüm hayvan ve insan denekler Monash Üniversitesi'nden etik onayı aldı ve Monash Health, Clayton, Victoria, Avustralya.

1. DAPI ve β-Aktin ile ekDNA boyama

1. 8-10 haftalık C57/Bl6 farelerde anti-miyeloperoksidaz glomerülonefrit (anti-MPO-GN) 20 günlük bir model indükleyin^{kontrolleri 9}.
   1. Co₂ odasını kullanarak fareleri insancıl bir şekilde ötenazi.
   2. Makas ile deri yoluyla bir ön orta hat kesi yaparak böbrekleri çıkarın, ve sonra dikkatle periton kesilmiş ve bir diseksiyon tahtası üzerinde geri pin. Forceps kullanarak anterior renal fasya ve parietal periton kenara itmek ve üreter ve kan damarları (renal arter ve ven) böbrek pelvis keserek böbrek serbest kesti. Bir boyutu 22 neşter ile ikiye (sagittal düzlem) ve cut böbrekler ile çıkarın.
   3. Böbrekleri oda sıcaklığında (RT) 16 saat boyunca fiksatif (%4 tamponlu formalin) yerleştirin. İşlemden önce 24 saat boyunca sabit böbreği %30 etanolle çıkarın ve ıslatın.
2. Standart 6 saatlik bir döngü kullanarak böbrekleri işleme:
   15 dakika için %70 etanol
   15 dakika boyunca %90 etanol
   15 dakika boyunca %100 etanol
   20 dk için %100 etanol
   25 dk için %100 etanol
   30 dakika boyunca %100 etanol
   20 dk için Xylene
   30 dk için Xylene
   40 dk için Xylene
   30 dk için balmumu
   35 dk için balmumu
   Balmumu 40 dk için
   NOT: Bu böbrekler balmumu ısıya uzun süre maruz kalmamalıdır olarak önemlidir, bu ilgi antijenleri yok edebilir gibi.
3. Bir mikrotome 3 μm kesitler kesin ve pozitif bir yük ile kaplanmış ticari cam mikroskop slaytlar üzerine monte. Bir gecede kurumasını bekleyin.
4. 60 dakika boyunca 60 °C fırıniçine bir slayt raf içine cam slaytlar koyun.
   NOT: 1.3 ve 1.4 adımları, antijen alma adımı sırasında bölümlerin süzülmemesini sağlamak için çok önemlidir.
5. Bir duman kaputunda, her biri 40 dakika boyunca iki çözücü (ksilen veya ikame) değimi kaydırAbatırın.
6. Rehidrat slaytlar 100% etanol, 100% etanol, 5 dakika her için% 70 etanol. Musluk suyunda 5 dk yıkayın.
7. Bir düdüklü tencerede bir duman kaputve önceden kaynatın antijen alma çözeltisi (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) bir sıcak plaka yerleştirin. Antijen alma çözeltisi kaynamaya başlar başlamaz, slaytları bir çift maşa kullanarak yatay olarak tencereye yerleştirin ve kapağı kilitleyin. 10 dakika boyunca yüksek (15 psi veya 103 kPa eşdeğeri) kaynatın.
   NOT: Bu adım, epitop antikor spesifik bağlama sonraki boyama izin vermek için antijen epitop (formalin fiksasyonu ile bağlantılı çapraz) maskesini unmaskeleyerek ilgi antijeni alır gibi önemlidir sonraki boyama onsuz çalışmaz.
8. Düdüklü tencereyi ısıdan çıkarın ve lavabodaki kapağın üstüne soğuk musluk basarak kapağı hemen çıkarın. Antijen alma çözeltisinde 20 dakika boyunca dengelemek için slaytlar bırakın.
9. 0,01 M fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.4) bir orbital shaker üzerinde 5 dakika için iki kez slaytlar yıkayın.
10. Bu süre içinde herhangi bir doku kurumasını sağlamak için dikkatli olmak böbrek dokusu etrafında daireler çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın.
11. %5 büyükbaş hayvan serum albumininde (BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) 30 dk, kesit başına 60 μL'lik %10 tavuk serasında blok doku. Bu adımdan sonra yıkamayın, 60 μL'lik pipet kullanarak blokaj çözeltisini dikkatlice çıkarın, bölümlerin kurumasına izin vermeyin.
12. %1 BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M), 60 μL/kesit ve 4 °C'deki nem haznesinde gece boyunca kuluçkaya yatan β-aktin seyreltilmiş 1/1000 için birincil antikor kokteyli uygulayın.
13. Orbital shaker üzerinde PBS (pH 7.4, 0.01 M) 5 dakika boyunca iki kez slaytları yıkayın.
14. Rt'de 40 dk için %1 BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) seyreltilmiş kesit başına 60 μL ikincil antikor, tavuk anti tavşan 488 (1/200), 60 μL uygulayın.
15. Bir orbital shaker üzerinde PBS (pH 7.4, 0.01 M) 5 dakika için iki kez slaytlar yıkayın.
16. Bir Coplin kavanozda 30 dakika için% 70 etanol% 0.3 Sudan Siyah slaytlar batırın.
    NOT: Formalin fiksasyonunun neden olduğu otofloresansı söndürderken bu adım önemlidir.
17. Çökelti kaldırmak için musluk suyunda slaytlar yıkayın ve daha sonra 10 dakika boyunca PBS (pH 7.4, 0.01 M) daha fazla Sudan Siyah çökelti oluşmasını önlemek için batırın.
18. DAPI ile üç 60 μL montaj çözeltisi damlası kullanarak konfokal cam kapaklara kaydırıkları monte edin ve coverslip çevresine uygulayarak kapakları oje ile kapatın.
19. Slaytların RT'de 24 saat boyunca tedavi etmesine izin verin (DAPI'nin nüfuz etmesine izin vermek için) ve ardından ışıktan korunan 4 °C'de saklayın.
    NOT: Floresan probların solmasını önlemek için karanlıkta tutulması önemlidir.
20. Mikroskoba bağlı bir konfokal lazer tarama kafası kullanarak görüntü slaytlar. DAPI için 405 lazer ve Beta Actin için 488 Lazer ile slaytlar heyecanlandırın. Tek düzlemde 1024 x1024 piksel görüntüleri, ekDNA'yı algılamak için gerekli olan satır sıralı yakalama ve 4 satırlık ortalama kullanarak yakalayın. 40x 1.0 NA yağı hedefi kullanılır.
    1. Örnek başına en az 20 glomeruli görüntüleyin. Görüntüleri ND2 dosyaları olarak kaydedin.

