В Vivo Квантификация оборота белка в старении C. Elegans с помощью фотоотвержима Dendra2

Резюме

Представлено здесь протокол для мониторинга деградации белка hunttin сливается с фотоконвертируемой фторфор Dendra2.

Аннотация

Белки синтезируются и деградируют постоянно в клетке для поддержания гомеостаза. Возможность контролировать деградацию интересующего белка является ключом к пониманию не только его жизненного цикла, но и выявлению дисбалансов в протеостазной сети. Этот метод показывает, как отслеживать деградацию болезнетворного белка хантитина. В нервной системе C. elegans выражены две версии хантингтина, слитого с Dendra2: физиологическая версия или версия с расширенным и патогенным участком глутамина. Dendra2 является фотоконвертируемым флуоресцентным белком; при коротком ультрафиолетовом (УФ) импульсе облучения, Dendra2 переключает свои спектры возбуждения/излучения с зеленого на красный. Подобно эксперименту пульс-погони, оборот преобразованного красно-dendra2 можно контролировать и количественно, независимо от вмешательства от вновь синтезированных зеленый-Dendra2. Используя конфокальную микроскопию и благодаря оптической прозрачности C. elegans,можно отслеживать и количественно оценить деградацию хантитина-Дендры2 в живом стареющем организме. Нейронная охота-дендра2 частично деградирует вскоре после преобразования и очищается дальше с течением времени. Системы, контролирующие деградацию, испытывают дефицит в присутствии мутантов-хантитинов и еще больше нарушаются со старением. Нейронные подтипы в одной и той же нервной системе обладают различными оборотными возможностями для охоты-дендры2. В целом, мониторинг любого интересующего протеина, слитого с Dendra2, может предоставить важную информацию не только о его деградации и игроках сети протеостаза, но и о ее местонахождении, торговле людьми и транспорте.

Введение

Протеом живого организма постоянно обновляется. Белки постоянно деградируют и синтезируются в соответствии с физиологическим спросом клетки. Некоторые белки быстро устраняются, в то время как другие дольше живут. Мониторинг динамики белка является более простой, более точной и менее инвазивной задачей при использовании генетически закодированных флуоресцентных белков (FPs). FPs образуют аутокаталитически и могут быть слиты с любым интересующим белком (POI), но не требуют ферментов, чтобы сложить или нужно кофакторы за исключением кислорода^1. Новое поколение FPs недавно было разработано, чтобы переключить цвет при облучении с легким импульсом определенной длины волны. Эти фотоактивируемые FPs (PAFPs) позволяют маркировать и отслеживать POI, или органеллы или клетки они reside в, и рассмотреть их количественные и/или качественные параметры². FPs позволяют отслеживать любое движение POI, направленность, скорость передвижения, коэффициент диффузии, мобильные и неподвижные фракции, время, которое он находится в одном сотовом отсеке, а также скорость его оборота. Для конкретных органелл, передвижения и транспорта, или деления и слияния события могут быть определены. Для определенного типа ячейки может быть установлено положение ячейки, скорость деления, объема и формы. Важно, что использование PAFPs позволяет отслеживать без непрерывной визуализации и без вмешательства со стороны любого недавно синтезированного зонда. Исследования как в клетках, так и в целом организмов успешно использовали PAFPs для решения биологических вопросов in vivo, таких как развитие рака и метастазов, сборка или разборка цитоскелета, и РНК-ДНК / белковых взаимодействий³. В этой рукописи, свет микроскопии и PAFPs используются для выявления оборота скорости агрегации подверженных белка hunttin (HTT) in vivo в C. elegans модели нейродегенеративных заболеваний.

Протокол, описанный здесь, количественно определяет стабильность и деградацию синтеза белка Hunttin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 является вторым поколением мономерных PAFP^4, что необратимо переключает его выбросов / возбуждения спектра от зеленого до красного в ответ на уф или видимый синий свет, с увеличением его интенсивности до 4000 раз^5,6. Хантингтин является белок, ответственный за причинение болезни Гентингтона (HD), смертельное наследственное нейродегенеративное расстройство. Huntingtin exon-1 содержит участок глутаминов (CAG, No). Когда белок выражается с более чем 39 ", он misfolds в мутант, токсичных и патогенных белков. Мутант HTT склонен к агрегации и приводит к смерти нейронных клеток и дегенерации, либо как короткие олигомерные виды или как большие высоко структурированные амилоиды⁷.

