En la cuantificación vivo de la rotación de proteínas en el envejecimiento C. Elegans usando Dendra fotoconvertible2

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para monitorear la degradación de la proteína huntingtina fusionada con el fluoróforo fotoconvertible Dendra2.

Resumen

Las proteínas se sintetizan y degradan constantemente dentro de una célula para mantener la homeostasis. Ser capaz de monitorear la degradación de una proteína de interés es clave para entender no sólo su ciclo de vida, sino también para descubrir desequilibrios en la red de proteostasis. Este método muestra cómo rastrear la degradación de la huntingtina de proteína causante de la enfermedad. Dos versiones de huntingtina fusionadas con Dendra2 se expresan en el sistema nervioso C. elegans: una versión fisiológica o una con un tramo expandido y patógeno de glutaminas. Dendra2 es una proteína fluorescente fotoconvertible; tras un corto pulso de irradiación ultravioleta (UV), Dendra2 cambia sus espectros de excitación/emisión de verde a rojo. Al igual que un experimento de persecución de pulsos, el volumen de negocios del rojo-Dendra2 convertido puede ser monitoreado y cuantificado, independientemente de la interferencia de green-Dendra2 recién sintetizado. Utilizando microscopía a base de confocal y debido a la transparencia óptica de C. elegans,es posible monitorear y cuantificar la degradación de la huntingtina-Dendra2 en un organismo vivo y envejecido. La huntingtina-Dendra2 neuronal se degrada parcialmente poco después de la conversión y se elimina aún más con el tiempo. Los sistemas que controlan la degradación son deficientes en presencia de huntingtina mutada y se ven afectados aún más por el envejecimiento. Los subtipos neuronales dentro del mismo sistema nervioso exhiben diferentes capacidades de rotación para huntingtina-Dendra2. En general, el seguimiento de cualquier proteína de interés fusionada con Dendra2 puede proporcionar información importante no sólo sobre su degradación y los actores de la red de proteostasis involucrados, sino también sobre su ubicación, tráfico y transporte.

Introducción

El proteome de un organismo vivo se está renovando constantemente. Las proteínas se degradan y sintetizan continuamente de acuerdo con la demanda fisiológica de una célula. Algunas proteínas se eliminan rápidamente, mientras que otras son de vida más larga. La monitorización de la dinámica de proteínas es una tarea más simple, precisa y menos invasiva cuando se utilizan proteínas fluorescentes codificadas genéticamente (OP). LosFP se forman autocatalíticamente y se pueden fusionar con cualquier proteína de interés (POI), pero no requieren que las enzimas se doblen o necesiten cofactores salvo oxígeno^1. Recientemente se ha diseñado una nueva generación de FPs para cambiar de color tras la irradiación con un pulso de luz de longitud de onda determinada. Estos FPs fotoactivables (PAFP) permiten el etiquetado y seguimiento de PDI, o de los orgánulos o células en los que residen, y examinar sus parámetros cuantitativos y/o cualitativos². Los FPs permiten rastrear el movimiento de cualquier PDI, la direccionalidad, la tasa de locomoción, el coeficiente de difusión, las fracciones móviles frente a las inmóviles, el tiempo que reside en un compartimiento celular, así como su tasa de rotación. Para orgánulos específicos, se pueden determinar la locomoción y el transporte, o eventos de fisión y fusión. Para un tipo de celda determinado, se puede establecer la posición, la tasa de división, el volumen y la forma de una celda. Fundamentalmente, el uso de PAFP permite el seguimiento sin visualización continua y sin interferencia de cualquier sonda recién sintetizada. Los estudios tanto en células como en organismos enteros han empleado con éxito PAFP para abordar cuestiones biológicas in vivo, como el desarrollo de cáncer y metástasis, montaje o desmontaje del citoesqueleto, e interacciones ARN-ADN/proteína³. En este manuscrito, la microscopía de luz y los PAFP se utilizan para descubrir las tasas de rotación de la proteína huntingtina propensa a la agregación (HTT) in vivo en un modelo C. elegans de enfermedad neurodegenerativa.