2. DAPI ve β-Aktin analizi

1. ImageJ yükleyin: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. Uygulanabilir Weka segmentasyonunun Eklentiler altında mevcut olup olmadığını kontrol edin | Segmentasyon | Eğitilebilir Weka Segmentasyonu.
3. Görüntüyü ImageJ araç çubuğuna bırakın. Resim | Renk | Split Kanalları. Mavi boyama dapi ile bir görüntü tüm çekirdekleri görünür ve 1 görüntü yeşil β-actin ile görünür, hangi glomeruli ifade eder.
   1. Renk'e tıklayarak glomerulus için ilgi alanı (YG) çizmek için tek görüntülerin birleştirilmiş bir dosyasını oluşturun | Kanalları Birleştir. Açılır kutu, her kanala bir renk atamak ister. Her kanala bir renk atadıktan sonra, Bileşik Oluştur kutusunu ve Kaynak Resimleri Tut kutusunu işaretleyin ve Tamam'ıtıklatın. Birleştirilmiş bileşik görüntü görüntülenir.
   2. Β-actin boyamayı kılavuz olarak kullanarak glomerüler tuft'un etrafına bir yatırım getirisi çizin. Bu protokolün sonunda ki YG'yi kullanmak için bu görüntüyü bir kenara koyun.
4. Tek mavi DAPI görüntüsünde Gaussian bulanıklığı gerçekleştirin. İşlem 'i tıklatın | Filtreler | Gaussian Blur, 1-2.00 koymak. Görüntü şimdi biraz bulanık görünecektir, ancak çekirdekler artık pürüzsüz ve arka plan yumuşatılmış.
   NOT: Bu adım, görüntünün analiz edilecek görüntü özniteliklerinin ilgili algılanmasını engelleyebilecek yapılardan temizlemek için gürültüyü gidermek için önceden oluşturulmuştur.
5. Eklentiler üzerine tıklayın | Segmentasyon | Eğitilebilir Weka Segmentasyonu.
6. ImageJ'deki araç çubuğundaki çizgi aracını kullanarak, önce serbest el araçlarını kullanarak bozulmamış çekirdeklerin etrafından iz leyin (seçebileceğiniz satır, dairesel ve kare takım seçenekleri vardır) ve ardından Sınıf 1 ekle kutusuna ekleyin.
7. ImageJ'deki araç çubuğundaki çizgi aracını kullanarak arka plan alanlarını Sınıf 2 kutusuna göre sıralayın.
8. Weka segmentasyon penceresinde Yeni Sınıf Oluştur düğmesine tıklayın ve "ecDNA" etiketini etiketleyin. DAPI tarafından boyanmış ekstra nükleer DNA'yı belirlemek için çizgi aracını (ImageJ araç çubuğundan) kullanın.
9. Eğitilebilir Weka segmentasyon penceresindeki eğitim menüsündeki Tren Sınıflandırıcı düğmesine tıklayın.
   NOT: Stop düğmesi Tren Sınıflandırıcı düğmesinin yerine görünür ve eğitim bitene kadar kalır. İşlem kesilecektir gibi eğitim sırasında bu düğmeye tıklamayın.
10. Sağlam çekirdekler, arka plan ve tanımlanan ecDNA'dan oluşan tüm sınıflandırılmış bileşenlere sahip bir görüntü oluşturmak için Sonuç Oluştur düğmesini tıklatın.
11. Olasılık Al düğmesini tıklatın. Beyaz olarak vurgulanan seçim nesnesi ile tüm sınıfların siyah beyaz bir görüntü vermek için fareyi geçiş.
12. Resim'e tıklayarak bu resmi çoğaltma | Yinelenen.
13. EcDNA içeren fare düğmesini kullanarak ekrana titretin. Yalnızca ecDNA olarak tanımlanan şeyi almak için bir eşik uygulayın. Eşik yeterli olduğunda Uygula'yı tıklatın.
14. Eşik ten sonra, EKDNA olmayan daha fazla DNA alanı varsa, orijinal eğitilmiş görüntüye dönün, daha fazla sınıflandırıcı ekleyin ve 2.1-2.13 adımlarını yineleyin.
15. Resim | Görüntü Ayarlama | İkili olun. Adım 2.3'te yapılan glomerüler Yatırım Getirisi'ni kopyalayın ve Ctrl+Shift+E'yitıklatın. Edit ile Weka penceresini etkinleştir | Seçimler | Seçimi geri yükleyin. Glomerulus içindeki sadece ekDNA parçacıklarını ölçecek olan Parçacıkları AnalizEt'i tıklatın.
    NOT: Sonuç sayfası parçacıkların sayısı, alan, ortalama pikseller ve ekDNA içeren glomerulusun yüzdesi ile hesaplanır. Bu sonuçlar bir elektronik tabloya aktarılabilir ve daha sonraki istatistiksel analiziçin kaydedilebilir.
16. Seçenekler menüsünden Masaüstündeki ImageJ uygulamasına Sınıflandırıcıyı Kaydet'i tıklatarak sınıflandırıcıyı ecDNA.classifier olarak kaydedin. Ardından seçenekler menüsünden Verileri Kaydet'i tıklatın ve ImageJ klasörüne ecDNA.arff olarak kaydedin. Glomerulus boyutu ve şekli değişeceği için yatırım getirisi her seferinde elle eklenmek zorunda kalacaktır, ancak program ekDNA'nın ne olduğunu öğrenmiştir.
17. Modeli sonraki görüntülere yeniden uygulamak için 2.1-2.5 adımlarını yeni bir görüntüyle yineleyin. 2.16 adımdan ImageJ klasöründeki seçenek menüsünden Load Classifier'i ve ardından ecDNAmodel.classifier'i tıklatın. Günlük menüsü açılır ve modeli çalıştırın.
18. Model çalıştırDıktan sonra seçenekler menüsündeki Verileri Yükle'ye tıklayın ve ImageJ klasöründe kaydedilen ecDNA.arff dosyasını 2.16 adımdan seçin. Sonuç Oluştur'atıklayın. Ortaya çıkan görüntü tüm çekirdekleri almak için başarısız olduysa, arka plan veya ecDNA yeniden sınıflandırıcı tıklayın ve daha fazla sınıflandırıcı ekleyin ve yeni modeli kaydedin. 2.9-2.16 adımlarını yineleyerek analiz işlemini tamamlayın.
    NOT: EcDNA'yı algılamak için kullanılan son modeli oluşturmak için çeşitli görüntüler kullanılabilir. Bu, modeli sonraki resimlere uygulayarak, daha fazla sınıflandırıcı ekleyerek ve yeni modeli ve verileri ImageJ klasörüne kaydederek elde edilir. Farklı örnekler daha yüksek arka plana sahip olduğunda bu özellikle önemli olabilir. Weka Segmentasyon programı, komutların çoğunun bazı adımları otomatikleştirmek için makro kaydedilebilir olmasını sağlayan ImageJ makro diliyle de uyumludur.