Нематод является модельной системой для изучения старения и нейродегенерации благодаря своей легкости манипуляции, изогенный характер, короткий срок службы, и его оптической прозрачности⁸. Для изучения стабильности HTT in vivo, конструкция синтеза была выражена в нервной системе C. elegans. HTT-D2 трансген, содержащий либо физиологический участок 25 "s (HTT-25-D2) или патологический участок 97"(HTT-97-D2) является overexpressed пан-нейронально на протяжении всей жизни нематода⁹. Путем подвергать в реальном маштабе времени C. elegans к краткой и сфокусированной точке света, одиночный нейрон photoswitched и преобразованный HTT-D2 отслеживается над временем. Чтобы установить, сколько HTT-D2 деградировало, разница между красным сигналом недавно преобразованного HTT-D2 сопоставлена с оставшимся красным сигналом HTT-D2 после определенного периода времени. Таким образом, становится возможным исследовать, как хантин деградирует, когда находится в его расширенной и токсичной форме по сравнению с его физиологической формой; как передние или задние нейроны по-разному реагируют на наличие No97 против 25 евро, особенно в течение длительных периодов времени; и как крах протеостазной сети (PN) во время старения способствует различиям в темпах деградации. Эти результаты описывают лишь небольшой набор наблюдений по обороту HTT-D2. Тем не менее, многие другие биологические вопросы, имеющие отношение как к области агрегации белка и протеостаза могут быть решены с этим in vivo применения.

протокол

1. Поколение C. elegans, выражающих нейрональный синтез Ханттин-Дендра2

1. Клон гена кодирования POI в векторе нематодного выражения (т.е., pPD95_75, Addgene #1494), традиционным ферментом ограничения дайджест¹⁰, Гибсон сборки¹¹, или любой метод выбора. Вставьте промоутер, чтобы управлять выражением в желаемой ткани или на желаемой стадии развития. Вставьте флюорофор Dendra2 либо N- или C-терминально в кадре с POI.
2. Генерировать трансгенные C. elegans, выражаюющие конструкцию синтеза (например, с помощью микроинъекционной конструкции)^12.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида, несущая трансгена, останется экстрахромомальным массивом. Интеграция конструкции не является необходимой, но может быть выполнена при желании¹³. В этом протоколе, C. elegans были микроиндукционные с плазмидой проведения синтеза построить huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) под контролем пан-нейрональных промоутер Prgef-1. Костяк выражения C. elegans был получен от Kreis et al.¹⁴, huntingtin exon 1 с 25 или 97 евро был получен от Juenemann et al.¹⁵, и Dendra2 был получен от Hamer et al.¹⁶.

2. Возраст соответствия и поддержания C. elegans

1. Возраст сопоставивал всех нематод путем синхронизации либо с щелочным гипохлоритным раствором^17, либо с помощью откладывания яиц на 4 ч при 20 градусах Цельсия. Для откладывания яиц, место 10 gravid взрослых на свежесеянных нематод роста средств массовой информации (NGM) пластины и оставить на 4 ч до удаления. Яйца, отложенные в это время, придадут синхронных нематод.
2. Держите экспериментальные C. elegans на нематоде роста средств массовой информации (NGM) пластин посеяны с бактериальным источником пищи E. coli OP50, после стандартных нематод мужства¹⁸.
3. Выращивайте нематод при 20 градусах Цельсия до нужной стадии. Для этого протокола, необходимые возраст дни 4 и 10.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые взрослые в день 4 могут быть определены по наличию яиц в их гонады и их высокой подвижности. В возрасте день 10 нематод пост-плодородных, и пройти ухудшение ткани и локомотив снижение¹⁹.
4. В течение дня 10 нематод, проход ежедневно после L4 этапе в день 3, как только нематоды плодородны, чтобы избежать смешанного населения.

3. Подготовка слайдов микроскопии для визуализации

1. Подготовьте слайды микроскопии в день визуализации. В микроволновой печи, расплава общего сорта агарозы в концентрации 3% (w/v) в ddH₂O. Оставьте немного остыть.
2. Отрежьте кончик наконечник пипетки 1 мл и аспирировать примерно 400 мл расплавленной агарозы. Аккуратно поместите несколько капель агарозы на чистую стеклянную горку и сразу же поместите еще один слайд сверху, убедившись, что тонкая подушечка агарозы создается между ними. Дайте высохнуть, прежде чем аккуратно скольжения или подъема верхней соскальзыва.
3. Поместите слайды агарозной площадки в увлажненный контейнер, чтобы предотвратить их высыхание. Они могут быть использованы в пределах 2-3 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования небольших пузырьков в агарозе, так как нематоды могут оказаться в ловушке внутри.