El protocolo descrito aquí cuantifica la estabilidad y degradación de la proteína de fusión huntingtina-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 es un PAFP monomérico de segunda generación⁴ que cambia irreversiblemente sus espectros de emisión/excitación de verde a rojo en respuesta a la luz UV o azul visible, con un aumento en su intensidad de hasta 4.000 veces^5,6. La huntingtina es la proteína responsable de causar la enfermedad de Huntington (EH), un trastorno neurodegenerativo hereditario fatal. Huntingtin exon-1 contiene un tramo de glutaminas (CAG, Q). Cuando la proteína se expresa con más de 39T, se desmoría en una proteína mutante, tóxica y patógena. El HTT mutante es propenso a la agregación y conduce a la muerte y degeneración de las células neuronales, ya sea como especies oligoméricas cortas o como amiloides altamente estructurados más grandes⁷.

El nematodo es un sistema modelo para el estudio del envejecimiento y la neurodegeneración gracias a su facilidad de manipulación, naturaleza isogénica, corta vida útil, y su transparencia óptica^8. Para estudiar la estabilidad de HTT in vivo, se expresó una construcción de fusión en el sistema nervioso de C. elegans. Un transgén HTT-D2 que contiene un tramo fisiológico de 25Q (HTTQ25-D2) o un tramo patológico de 97Qs (HTTQ97-D2) está sobreexpresado pan-neuronalmente a lo largo de la vida útil del nematodo⁹. Al someter a C. elegans en vivo a un punto de luz breve y centrado, una sola neurona es fotointerruptora y el HTT-D2 convertido es rastreado con el tiempo. Para establecer la cantidad de HTT-D2 degradada, la diferencia entre la señal roja del HTT-D2 recién convertido se compara con la señal roja restante de HTT-D2 después de un período de tiempo determinado. Por lo tanto, es posible investigar cómo la huntingtina se degrada cuando se encuentra en su forma expandida y tóxica en comparación con su forma fisiológica; cómo las neuronas anteriores o posteriores responden de manera diferente a la presencia de Q97 frente a Q25, especialmente durante períodos de tiempo prolongados; y cómo el colapso de la red de proteostasis (PN) durante el envejecimiento contribuye a las diferencias en las tasas de degradación. Estos resultados sólo describen un pequeño conjunto de observaciones sobre el volumen de negocios de HTT-D2. Sin embargo, muchas más preguntas biológicas relevantes tanto para el campo de la agregación de proteínas como para la proteostasis pueden abordarse con esta aplicación in vivo.

Protocolo

1. Generación de C. elegans que expresan la proteína de fusión neuronal Huntingtin-Dendra2

1. Clonar el gen que codifica el PDI en un vector de expresión de nematodos (es decir, pPD95_75, Addgene #1494), por digestión de enzima de restricción tradicional^10,ensamblaje Gibson¹¹o cualquier método de elección. Inserte un promotor para impulsar la expresión en el tejido deseado o en la etapa de desarrollo deseada. Inserte el fluoróforo Dendra2 en N- o C-terminalmente en el marco con el PDI.
2. Generar C. elegans transgénicos que expresen la construcción de fusión (por ejemplo, a través de la microinyección)¹².
   NOTA: El plásmido que lleva el transgén permanecerá como una matriz extracromosomal. La integración de la construcción no es necesaria, pero se puede realizar si se desea¹³. En este protocolo, C. elegans fueron microinyecidos con un plásmido que lleva la construcción de fusión huntingtin exón 1-Dendra2 (HTT-D2) bajo el control del promotor pan-neuronal Prgef-1. La columna vertebral de la expresión C. elegans se obtuvo de Kreis et al.¹⁴, el exón huntingtina 1 con Q25 o Q97 se obtuvo de Juenemann et al.¹⁵, y Dendra2 se obtuvo de Hamer et al.¹⁶.

