Apprendimento automatico supervisionato per la semi-quantificazione del DNA extracellulare in Glomerulonephritis

Riepilogo

Il DNA extracellulare (ecDNA) rilasciato durante la morte cellulare è infiammatorio e contribuisce all'infiammazione. La misurazione dell'ecDNA nel sito della lesione può determinare l'efficacia del trattamento terapeutico nell'organo bersaglio. Questo protocollo descrive l'uso di uno strumento di apprendimento automatico per automatizzare la misurazione dell'ecDNA nel tessuto renale.

Abstract

La morte delle cellule glomeriari è una caratteristica patologica della mieloperossia anti-neutrofia anticorpo associato all'anticorpo (MPO-AAV). L'acido deossiribonucleico extracellulare (ecDNA) viene rilasciato durante diverse forme di morte cellulare, tra cui apoptosi, necrosi, necrotosi, trappole extracellulari neutrofiche (NET) e piroptosi. La misurazione di questa morte cellulare richiede molto tempo con diversi biomarcatori necessari per identificare le diverse forme biochimiche di morte cellulare. La misurazione dell'ecDNA è generalmente condotta nel siero e nelle urine come surrogato per danni renali, non nell'organo bersaglio effettivo in cui si verifica la lesione patologica. L'attuale difficoltà nello studio dell'ecDNA nel rene è la mancanza di metodi per formalina tessuto incorporato di paraffina fissa (FFPE) sia sperimentalmente che in biopsie renali umane archiviate. Questo protocollo fornisce un riepilogo dei passaggi necessari per macchiare l'ecDNA nel tessuto FFPE (sia umano che murino), dissetare l'autofluorescenza e misurare l'ecDNA nelle immagini risultanti utilizzando uno strumento di apprendimento automatico dal plugin Weka addestrabile a livello di immagine pubblicamente disponibile. La segmentazione Weka addestrabile viene applicata all'ecDNA all'interno del glomeruli dove il programma impara a classificare l'ecDNA. Questo classificatore viene applicato alle successive immagini renali acquisite, riducendo la necessità di annotazioni manuali di ogni singola immagine. L'adattabilità della segmentazione trainabile di Weka è ulteriormente dimostrata nel tessuto renale da glomerulofoftite sperimentale (GN), per identificare NET ed ecMPO, contributori patologici comuni all'anti-MPO GN. Questo metodo fornisce un'analisi oggettiva dell'ecDNA nel tessuto renale che dimostra chiaramente l'efficacia in cui il programma di segmentazione Weka trainingable può distinguere l'ecDNA tra tessuto renale normale sano e tessuto renale malato. Questo protocollo può essere facilmente adattato per identificare ecDNA, NET ed ecMPO in altri organi.

Introduzione

La mieloperossia anti-neutrofila anticorpo associato all'anticorpo (MPO-AAV) è una malattia autoimmune che si traduce in insufficienza renale da lesioni glomeriula patologiche con notevole morte cellulare e rilascio di acido deossiribonucleico (DNA)^1,2. Il DNA può attivare il sistema immunitario agendo come un segnale di pericolo. In condizioni di salute normali, la posizione nucleare del DNA offre protezione dall'esposizione al sistema immunitario. L'autoDNA che viene rilasciato extracellulare durante i processi patogeni o l'autoimmunità è visto dal sistema immunitario come un potente danno proinfiammatorio associato all'autoproteina molecolare (DAMP)³. Il DNA extra cellulare (ecDNA) viene rilasciato dalle cellule morenti attraverso diversi meccanismi distinti che sono governati da vie biochimiche distinte, come l'apoptosi, la formazione di trapeextra extracellulari di necroptosi neutrosi(NET), necrosi o piroptosi^4,5,6,7.8

In questo articolo vengono descritti i metodi per macchiare e misurare l'ecDNA rilasciato dalle cellule morenti in sezioni di reni formalina fixed paraffina incorporata (FFPE) da biopsie sperimentali anti-MPO GN e renali di pazienti con MPO-AAV^9,10. Esistono diversi metodi per la rilevazione di DNA a doppio filamento circolante (dsDNA) e complessi di DNA sia da siero che da urina e da analisi in vitro^11,12. Questi metodi, sebbene accurati nel determinare la quantità di ecDNA, non determinano dove l'ecDNA viene rilasciato anatomicamente. Ci sono metodi che descrivono la misurazione specifica dell'ecDNA come il tunel per l'apoptosi e la misurazione dei detriti cellulari^13,14. Non esiste un metodo che descriva la misurazione dell'ecDNA culminato da tutte le forme di morte cellulare nei reni FFPE dove si verifica il danno patologico. Questo è importante per determinare se i trattamenti terapeutici sperimentali stanno cancellando l'ecDNA dai siti di lesione patologica nell'organo bersaglio effettivo.