3. Nötrofil ekstrasellüler tuzakların ve ecMPO ölçümü

NOT: Bu yöntem, ekstrasellüler DNA, Citrullinated Histones peptidil arginaz 4 (PAD4) ve MPO'nun kolokalizasyonu ile NET'leri tanımlar.

1. 8-10 haftalık C57/Bl6 farelerde anti-miyeloperoksidaz glomerülonefrit (anti-MPO-GN) 20 günlük bir model indükleyin^{kontrolleri 9}.
   1. Co₂ odasını kullanarak fareleri insancıl bir şekilde ötenazi.
   2. Makas ile deri yoluyla bir ön orta hat kesi yaparak böbrekleri çıkarın, ve sonra dikkatle periton kesilmiş ve bir diseksiyon tahtası üzerinde geri pin. Forceps kullanarak anterior renal fasya ve parietal periton kenara itmek ve üreter ve kan damarları (renal arter ve ven) böbrek pelvis keserek böbrek serbest kesti. Bir boyutu 22 neşter ile ikiye (sagittal düzlem) ve cut böbrekler ile çıkarın.
   3. Böbrekleri oda sıcaklığında (RT) 16 saat boyunca fiksatif (%4 tamponlu formalin) yerleştirin. İşlemden önce 24 saat boyunca sabit böbreği %30 etanolle çıkarın ve ıslatın.
2. Standart 6 saatlik bir döngü kullanarak böbrekleri işleme:
   15 dakika için %70 etanol
   15 dakika boyunca %90 etanol
   15 dakika boyunca %100 etanol
   20 dk için %100 etanol
   25 dk için %100 etanol
   30 dakika boyunca %100 etanol
   20 dk için Xylene
   30 dk için Xylene
   40 dk için Xylene
   30 dk için balmumu
   35 dk için balmumu
   Balmumu 40 dk için
   NOT: Böbrekler, ilgi antijenleri yok edebileceğinden, balmumundaki ısıya uzun süre maruz kalmamalıdır.
3. Bir mikrotome 3 μm kesitler kesin ve pozitif bir yük ile kaplanmış ticari cam mikroskop slaytlar üzerine monte. Bir gecede kurumasını bekleyin
4. 60 dakika boyunca 60 °C fırıniçine bir slayt raf içine cam slaytlar koyun.
   NOT: 3.3-3.4 adımları, antijen alma adımı sırasında bölümlerin süzülmemesini sağlamak için çok önemlidir.
5. Bir duman kaputunda, her biri 40 dakika boyunca iki çözücü (ksilen veya ikame) değimi kaydırAbatırın.
6. Rehidrat slaytlar 100% etanol, 100% etanol, 5 dakika her için% 70 etanol.
7. Musluk suyunda 5 dk yıkayın.
8. Bir düdüklü tencerede bir duman kaputve önceden kaynatın antijen alma çözeltisi (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) bir sıcak plaka yerleştirin. Antijen alma çözeltisi kaynamaya başlar başlamaz slaytları bir çift maşa kullanarak yatay olarak tencereye yerleştirin ve kapağı kilitleyin. 10 dakika boyunca yüksek (15 psi veya 103 kPa eşdeğeri) kaynatın.
   NOT: Bu adım, epitop antikor spesifik bağlama sonraki boyama bu adım olmadan çalışmaz izin vermek için antijen epitop (formalin fiksasyonu ile bağlantılı çapraz) maskesini unmaskeleyerek ilgi antijeni alır.
9. Düdüklü tencereyi ısıdan çıkarın ve lavabodaki kapağın üstüne soğuk musluk basarak kapağı hemen çıkarın. Antijen alma çözeltisinde 20 dakika boyunca dengelemek için slaytlar bırakın.