2. Coincidencia de edad y mantenimiento de C. elegans

1. La edad coincide con todos los nematodos mediante la sincronización con el tratamiento de solución de hipoclorito alcalino¹⁷ o a través de la puesta de huevos durante 4 h a 20 oC. Para la puesta de óvulos, coloque 10 adultos gravidos en una placa de medios de crecimiento de nematodos recién sembrados (NGM) y déjela durante 4 horas antes de retirarla. Los huevos puestos en este intervalo de tiempo darán lugar a nematodos sincronizados.
2. Mantener los C. elegans experimentales en placas de medios de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con la fuente de alimentos bacterianos E. coli OP50, después de la cría de nematodos estándar¹⁸.
3. Cultivar nematodos a 20oC hasta la etapa deseada. Para este protocolo, las edades requeridas son los días 4 y 10.
   NOTA: Los adultos jóvenes en el día 4 pueden ser identificados por la presencia de huevos en sus gónadas y su alta movilidad. Los 10 nematodos del día son post-fértiles, y sufren deterioro de los tejidos y deterioro de la locomotora¹⁹.
4. Para el día 10 nematodos, paso diario después de la etapa L4 en el día 3, una vez que los nematodos son fértiles, para evitar una población mixta.

3. Preparación de diapositivas de microscopía para imágenes

1. Prepare las diapositivas de microscopía el día de la toma de imágenes. En un microondas, derretir la agarosa de grado general a una concentración de 3% (p/v) en ddH₂O. Dejar enfriar ligeramente.
2. Cortar la punta de una punta de pipeta de 1 ml y aspirar aproximadamente 400 l de agarosa derretida. Coloque suavemente unas gotas de agarosa en un portaobjetos de vidrio limpio e inmediatamente coloque otra diapositiva en la parte superior, asegurándose de que se crea una almohadilla delgada de agarosa entre los dos. Dejar secar antes de deslizar suavemente o levantar la corredera superior.
3. Coloque los portaobjetos de agarosa en un recipiente humidificado para evitar que se sequen. Estos se pueden utilizar dentro de 2-3 h.
   NOTA: Evite la formación de pequeñas burbujas en la agarosa, ya que los nematodos pueden quedar atrapados en su interior.

4. Definición de parámetros del microscopio confocal

NOTA: Antes de montar los nematodos y la adquisición de datos, defina todos los ajustes en el software de adquisición confocal. La configuración se puede adaptar al hardware de imágenes y al software de su elección.

1. Abra el software confocal y defina la configuración de imágenes láser. Establezca el camino de luz para excitación/emisión para Dendra2 verde a 486-553 nm y para Dendra2 rojo a 580-740 nm. Ajuste la potencia y la ganancia de ambos canales/láseres de acuerdo con la intensidad del fluoróforo. No cambie la ganancia digital o el desplazamiento y ajuste el agujero como completamente abierto.
2. Defina la configuración de adquisición: seleccione un modo de canal secuencial y cambie la pista de cada fotograma. Establezca el modo de escaneo como fotograma y el tamaño del fotograma como 1.024 x 1.024, con un paso de línea de 1. Establezca el promedio en 2, y el promedio por el método medio y el modo de línea unidireccional. Establezca la profundidad de bits en 8 bits.
3. Defina la configuración de adquisiciones multidimensionales para la conversión de Dendra2. Para la conversión y el blanqueo, utilice el láser de diodo de 405 nm establecido en un 60% de potencia de energía. Si está disponible, active el GaAsP de blanqueo seguro para proteger los detectores.
4. Seleccione una serie temporal de dos ciclos, con un intervalo de 0,0 ms en el medio, y el inicio y la parada normales. Comience el blanqueo después del escaneo 1 de 2 y repita para 30 iteraciones. Deja de blanquear cuando la intensidad baje al 50%.
5. Defina la velocidad de adquisición/permanencia de píxeles como rápida (p. ej., máximo de 12) para la conversión y la velocidad media (p. ej., medio 5) para capturar una imagen de ajuste.
   NOTA: Los parámetros de blanqueo definidos aquí son pautas. Para otros PDI etiquetados de Dendra2, los ajustes de potencia láser y las iteraciones y valores de blanqueo deben establecerse empíricamente.