L'acquisizione di più immagini da campioni di rene crea un volume elevato di dati che viene analizzato comunemente da un singolo utente. Questo è laborioso, richiede tempo e può essere soggetto a riproducibilità inaffidabile da parte di altri utenti, a causa di pregiudizi dell'utente. Trainable Weka segmentation è un plugin software open source per ImageJ che utilizza strumenti bioinformatici all'avanguardia per classificare i pixel utilizzando algoritmi di apprendimento automatico^15,16. Questo metodo è "trainabile" per cui apprende dalla classificazione dell'utente dei segmenti di pixel e applica la nuova classificazione appresa ad altre immagini. Questo metodo si basa su strumenti di analisi comuni all'interno del programma ImageJ che vengono utilizzati per "classificare" ogni pixel in un segmento come appartenente a una "classe" specifica. Una volta che il programma apprende i "classificatori", possono essere utilizzati per identificare altri segmenti classificati simili all'interno della stessa immagine. Questo modello viene quindi salvato e applicato ad altri set di immagini all'interno dello stesso esperimento.

Gli ostacoli attuali alla determinazione dell'ecDNA in situ nelle sezioni renali sono l'autofluorescenza endogena dalla fissazione nella formalina e l'analisi laboriosa delle immagini. Qui descriviamo come eseguire l'uso di questa autofluorescenza, rilevare l'ecDNA e usare l'apprendimento automatico supervisionato per la misurazione ad alta velocità effettiva dell'ecDNA. Abbiamo precedentemente pubblicato la misurazione di NET e MPO extracellulare (ecMPO) utilizzando una macro in ImageJ, ora dimostriamo la semi-automazione di questi metodi utilizzando l'apprendimento automatico supervisionato¹. Dimostriamo l'adattabilità dello strumento di apprendimento automatico, per classificare una macchia alternativa per NET ed ecMPO all'interno della stessa immagine. Questi metodi di colorazione descritti qui per rilevare ecDNA, NET ed ecMPO possono essere tradotti in altri organi solidi e malattie in cui ecDNA, NETS ed ecMPO svolge un ruolo nel perpetuare malattie come l'artrite reumatoide e il lupus^17,18.

Protocollo

Questo metodo consente il rilevamento di pan ecDNA da tutte le forme di morte cellulare. Lo stesso metodo e gli anticorpi sono utilizzati per il tessuto di biopsia renale umana (dal punto 4). Tutti i soggetti animali e umani hanno avuto l'approvazione etica dalla Monash University, e Monash Health, Clayton, Victoria, Australia.