10. Bir orbital shaker üzerinde fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.4, 0.01 M) 5 dakika boyunca iki kez slaytlar yıkayın.
11. Bu süre içinde herhangi bir doku kurumasını sağlamak için dikkatli olmak böbrek dokusu etrafında daireler çizmek için bir hidrofobik kalem kullanın.
12. %5 büyükbaş hayvan serum albumininde (BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) 30 dk, kesit başına 60 μL'lik %10 tavuk serasında blok doku. Bu adımdan sonra yıkanmayın, ancak 60 μL'lik pipet kullanarak engelleme çözeltisini dikkatlice çıkarın. Bölümlerin kurumasına izin vermeyin.
13. 1 tüpte %1 BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) ile seyreltilmiş primer antikorlardan oluşan bir kokteyl yapın. Böbrek kesitleri başına 60 μL uygulayın. Primer antikorların konsantrasyonu aşağıdaki gibidir:
    Tavşan anti insan / fare H3Cit 1/100
    Fare anti insan/ fare PAD4 1/50
    Keçi anti insan / fare MPO 1/200
14. Bir nem odasında 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
15. Orbital shaker üzerinde PBS (pH 7.4, 0.01 M) 5 dakika boyunca iki kez slaytları yıkayın.
16. 1 tüp ikincil antikorların bir kokteyl olun. Sekonder antikorlar %1 BSA/PBS, kesit başına 60 μL olarak uygulanır:
    Tavuk anti tavşan 488 1/200.
    Tavuk anti fare 647 1/200.
    Tavuk anti keçi 594 1/200.
17. 40 dakika RT'de kuluçka.
18. Orbital shaker üzerinde PBS (pH 7.4, 0.01 M) 5 dakika boyunca iki kez slaytları yıkayın.
19. Bölüm başına 40 dk için %1 BSA/PBS 'de (pH 7.4, 0.01 M) ikincil antikor 1:200 uygulayın.
20. Orbital shaker üzerinde PBS (pH 7.4, 0.01 M) 5 dakika boyunca iki kez slaytları yıkayın.
21. 30 dakika boyunca% 70 etanol% 0.3 Sudan Siyah slaytlar batırın.
22. Çökelti kaldırmak için musluk suyunda slaytlar yıkayın ve daha sonra pBS (pH 7.4, 0.01 M) 10 dakika boyunca daha fazla Sudan Siyah çökelti oluşmasını önlemek için batırın.
23. DAPI ile üç 60 μL montaj çözeltisi damlası kullanarak confocal cam kapakların üzerine kaydırıklar monte edin. Coverslip çevresine uygulayarak kapak ları oje ile kapatın.
24. Slaytların RT'de 24 saat boyunca tedavi etmesine izin verin (DAPI'nin nüfuz etmesine izin vermek için) ve ardından ışıktan korunan 4 °C'de saklayın. Floresan probların solmasını önlemek için karanlıkta tutun.
25. Mikroskoba bağlı bir konfokal lazer tarama kafası kullanarak görüntü slaytlar. DAPI için 405 lazer ve H3Cit için 488 Lazer, MPO için 561 ve PAD4 için 647 ile slaytları heyecanlandırın. EkDNA'yı algılamak için gerekli olan satır sıralı yakalama ve 4 satırlık ortalama kullanarak tek düzlem1024x1024 piksel görüntüleri yakalayın. 40x 1.0 NA yağ hedefi kullanın. Örnek başına en az 20 glomeruli görüntüleyin. Görüntüleri ND2 dosyaları olarak kaydedin.