5. Montaje de C. elegans en diapositivas de microscopía

NOTA: Si es posible, coloque un estereomicroscopio de montaje cerca de la configuración del microscopio confocal y monte los nematodos justo antes de la toma de imágenes.

1. En la cubierta de vidrio deslice en el lado opuesto de la almohadilla de agarosa, dibuje una ventana con cuatro cuadrados con un marcador permanente y numérelos.
2. Pipetear 15 l de levamisol en el centro de la almohadilla de agarosa. La concentración de levamisol variará según la edad del nematodo: Cuando el día de toma de imágenes 4 nematodos utilizan 2 mM de levamisol; cuando el día 10 nematodos utilizan 0,5 mM de levamisole.
3. Transfiera cuatro nematodos al líquido usando un pico de alambre. Con la ayuda de un pico de pestañas, mueva suavemente cada nematodo individual a un cuadrado de ventana. Gire la pestaña para que cualquier rastro de E. coli OP50 se diluya y su fondo fluorescente no interfiera con la adquisición de la señal.
4. Espere a que los nematodos casi dejen de moverse y coloque suavemente un resbalón de cubierta en la parte superior del líquido para inmovilizar los nematodos en la capa de levamisol entre la almohadilla de agarosa y el resbalón de la cubierta.
5. Coloque la diapositiva invertida en la etapa confocal para tomar una imagen de los nematodos.

6. Conversión de Dendra2 verde: Adquisición de datos en el momento cero

NOTA: Los experimentos de persecución de pulsos comienzan convirtiendo irreversiblemente la proteína de fusión Dendra2 de un fluoróforo emisor verde a uno rojo.