1. Colorazione per l'ecDNA con DAPI e

1. Indurre un modello di 20 giorni di anti-mieloperoxidase glomerulofritis (anti-MPO-GN) in 8-10 settimana vecchi topi C57/Bl6, con controlli⁹.
   1. Eutanasia i topi umanamente utilizzando una camera di CO_2.
   2. Rimuovere i reni facendo un'incisione mediana anteriore attraverso la pelle con le forbici, quindi tagliare con attenzione il peritoneo e pin indietro su una scheda di dissezione. Utilizzando pinze spingere da parte la fascia renale anteriore e peritoneo parietale e tagliare il rene libero tagliando l'unetto e vasi sanguigni (arteria renale e vena) al bacino renale. Rimuovere con pinze e tagliare i reni a metà (piano sagittale) con un bisturi taglia 22.
   3. Mettere il rene in fissativo (4% di formalina tampomata) per 16 ore a temperatura ambiente (RT). Rimuovere e immergere il rene fisso nel 30% di etanolo per 24 ore prima dell'elaborazione.
2. Elaborare i reni utilizzando un ciclo standard di 6 ore:
   70% di etanolo per 15 min
   90% di etanolo per 15 min
   100% etanolo per 15 min
   100% di etanolo per 20 min
   100% etanolo per 25 min
   100% etanolo per 30 min
   Xylene per 20 min
   Xylene per 30 min
   Xylene per 40 min
   Cera per 30 min
   Cera per 35 min
   Cera per 40 min
   NOTA: Questo è importante in quanto i reni non devono essere sottoposti a un'esposizione prolungata al calore nella cera, in quanto può distruggere gli antigeni di interesse.
3. Tagliare 3 sezioni su un microtoma e montare su vetrini al microscopio in vetro disponibili in commercio rivestiti con una carica positiva. Lasciare asciugare durante la notte.
4. Mettere i vetrini in una griglia di scivolo in un forno a 60 gradi centigradi per 60 min.
   NOTA: i passaggi 1.3 e 1.4 sono fondamentali per garantire che le sezioni non fluttuino durante la fase di recupero dell'antigene.
5. Immergere i vetrini in due cambi di solvente (xilene o sostituto) per 40 min ciascuno, in un cappuccio fumato.
6. Reidrata i vetrini in etanolo al 100%, 100% etanolo, 70% etanolo per 5 min ciascuno. Lavare per 5 min in acqua di rubinetto.
7. Mettere una piastra calda in una cappa di fumi e una soluzione di recupero dell'antigene prebolile (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) in una pentola a pressione. Non appena la soluzione di recupero dell'antigene inizia a bollire, posizionare i vetrini nella pentola orizzontalmente utilizzando un paio di pinze e bloccare il coperchio. Bollire in alto (equivalente a 15 psi o 103 kPa) per 10 min.
   NOTA: Questo passaggio è fondamentale in quanto recupera l'antigene di interesse smascherando l'epitopo dell'antigene (croce collegata tramite la fissazione di formalina) per consentire il legame specifico dell'anticorpo dell'epitopo la successiva colorazione non funzionerà senza di essa.
8. Togliere la pentola a pressione dal fuoco e rimuovere immediatamente il coperchio eseguendo il rubinetto freddo sulla parte superiore del coperchio in un lavandino. Lasciare i vetrini in acquisiglia per 20 min nella soluzione di recupero dell'antigene.
9. Lavare due volte i vetrini per 5 min in 0,01 M di fosfato tampinato salina (PBS) (pH 7.4) su uno shaker orbitale.
10. Utilizzare una penna idrofobica per disegnare cerchi intorno al tessuto renale facendo attenzione a non lasciare asciugare alcun tessuto in questo tempo.
11. Blocca il tessuto in 10% di pollo sera in 5% di albumina di siero bovino (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) per 30 min, 60 LL per sezione. Non lavare dopo questo passaggio, ma rimuovere con cura la soluzione di blocco utilizzando una pipetta da 60,L, non lasciare che le sezioni si asciughino.
12. Applicare il cocktail anticorpale primario per il cocktail anticorpale primario per il 1/1000 diluito in 1% BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M), 60 l per sezione e incubare durante la notte in una camera di umidità a 4 gradi centigradi.
13. Lavare due volte i vetrini per 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) su uno shaker orbitale.
14. Applicare anticorpo secondario, pollo anti coniglio 488 (1/200), 60 l per sezione diluito in 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) per 40 min a RT.
15. Lavare i vetrini due volte per 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) su uno shaker orbitale.
16. Immergi gli scivoli nello 0,3% Sudan Nero nel 70% di etanolo per 30 min in un barattolo di Coplin.
    NOTA: Questo passaggio è importante in quanto disattiva l'autofluorescenza causata dalla fissazione della formalina.
17. Lavare i vetrini nell'acqua del rubinetto per rimuovere il precipitato e immergersi in PBS (pH 7.4, 0.01 M) per 10 min per evitare la formazione di ulteriori precipitati Sudan Black.
18. Montare i vetrini su rivestimenti in vetro confocale utilizzando tre gocce da 60 l di soluzione di montaggio con DAPI e sigillare i copricoproni con smalto applicando intorno al perimetro della coverslip.
19. Lasciare che i vetrini guariscano per 24 ore alla RT (per consentire a DAPI di penetrare) e poi conservare a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.
    NOTA: Importante da tenere al buio per evitare lo sbiadimento delle sonde fluorescenti.
20. Diapositive di immagini utilizzando una testa di scansione laser confocale collegata a un microscopio. Acciaglia le diapositive con il laser 405 per DAPI e il laser 488 per Beta Actin. Acquisire immagini a piano singolo da 1024 x1024 pixel utilizzando l'acquisizione sequenziale delle linee e la media a 4 linee, che è essenziale per rilevare l'ecDNA. Viene utilizzato l'obiettivo dell'olio 40x 1.0 NA.
    1. Immagine di un minimo di 20 glomeruli per campione. Salvare le immagini come file ND2.