4. Nötrofil ekstrasellüler tuzakları ve ecMPO Analizi

1. ImageJ yükleyin: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. Uygulanabilir Weka segmentasyonunun Eklentiler altında mevcut olup olmadığını kontrol edin | Segmentasyon | Eğitilebilir Weka Segmentasyonu.
3. Görüntüyü ImageJ'e bırakın. Resim | Renk | Split Kanalları. Mavi boyama dapi ile bir görüntü tüm çekirdekleri, yeşil H3Cit ile bir görüntü, kırmızı MPO ile bir görüntü ve beyaz PAD4 ile bir görüntü görünür.
   1. Renk'e tıklayarak glomerulus için yG çizmek için tek görüntülerin birleştirilmiş dosyasını oluşturma | Kanalları Birleştir. Açılır kutu, her kanala bir renk atamak ister. Her kanala bir renk atadıktan sonra, Bileşik Oluştur kutusunu ve Kaynak Resimleri Tut kutusunu işaretleyin ve Tamam'ıtıklatın. Birleştirilmiş bir görüntü görüntülenir. EcDNA protokolünün aksine daha önce diğer adımları gerçekleştirmek için kompozit görüntüyü kullanacağız.
4. Bileşik görüntüüzerinde Gaussian bulanıklığı gerçekleştirin. Bu çekirdekleri dışarı yumuşatma sağlar. İşlem 'i tıklatın | Filtreler | Gaussian Blur, 1.00-2.00 koymak. Görüntü şimdi biraz bulanık görünecektir ama çekirdekleri şimdi pürüzsüz ve arka plan yumuşatılmış.
   NOT: Bu adım, görüntünün analiz edilecek görüntü özniteliklerinin ilgili algılanmasını engelleyebilecek yapılardan temizlemek için gürültüyü gidermek için önceden oluşturulmuştur.
5. Eklentiler üzerine tıklayın | Segmentasyon | Eğitilebilir Weka Segmentasyonu. Tamamen yeni bir pencere görüntü analiz edilecek ve Weka segmentasyon özel menü araçları ile görünür.
6. Araç çubuğundaki (ImageJ'de) çizgi aracını kullanarak, önce serbest el aracını kullanarak 4 NET bileşeninin tümü (MPO, PAD4, DAPI ve H3Cit) için pozitif olmayan bozulmamış çekirdeklerin etrafında iz leyin ve ardından Sınıf 1 Ekle kutusuna ekleyin.
7. ImageJ araç çubuğundaki çizgi aracını kullanarak arka plan alanlarını Sınıf 2 kutusuna göre kalibre edin.
8. Etiket menüsünde Yeni Sınıf Oluştur düğmesine tıklayın ve "NETs" etiketini etiketleyin. Ortak yerelleştirme DAPI (mavi), MPO (kırmızı), PAD4 (beyaz) ve citrullinated histones (yeşil) olarak tanımlanan NETS tanımlarını çizgi aracını kullanın.
9. Etiket menüsünde Yeni Sınıf Oluştur düğmesine tıklayın ve "ecMPO" etiketini etiketleyin. Hücre içermeyen MPO'yu (kırmızı) olarak ifade etmek için satır aracını kullanın.
10. Trainable Weka Segmentation penceresindeki eğitim menüsündeki Tren Sınıflandırıcı düğmesine tıklayın.
    NOT: Stop düğmesi Tren Sınıflandırıcı düğmesinin yerine görünür ve eğitim bitene kadar kalır. Eğitim sırasında bu düğmeye tıklamayın ve işlem yarıda kesilir.
11. Eğitim menüsünde Sonuç Oluştur düğmesine tıkladığınızda, bozulmamış çekirdekler, arka plan ve ecMPO olarak tanımlanan bileşenlerden oluşan tüm sınıflandırılmış bileşenlerle birlikte bir resim oluşturulur.
12. Eğitim menüsündeki Olasılık Al düğmesine tıklayın. Beyaz olarak vurgulanan seçim nesnesi ile tüm sınıfların siyah beyaz bir görüntü vermek için fareyi geçiş.