1. Usando el ocular del microscopio, localice el primer nematodo con un objetivo de 20x bajo fluorescencia verde. Concéntrese en la cabeza o la cola y cambie al modo confocal.
2. Comience a escanear con láser en vivo con el láser azul de 488 nm para visualizar el Dendra2 verde en el canal verde EGFP (ex/em a 486-553 nm). Seleccione una sola neurona y concéntrela. Zoom 3x y aumentar el objetivo del rayo láser⁴.
   NOTA: Seleccione una neurona por nematodo. Cada neurona constituirá una muestra o punto de datos.
3. Encuentra el plano de proyección máximo y, de acuerdo con el brillo del fluoróforo, aumenta o disminuye la ganancia o la potencia láser para obtener una imagen saturada pero no sobreexpuesta identificable por el indicador de rango de color. Una vez definido esto, detenga el escaneo.
   NOTA: No irradiar la muestra durante demasiado tiempo o con demasiada potencia, ya que la excitación con luz azul visible de 488 nm también puede convertir Dendra2, aunque lenta y menos eficientemente⁴.
4. En el software, abra la pestaña para seleccionar las regiones de interés (ROI) y dibuje un primer ROI alrededor de la neurona seleccionada. Defina una segunda región de interés más grande que abarque la cabeza del nematodo e incluya el primer ROI.
5. En la configuración de blanqueo, seleccione el primer ROI que se adquirirá, blanquea y analizará. Seleccione el segundo ROI que se adquirirá y analizará, pero no se blanquee.
6. Establezca la velocidad de escaneo al máximo (es decir, morar rápidamente los píxeles) e inicie el experimento para convertir las neuronas Dendra2 seleccionadas.
   NOTA: Una vez realizado el experimento, la imagen adquirida dará como resultado dos imágenes: una antes y otra después de la conversión. Para el canal verde, la primera imagen debe tener una señal verde más alta que disminuya en la segunda imagen debido a la conversión de la Dendra2 verde. Para el canal rojo, la primera imagen debe ser negativa y no mostrar ninguna señal, con una señal roja que aparece en la imagen de conversión posterior. Si la señal verde no disminuye, la conversión no se produjo y los ajustes, como la potencia láser 405 o el número de iteraciones, deben modificarse. Si hay una señal roja en la primera imagen, entonces la potencia láser de 488 nm utilizada era demasiado alta y una parte del Dendra2 verde ya se convirtió en rojo. En este caso, se debe seleccionar una nueva neurona/nematodo.
7. Inmediatamente después de la conversión, comience a escanear en vivo con el láser verde de 561 nm para visualizar Dendra2 en el canal rojo (ex/em a 580-740 nm). Encuentre el enfoque y la proyección máxima respectiva de la neurona convertida utilizando el indicador de color de rango para evitar la sobreexposición.
8. Ajuste rápidamente la velocidad de escaneo a una velocidad de permanencia de píxeles más baja (por ejemplo, 5x) y adquiera una imagen instantánea de ambos canales a una resolución más alta. Esta imagen se define como punto de tiempo cero (T0) después de la conversión.
   NOTA: La velocidad de adquisición de la imagen convertida puede variar. Sin embargo, una vez elegida, esta velocidad debe mantenerse constante durante toda la recopilación de datos.
9. Guarde el análisis con un nombre y/o número identificables, seguido de la etiqueta de tiempo cero (T0).
   NOTA: Es aconsejable guardar también la imagen del experimento de conversión (paso 6.6) para ilustrar la falta de señal roja antes de la conversión y su apariencia después.

7. Imágenes de Dendra2 rojo convertido para la adquisición de datos en un segundo punto de tiempo seleccionado

1. Para realizar un seguimiento de la degradación de Dendra2 a lo largo del tiempo, defina un segundo punto de tiempo para volver a crear una imagen del mismo nematodo/neurona. Seleccione el segundo punto de tiempo experimentalmente para abordar cualquier pregunta biológica pertinente. Para el protocolo descrito aquí, Dendra2 se crea una imagen tanto en 2 h (T2) como en 24 h (T24) después de la conversión.
   1. En el punto de tiempo seleccionado, busque el mismo nematodo/neurona con el uso del ocular y la fluorescencia roja.
   2. Abra la imagen T0 del nematodo/neurona respectivo y vuelva a cargar/reutilizar la configuración de la imagen. Asegúrese de que la configuración de adquisición de la instantánea sea exactamente la misma al adquirir las imágenes T0, T2 y T24 h.
   3. Escaneando en vivo en el canal rojo, pon la neurona roja convertida en el foco. Debido a que el Dendra2 rojo se degrada con el tiempo, el indicador de rango mostrará una proyección máxima menos intensa. No cambie ningún parámetro de adquisición y obtenga una instantánea a la misma velocidad (por ejemplo, 5x) que la primera imagen.
2. Para rastrear la degradación de Dendra2 después de 4 h o más, rescata los nematodos después de la conversión.
   1. Retire la diapositiva del microscopio inmediatamente después de convertir e imágenes de los cuatro nematodos. Retire suavemente el cubreobjetos y, con el uso de un pico de alambre, levante cada nematodo de la almohadilla de agarosa.
   2. Coloque cada nematodo individualmente en una placa NGM debidamente etiquetada e identificable.
   3. Para el segundo punto de tiempo, monte el nematodo de nuevo en una almohadilla de agarosa fresca y proceda con la toma de imágenes del Dendra2 rojo convertido siguiendo las instrucciones de la sección 6.