2. Analisi DAPI e -Actin

1. Installare ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. Verifica che la segmentazione Weka addestrabile sia disponibile in Plugins. Proprietà Segmentation . Segmentazione Weka addestrabile.
3. Rilasciate l'immagine sulla barra degli strumenti di ImageJ. Fare clic su Immagine . Proprietà Color (Colore) Dividi canali. Apparirà un'immagine con DAPI in colorazione blu tutti i nuclei e apparirà 1 immagine con l'atto z in verde, che delinea il glomeruli.
   1. Creare un file unito delle singole immagini per disegnare una regione di interesse (ROI) per il glomerulus facendo clic su Colore Unisci canali. Una finestra pop-up chiederà di assegnare un colore a ogni canale. Dopo aver assegnato un colore a ciascun canale, selezionare la casella Crea composito e la casella Mantieni immagini di origine e fare clic su OK. Apparirà un'immagine composita unita.
   2. Utilizzando come guida la colorazione dell'atto z-act, disegnare un ROI intorno al ciuffo glomerare. Tieni da parte questa immagine per utilizzare il ROI alla fine di questo protocollo.
4. Eseguire una sfocatura gaussiana sulla singola immagine BLU DAPI. Fare clic su Processo . Proprietà Filters . Sfocatura Gaussiana, mettere in 1-2.00. L'immagine ora apparirà un po ' sfocata, ma i nuclei sono ora lisci e lo sfondo ammorbidito.
   NOTA: questo passaggio è preformato per rimuovere il disturbo per pulire l'immagine dagli artefatti che potrebbero impedire il rilevamento rilevante degli attributi dell'immagine da analizzare.
5. Fare clic su Plugins Proprietà Segmentation . Segmentazione Weka addestrabile.
6. Utilizzando lo strumento linea sulla barra degli strumenti in ImageJ, prima traccia intorno a nuclei intatti utilizzando gli strumenti a mano libera (ci sono le opzioni degli strumenti linea, circolare e quadrata disponibili tra cui scegliere) e quindi aggiungere alla casella Aggiungi classe 1.
7. Utilizzando lo strumento linea sulla barra degli strumenti in ImageJ delineare aree di sfondo alla casella Classe 2.
8. Fare clic sull'etichetta del pulsante Crea nuova classe nella finestra di segmentazione Weka e sull'etichetta "ecDNA". Utilizzare lo strumento linea (dalla barra degli strumenti ImageJ) per delineare il DNA extranucleare macchiato da DAPI.
9. Fare clic sul pulsante Training Classifier nel menu training nella finestra di segmentazione Weka addestrabile.
   NOTA: il pulsante STOP verrà visualizzato al posto del pulsante Classificatore treno e rimarrà fino al termine dell'allenamento. Non fare clic su questo pulsante durante l'allenamento in quanto il processo verrà interrotto.
10. Fare clic sul pulsante Crea risultato per creare un'immagine con tutti i componenti classificati, costituita da nuclei intatti, lo sfondo e l'ecDNA identificato.
11. Fare clic sul pulsante Ottieni probabilità. Commutazione del mouse per dare un'immagine in bianco e nero di tutte le classi con l'oggetto di selezione evidenziato in bianco.
12. Duplicare questa immagine facendo clic su Immagine Duplica.
13. Passare allo schermo utilizzando il pulsante del mouse che contiene l'ecDNA. Applicare una soglia per ottenere solo ciò che è stato identificato come ecDNA. Fare clic su Applica quando la soglia è sufficiente.
14. Se dopo la soglia, ci sono più aree di DNA che non sono ecDNA, tornare all'immagine addestrata originale, aggiungere più classificatori e ripetere i passaggi 2.1-2.13.
15. Fare clic su Immagine . Regolazione dell'immagine Rendi binario. Copiate il ROI glomerare fatto nel passaggio 2.3 e fate clic su Ctrl -Maiusc-E. Attivare la finestra di Weka tramite Modifica Proprietà Selections (Selezione) Restore, che ripristina la selezione. Fare clic su Analizza particelle, che misurerà solo le particelle di ecDNA all'interno del glomerulus.
    NOTA: Un foglio dei risultati viene calcolato con il conteggio delle particelle, l'area, la media dei pixel e la percentuale di glomerulus contenente ecDNA. Questi risultati possono essere esportati in un foglio di calcolo e salvati, per un'analisi statistica successiva.
16. Salvare il classificatore come ecDNA.classifier scegliendo Salva classificatore dal menu delle opzioni nell'app ImageJ sul desktop. Quindi fare clic su Salva dati dal menu delle opzioni e salva come ecDNA.arff nella cartella ImageJ. Il ROI dovrà essere aggiunto manualmente ogni volta come glomerulus dimensioni e forma cambierà, tuttavia il programma ha imparato che cosa è ecDNA.
17. Per riapplicare il modello alle immagini successive, ripetere i passaggi da 2.1 a 2.5 con una nuova immagine. Fare clic su Carica classificatore dal menu delle opzioni, quindi su ecDNAmodel.classifier nella cartella ImageJ del passaggio 2.16. Verrà visualizzato il menu del registro e verrà eseguito il modello.
18. Una volta eseguito il modello, fare clic su Carica dati nel menu delle opzioni e selezionare il file ecDNA.arff salvato nella cartella ImageJ dal passaggio 2.16. Fare clic su Crea risultato. Se l'immagine risultante non è riuscita a rilevare tutti i nuclei, lo sfondo o l'ecDNA, fare clic sul classificatore di ri-training e aggiungere altri classificatori e salvare il nuovo modello. Completare il processo di analisi ripetendo i passaggi 2.9-2.16.
    NOTA: È possibile utilizzare più immagini per generare il modello finale utilizzato per rilevare l'ecDNA. Ciò si ottiene applicando il modello alle immagini successive, aggiungendo più classificatori e salvando il nuovo modello e i nuovi dati nella cartella ImageJ. Questo può essere particolarmente importante quando diversi campioni hanno uno sfondo più alto. Il programma Weka Segmentation è anche compatibile con il linguaggio macro ImageJ che consente a molti dei comandi di essere registrare macro per automatizzare alcuni dei passaggi.