13. Resim'e tıklayarak hem NET olasılık hem de ecMPO olasılık görüntüsünü çoğaltma | Yinelenen.
14. NET'ler içeren fare düğmesini kullanarak ekrana geçiş. Yalnızca tanımlanan NT'lerin vurgulanmasından emin olmak için bir eşik uygulayın. ImageJ menü araç çubuğunda Resim | Ayarla | Eşik. NET bileşenleri vurgulanana kadar kayan geçiş çubuklarını taşıyın. Eşikten memnun kaldığında Uygula'yı tıklatın. ECMPO için aynı adımları tekrarlayın.
15. Eşik sonra hala ecMPO veya NETs algıalanları varsa, orijinal eğitimli görüntüye geri dön ve daha fazla sınıflandırıcılar ekleyin ve adımları 4.1-4.14 yeniden uygulayın.
16. Resim | Görüntü Ayarlama | İkili olun. 4.3 adımda yapılan glomerüler Yatırım Getirisi'ni kopyalayın, Ctrl+Shift+E'yitıklatın. Edit tarafından Weka pencereyi etkinleştir | Seçimler | Seçimi geri yükleyin. Glomerulus içindeki net parçacıkları ölçmek için Parçacıkları Analiz Et'i tıklatın.
17. ECMPO içeren fare düğmesini kullanarak ekrana geçiş yapmak. Yalnızca tanımlanmış ECMPO'nun elde edilmesini sağlamak için bir eşik uygulayın. Eşikten memnun kaldığında Uygula'yı tıklatın. Yukarıdaki adım 4.16'yı tekrarlayın.
    NOT: Sonuç sayfası parçacıkların Sayısı, alanı, ortalama pikselleri ve hem NET'ler hem de ecMPO içeren glomerulusun yüzdesi ile hesaplanır. Bu sonuçlar daha sonra istatistiksel analiz için bir elektronik tabloya konulabilir ve kaydedilebilir.
18. Seçenekler menüsünden Sınıflandırıcıyı Kaydet'i tıklatarak sınıflandırıcıyı NETs.classifier olarak kaydedin ve dosyayı masaüstündeki ImageJ uygulamasına kaydedin (ImageJ klasörü). Ardından seçenekler menüsünden Verileri Kaydet'i tıklatın ve NETs.arff dosyası olarak kaydedin. Glomerrüler Yatırım Getirisi, glomerulus boyutu ve şekli değişeceği için her seferinde elle eklenmesi gerekecektir, ancak program hem NET'lerin hem de ECMPO'nun ne olduğunu öğrenmiştir.
19. Modeli sonraki görüntülere yeniden uygulamak için 4.1-4.5 adımlarını yeni bir görüntüyle yineleyin. Seçenek menüsünden Load Classifier'i tıklatın. ImageJ klasöründeki Nets.classifier'e tıklayın. Log menüsü açılır ve modeli çalıştırın, model çalıştırıldığında seçenekler menüsünde Yük Verileri'ne tıklayın ve NETs.arff dosyasını seçin.
    1. Sonuç Oluştur'atıklayın. Ortaya çıkan görüntü tüm çekirdekleri almak için başarısız olduysa, arka plan veya ecDNA yeniden sınıflandırıcı tıklayın ve daha fazla sınıflandırıcı ekleyin ve yeni modeli kaydedin. 4.11-4.19 adımlarını yineleyerek analiz işlemini tamamlayın.
       NOT: EcDNA, ecMPO ve NET'leri algılamak için kullanılan son modeli oluşturmak için çeşitli görüntüler kullanılabilir. Bu, modeli sonraki resimlere uygulayarak, daha fazla sınıflandırıcı ekleyerek ve yeni modeli ve verileri ImageJ klasörüne kaydederek elde edilir. Farklı örnekler daha yüksek arka plana sahip olduğunda bu özellikle önemli olabilir. Weka Segmentasyon programı, bazı adımları otomatikleştirmek için komutların çoğunun makro kaydedilebilir olmasını sağlayan ImageJ makro diliyle uyumludur.