8. Análisis de imagen de Dendra2 convertido

NOTA: El análisis de la degradación de Dendra2 se realiza con el software Fiji/ImageJ²⁰.

1. Abra Fiji y arrastre y suelte el archivo .lsm en la barra de Fiji. Abra la imagen T0 tomada justo después de la conversión y la imagen del mismo nematodo tomada en el punto de tiempo seleccionado después de la conversión (T2 o T24 h).
   NOTA: Para rastrear la degradación de la proteína de interés fusionada con Dendra2 sólo es necesario analizar el canal rojo.
2. Establecer los parámetros de medición desde el menú: Analizar ? Establecer medidas. Seleccione las funciones Area y Integrated Density.
3. Seleccione la imagen obtenida con el canal rojo. Seleccione la herramienta Selección de polígonos en la barra de Fiji.
4. Identifique la neurona convertida en la imagen T0 y dibuje un ROI a su alrededor utilizando la herramienta de selección.
   1. Para identificar correctamente los contornos de la neurona, resalte los umbrales de intensidad seleccionando en la barra Imagen . Ajustar ? Umbral. Arrastre el cursor de la barra para delinear el umbral y realizar un seguimiento alrededor de esta área con la herramienta polígono. Para generar un ROI preciso, también es posible utilizar el contorno de la neurona seleccionada desde el canal verde.
5. Una vez realizada la selección en la ventana roja del canal, pulse Analizar . Medir. Aparecerá una ventana emergente denominada Resultados e incluirá los valores de ROI para Area, IntDeny RawIntDen.
6. Realice el mismo proceso de selección y medición para la imagen del segundo punto de tiempo (T2 o T24 h).
7. Copie los valores obtenidos en un software de hoja de cálculo, teniendo cuidado de registrar adecuadamente los valores en T0 después de la conversión, y en T2 o T24 h después de la conversión.

9. Cálculo de la relación de degradación de Dendra2

1. Para calcular la relación de degradación, asigne primero un valor de 1 (o 100%) para cronometro la degradación desde el punto de tiempo cero (es decir, justo después de la conversión, cuando todo el Dendra2 rojo convertido todavía está presente). Esto resulta de dividir el valor de IntRawDen de T0 por sí mismo.
2. Para calcular la reducción de la señal de intensidad de Dendra2 roja a lo largo del tiempo y la degradación, divida el valor de RawIntDen del segundo punto de tiempo (por ejemplo, T2 o T24 h) por el valor de RawIntDen de T0. El número resultante debe ser menor que 1. Estos valores también se pueden expresar como porcentajes, definiendo T0 como 100%.
3. Repita la sección 7 para cada nematodo convertido. Para una representación gráfica de la degradación de Dendra2, trace un gráfico de dispersión o gráfico de barras con el porcentaje o los valores de relación de disminución de fluorescencia obtenidos en el eje y. Aplique cualquier análisis estadístico deseado e ilustre en el gráfico.

Resultados

Dos cepas de nematodos que expresan el fragmento de proteína huntingtina exon-1 en marco con la proteína fotoconvertible Dendra2 se obtuvieron mediante microinyección y los plásmidos se mantuvieron como una matriz extracrosómica. La construcción de fusión se expresó en todo el sistema nervioso de C. elegans desde el desarrollo durante el envejecimiento. Aquí, HTT-D2 contenía el estiramiento fisiológico de 25 poliglutaminas (HTTQ25-D2, Figura 1

Discusión

Para comprender la función de una proteína es importante entender su síntesis, ubicación y degradación. Con el desarrollo de FPs novedosos, estables y brillantes, la visualización y supervisión de los PDI se ha vuelto más fácil y eficiente. Los PAFP de fusión expresada genéticamente, como Dendra2, están en una posición única para estudiar la estabilidad de un PDI. Tras la exposición a la luz púrpura-azul, Dendra2 se rompe en un lugar preciso dentro de una tríada de aminoácidos conservados. El fluorófor...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software