3. Misurazione delle trappole extracellulari dei neutrofili e dell'ecMPO

NOTA: Questo metodo identifica i NET per co-localizzazione del DNA extracellulare, Citrullinated Histones peptidyl arginase 4 (PAD4) e MPO.

1. Indurre un modello di 20 giorni di anti-mieloperoxidase glomerulofritis (anti-MPO-GN) in 8-10 settimana vecchi topi C57/Bl6, con controlli⁹.
   1. Eutanasia i topi umanamente utilizzando una camera di CO_2.
   2. Rimuovere i reni facendo un'incisione mediana anteriore attraverso la pelle con le forbici, quindi tagliare con attenzione il peritoneo e pin indietro su una scheda di dissezione. Utilizzando pinze spingere da parte la fascia renale anteriore e peritoneo parietale e tagliare il rene libero tagliando l'unetto e vasi sanguigni (arteria renale e vena) al bacino renale. Rimuovere con pinze e tagliare i reni a metà (piano sagittale) con un bisturi taglia 22.
   3. Mettere il rene in fissativo (4% di formalina tampomata) per 16 ore a temperatura ambiente (RT). Rimuovere e immergere il rene fisso nel 30% di etanolo per 24 ore prima dell'elaborazione.
2. Elaborare i reni utilizzando un ciclo standard di 6 ore:
   70% di etanolo per 15 min
   90% di etanolo per 15 min
   100% etanolo per 15 min
   100% di etanolo per 20 min
   100% etanolo per 25 min
   100% etanolo per 30 min
   Xylene per 20 min
   Xylene per 30 min
   Xylene per 40 min
   Cera per 30 min
   Cera per 35 min
   Cera per 40 min
   NOTA: I reni non devono essere sottoposti a un'esposizione prolungata al calore nella cera, in quanto può distruggere gli antigeni di interesse.
3. Tagliare 3 sezioni su un microtoma e montare su vetrini al microscopio in vetro disponibili in commercio rivestiti con una carica positiva. Lasciare asciugare durante la notte
4. Mettere i vetrini in una griglia di scivolo in un forno a 60 gradi centigradi per 60 min.
   NOTA: i passaggi 3.3-3.4 sono fondamentali per garantire che le sezioni non fluttuino durante la fase di recupero dell'antigene.
5. Immergere i vetrini in due cambi di solvente (xilene o sostituto) per 40 min ciascuno, in un cappuccio fumato.
6. Reidrata i vetrini in etanolo al 100%, 100% etanolo, 70% etanolo per 5 min ciascuno.
7. Lavare per 5 min in acqua di rubinetto.
8. Mettere una piastra calda in una cappa di fumi e una soluzione di recupero dell'antigene prebolile (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) in una pentola a pressione. Non appena la soluzione di recupero dell'antigene inizia a bollire posizionare i vetrini nella pentola orizzontalmente utilizzando un paio di pinze e bloccare il coperchio. Bollire in alto (equivalente a 15 psi o 103 kPa) per 10 min.
   NOTA: Questo passaggio recupera l'antigene di interesse smascherando l'epitopo dell'antigene (croce collegata tramite la fissazione della formalina) per consentire il legame specifico dell'anticorpo dell'epitopo la successiva colorazione non funzionerà senza questo passaggio.
9. Togliere la pentola a pressione dal fuoco e rimuovere immediatamente il coperchio eseguendo il rubinetto freddo sulla parte superiore del coperchio in un lavandino. Lasciare i vetrini in acquisiglia per 20 min nella soluzione di recupero dell'antigene.
10. Lavare i vetrini due volte per 5 min in fosfato buffersline (PBS) (pH 7.4, 0.01 M) su uno shaker orbitale.
11. Utilizzare una penna idrofobica per disegnare cerchi intorno al tessuto renale facendo attenzione a non lasciare asciugare alcun tessuto in questo tempo.
12. Blocca il tessuto in 10% di pollo sera in 5% di albumina di siero bovino (BSA)/PBS (pH 7,4, 0,01 M) per 30 min, 60 LL per sezione. Non lavare dopo questo passaggio, ma rimuovere con cura la soluzione di blocco utilizzando una pipetta da 60.L. Non lasciare asciugare le sezioni.
13. Preparare un cocktail degli anticorpi primari diluiti in 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) in 1 tubo. Applicare 60 sezioni l per rene. La concentrazione degli anticorpi primari è la seguente:
    Coniglio anti-uomo/topo H3Cit 1/100
    Mouse anti umano/tono PAD4 1/50
    Capra anti umano/topo MPO 1/200
14. Incubare durante la notte a 4 gradi centigradi in una camera di umidità.
15. Lavare due volte i vetrini per 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) su uno shaker orbitale.
16. Preparare un cocktail degli anticorpi secondari in 1 tubo. Gli anticorpi secondari sono applicati nell'1% di BSA/PBS, 60 l per sezione come segue:
    Pollo anti coniglio 488 1/200.
    Pollo anti topo 647 1/200.
    Pollo anti capra 594 1/200.
17. Incubare a RT per 40 min.
18. Lavare due volte i vetrini per 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) su uno shaker orbitale.
19. Applicare l'anticorpo secondario 1:200 nell'1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) per 40 min a RT 60 -L per sezione.
20. Lavare due volte i vetrini per 5 min in PBS (pH 7.4, 0.01 M) su uno shaker orbitale.
21. Immergi i vetrini nello 0,3% Sudan Nero nel 70% di etanolo per 30 min.
22. Lavare i vetrini nell'acqua del rubinetto per rimuovere il precipitato e poi immergersi in PBS (pH 7.4, 0.01 M) per 10 min per evitare la formazione di ulteriori precipitati Sudan Black.
23. Montare i vetrini su rivestimenti in vetro confocale utilizzando tre gocce da 60 l di soluzione di montaggio con DAPI. Sigillare i coprilabbra con smalto applicando intorno al perimetro della vela.
24. Lasciare che i vetrini guariscano per 24 ore alla RT (per consentire a DAPI di penetrare) e poi conservare a 4 gradi centigradi protetti dalla luce. Tenere al buio per evitare lo sbiadimento delle sonde fluorescenti.
25. Diapositive di immagini utilizzando una testa di scansione laser confocale collegata a un microscopio. Acciaglia i vetrini con il laser 405 per DAPI e il 488 Laser per H3Cit, 561 per MPO e 647 per PAD4. Acquisire immagini pixel a piano singolo da 1024x1024 utilizzando l'acquisizione sequenziale della linea e la media a 4 linee, che è essenziale per rilevare l'ecDNA. Utilizzare un obiettivo di olio 40x 1.0 NA. Immagine di un minimo di 20 glomeruli per campione. Salvare le immagini come file ND2.