Sonuçlar

Bu görüntüler, floresan lekeli FFPE böbrek dokusunda ekDNA'nın emek yoğun manuel ölçümlerini en aza indirmek için eğitilebilir Weka segmentasyonunu başarıyla kullanmak için gereken birden fazla adımı temsil eder. Bu adımlar, analiz sürecindeki her adımı özetleyen, doğrudan Weka segmentasyon programından alınan görüntülerle Şekil 1 ve Şekil 2'de özetlenmiştir. Bu analizden elde edilen ölçümler, pr...

Tartışmalar

Glomerülonefritin hem hastaların serum hem de idrarında proinflamatuar belirteçleri ölçen çoklu protokoller mevcuttur. Bu açıklanan protokol, glomerulus içindeki hücre ölümü ürünlerinin (ecDNA, NETs ve ECMPO) doğrudan analizini sağlar. Bu protokoldeki en önemli adımlar doku hazırlama ve görüntülemedir. Analiz için floresan boyama yöntemi kullanarak önemli kısıtlayıcı unsur doku otofloresanolduğunu. Formalin sabit parafin dokusu belirli floresan boyama gizleyebilir otofloresan tabidir. Slay...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A2153	5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera	SIGMA	C5405	Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM	SIGMA	E6758	Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100%	Chem Supply	UN1170	Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)	TRAJAN	NBF-500	Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	TRAJAN	J3800AM4	Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody	R&D	AF3667	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol	Clini Pure	CPL HISTOSOL 08	Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen	VECTOR Labs	H-400	Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)	ABCAM	ab128086	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope	Coherent Scientific		Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline	SIGMA	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless	Tefal	GSA-P2530738	Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody	ABCAM	ab8227	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody	ABCAM	ab5103	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides	ProScitech	H4465	Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B	SIGMA	199664	0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM	SIGMA	T4661	Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene	Trajan	XL005/20	Must be use used in a fume hood