4. Trappole extracellulari Neutrophil e analisi ecMPO

1. Installare ImageJ: https://imagej.net/Fiji/Downloads.
2. Verifica che la segmentazione Weka addestrabile sia disponibile in Plugins. Proprietà Segmentation . Segmentazione Weka addestrabile.
3. Rilasciare l'immagine in ImageJ. Fare clic su Immagine . Proprietà Color (Colore) Dividi canali. Apparirà un'immagine con DAPI in colorazione blu tutti i nuclei, un'immagine con H3Cit in verde, un'immagine con MPO in rosso e un'immagine con PAD4 in bianco.
   1. Creare un file unito delle singole immagini per disegnare un ROI per il glomerulus facendo clic su Colore Unisci canali. Una finestra pop-up chiederà di assegnare un colore a ogni canale. Dopo aver assegnato un colore a ciascun canale, selezionare la casella Crea composito e la casella Mantieni immagini di origine e fare clic su OK. Viene visualizzata un'immagine unita. A differenza del protocollo per ecDNA in precedenza useremo l'immagine composita per eseguire il resto dei passaggi.
4. Eseguite una sfocatura gaussiana sull'immagine composita. Questo permette di lisciare fuori i nuclei. Fare clic su Processo . Proprietà Filters . Sfocatura Gaussiana, mettere in 1.00-2.00. L'immagine ora apparirà un po 'sfocata, ma i nuclei sono ora lisci e lo sfondo ammorbidito.
   NOTA: questo passaggio è preformato per rimuovere il disturbo per pulire l'immagine dagli artefatti che potrebbero impedire il rilevamento rilevante degli attributi dell'immagine da analizzare.
5. Fare clic su Plugins Proprietà Segmentation . Segmentazione Weka addestrabile. Apparirà un'intera finestra nuova con l'immagine da analizzare e gli strumenti di menu specifici per la segmentazione di Weka.
6. Utilizzando lo strumento linea sulla barra degli strumenti (in ImageJ), prima traccia intorno a nuclei intatti non positivi per tutti e 4 i componenti NET (MPO, PAD4, DAPI e H3Cit) utilizzando lo strumento mano libera e quindi aggiungere alla casella Aggiungi classe 1.
7. Utilizzando lo strumento linea sulla barra degli strumenti ImmagineJ delineare le aree di sfondo per la classe 2 scatola.
8. Fare clic sull'etichetta del pulsante Crea nuova classe nel menu delle etichette e l'etichetta "NET". Utilizzare lo strumento linea per delineare NETS identificato come co-localizzazione DAPI (blu), MPO (rosso), PAD4 (bianco) e citrullinate istoni (verde).
9. Fare clic sull'etichetta del pulsante Crea nuova classe nel menu delle etichette e sull'etichetta "ecMPO". Utilizzare lo strumento linea per delineare MPO (rosso) che è senza cella.
10. Fare clic sul pulsante Training Classifier nel menu Training nella finestra Trainable Weka Segmentation.
    NOTA: il pulsante STOP verrà visualizzato al posto del pulsante Classificatore treno e rimarrà fino al termine dell'allenamento. Non fare clic su questo pulsante durante il training e il processo verrà interrotto.
11. Fare clic sul pulsante Crea risultato nel menu di allenamento e viene creata un'immagine con tutti i componenti classificati, costituiti da nuclei intatti, lo sfondo e ciò che è stato identificato come ecMPO.
12. Fare clic sul pulsante Ottieni probabilità nel menu di allenamento. Commutazione del mouse per dare un'immagine in bianco e nero di tutte le classi con l'oggetto di selezione evidenziato in bianco.
13. Duplicare sia la probabilità NET che l'immagine di probabilità ecMPO facendo clic su Immagine Duplica.
14. Passare allo schermo utilizzando il pulsante del mouse che contiene i file NET. Applicare una soglia per garantire solo l'evidenziazione delle NET identificate. Nella barra degli strumenti del menu ImmagineJ, fare clic su Immagine . Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Spostare le barre di attivazione/disattivazione scorrevoli finché non vengono evidenziate sui componenti NET. Fare clic su Applica quando si è soddisfatti della soglia. Ripetere la stessa procedura per ecMPO.
15. Se dopo la soglia sono ancora rilevanti aree di ecMPO o NET, tornare all'immagine addestrata originale e aggiungere altri classificatori e riapplicare i passaggi 4.1-4.14.
16. Fare clic su Immagine . Regolazione dell'immagine Rendi binario. Copiate il ROI glomerare creato nel passaggio 4.3, fate clic su Ctrl -Maiusc-E. Attivare la finestra di Weka tramite Modifica Proprietà Selections (Selezione) Restore, che ripristina la selezione. Fare clic su Analizza particelle per misurare solo le particelle NET all'interno dell'olmoso.
17. Passare alla schermata utilizzando il pulsante del mouse che contiene ecMPO. Applicare una soglia per garantire che vengano ottenuti solo ecMPO identificati. Fare clic su Applica quando si è soddisfatti della soglia. Ripetere il passaggio 4.16 precedente.
    NOTA: un foglio dei risultati viene calcolato con il Numero di particelle, l'area, la media dei pixel e la percentuale di glomerulus contenente sia NET che ecMPO. Questi risultati possono quindi essere inseriti in un foglio di calcolo e salvati, per un'analisi statistica successiva.
18. Salvare il classificatore come NETs.classifier scegliendo Salva classificatore dal menu delle opzioni e salva il file nell'app ImageJ sul desktop (cartella ImageJ). Quindi fate clic su Salva dati dal menu delle opzioni e salvate come file NETs.arff. Il ROI glomerare dovrà essere aggiunto manualmente ogni volta che le dimensioni e la forma glomerulus cambieranno, ma il programma ha imparato cosa sono sia i NET che l'ecMPO.
19. Per riapplicare il modello alle immagini successive, ripetere i passaggi da 4.1 a 4.5 con una nuova immagine. Fare clic su Carica classificatore dal menu delle opzioni. Fare clic su Nets.classifier nella cartella ImageJ. Il menu di registro verrà visualizzato ed eseguire il modello, una volta che il modello è stato eseguito fare clic su Carica dati nel menu delle opzioni e selezionare il file NETs.arff.
    1. Fare clic su Crea risultato. Se l'immagine risultante non è riuscita a rilevare tutti i nuclei, lo sfondo o l'ecDNA, fare clic sul classificatore di ri-training e aggiungere altri classificatori e salvare il nuovo modello. Completare il processo di analisi ripetendo i passaggi 4.11-4.19.Complete the analysis process by repeating steps 4.11-4.19.
       NOTA: Diverse immagini possono essere utilizzate per generare il modello finale utilizzato per rilevare ecDNA, ecMPO e NET. Ciò si ottiene applicando il modello alle immagini successive, aggiungendo più classificatori e salvando il nuovo modello e i nuovi dati nella cartella ImageJ. Questo può essere particolarmente importante quando diversi campioni hanno uno sfondo più alto. Il programma Weka Segmentation è compatibile con il linguaggio macro ImageJ che consente a molti dei comandi di essere registrare su macro per automatizzare alcuni dei passaggi.

Risultati

Queste immagini rappresentano i molteplici passaggi necessari per utilizzare con successo la segmentazione Weka addestrabile per ridurre al minimo la misurazione manuale ad alta intensità di lavoro dell'ecDNA nel tessuto renale FFPE color acquaescente da un topo con anti-MPO GN indotta. Questi passaggi sono riepilogati in Figura 1 e Figura 2 con le immagini prese direttamente dal programma di segmentazione Weka, delineando ogni ...

Discussione

Esistono diversi protocolli che misurano marcatori infiammatori nel siero e nelle urine di entrambi i pazienti e modelli murini di glomerulonephritis. Questo protocollo descritto consente l'analisi dei prodotti di morte cellulare (ecDNA, NET ed ecMPO) all'interno del glomerulus direttamente. I passaggi più importanti in questo protocollo sono la preparazione e l'imaging dei tessuti. Il principale elemento restrittivo dell'uso di un metodo di colorazione fluorescente per l'analisi è l'autofluorescenza del tessuto. Il te...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A2153	5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed.
Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail
Chicken sera	SIGMA	C5405	Made up in 1%BSA/PBS
Coverslips 24 x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy
EDTA 10mM	SIGMA	E6758	Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution
Ethanol 30%, 70% and 100%	Chem Supply	UN1170	Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water
Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin)	TRAJAN	NBF-500	Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood
Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	TRAJAN	J3800AM4	Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step
Goat anti human/mouse MPO antibody	R&D	AF3667	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Histosol	Clini Pure	CPL HISTOSOL 08	Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood
Hydrophobic pen	VECTOR Labs	H-400	Use to draw circle around kidney tissue
Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4)	ABCAM	ab128086	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope	Coherent Scientific		Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Phosphate Buffered Saline	SIGMA	P38135	0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time
Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless	Tefal	GSA-P2530738	Purchased at local homeware store
Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	Apply drops directly to coverslip
Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody	ABCAM	ab8227	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody	ABCAM	ab5103	Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival
Staining rack 24 slides	ProScitech	H4465	Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven
Sudan Black B	SIGMA	199664	0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature
Tris 10mM	SIGMA	T4661	Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution
Xylene	Trajan	XL005/20	Must be use used in a fume hood