4. Определение параметров конфокального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем устанавливать нематоды и получение данных, определите все настройки программного обеспечения для приобретения confocal. Настройки могут быть адаптированы к аппаратному обеспечению и программному обеспечению для визуализации.

1. Откройте конфокальное программное обеспечение и определите настройки лазерной визуализации. Установите световой путь для возбуждения/выбросов для зеленого Dendra2 на 486-553 нм и для красного Dendra2 на 580-740 нм. Отрегулируйте мощность и увеличение обоих каналов/ лазеров в зависимости от интенсивности фторфора. Не изменяйте цифровой выигрыш или смещения и установите пинхол как полностью открытый.
2. Определите настройку приобретения: выберите последовательный режим канала и переключите трек каждого кадра. Установите режим сканирования в виде кадра, а размер кадра как 1024 x 1024, с ступенькой 1. Установите усреднение до 2, и среднее по среднему методу и режиму однонаправленной линии. Установите глубину бита до 8 битов.
3. Определите параметры многомерных приобретений для преобразования Dendra2. Для преобразования и отбеливания используйте 405-нм диодный лазер, установленный на 60% энергии. При наличии, активировать безопасное отбеливание GaAsP для защиты детекторов.
4. Выберите временные ряды из двух циклов, с интервалом 0,0 мс между ними, и нормальным запуском и остановкой. Начните отбеливание после сканирования 1 из 2 и повторите в течение 30 итераций. Остановить отбеливание, когда интенсивность падает до 50%.
5. Определите скорость захвата/пиксельного жилища так быстро (например, максимальная 12 евро) для преобразования и среднюю скорость (например, средний 5) для захвата изображения привязки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры отбеливания, определенные здесь, являются руководящими принципами. Для других Dendra2 помеченных POI настройки мощности лазера и отбеливания итераций и значений должны быть установлены эмпирически.

5. Установка C. elegans на слайды микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Если это возможно, поместите монтаж стереомикроскоп близко к установке конфокального микроскопа и смонтировать нематоды непосредственно перед изображением.

1. На стеклянной крышке слайд на противоположной стороне агарозной площадки, нарисуйте окно с четырьмя квадратами с постоянным маркером и номер их.
2. Pipette 15 мл левамизола в середине агарозной площадки. Концентрация левамизола будет варьироваться в зависимости от возраста нематода: при визуализации день 4 нематод использовать 2 мМ левамизол; при визуализации день 10 нематод использовать 0,5 мМ левамизола.
3. Передача четырех нематод в жидкость с помощью проволоки забрать. С помощью ресниц, осторожно переместить каждого отдельного нематода на оконный квадрат. Сворачивайте ресницы так, чтобы любой след E. coli OP50 разбавлялся и ее флуоресцентный фон не мешал получению сигнала.
4. Подождите, пока нематоды почти перестанут двигаться и аккуратно поместите крышку скольжения поверх жидкости, чтобы обездвижить нематод в слое левамизола между агарозной площадкой и крышкой скольжения.
5. Поместите перевернутый слайд на конфокальной сцене, чтобы с изображением нематод.

6. Преобразование зеленого Dendra2: Приобретение данных на нулевом времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты по пульс-погоне начинаются с необратимого преобразования белка синтеза Dendra2 из зеленого испускающего фторфора в красный.

1. Используя окуляр микроскопа, найдите первый нематод с 20-й целью под зеленой флуоресценцией. Сосредоточьтесь на голове или хвосте и переключитесь в конфокальный режим.
2. Начните живое лазерное сканирование с помощью 488 нм синего лазера, чтобы визуализировать зеленый Dendra2 в зеленом канале EGFP (ex/em 486-553 nm). Выберите один нейрон и привести его в фокус. Увеличьте масштаб в 3x и увеличьте цель лазерного луча^4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите один нейрон на нематод. Каждый нейрон будет представлять собой один образец или точку данных.
3. Найти максимальную проекционную плоскость и, в зависимости от яркости фторфора, увеличить или уменьшить усиления или лазерной мощности для получения насыщенных, но не переэкспонированных изображений, идентифицируемых по индикатору цветового диапазона. Как только это определено, прекратите сканирование.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не облучайте образец слишком долго или слишком много энергии, как возбуждение с видимым синим 488 нм свет может также преобразовать Dendra2, хотя медленно и менее эффективно⁴.
4. В программном обеспечении откройте вкладку, чтобы выбрать интересующие регионы (ROI) и нарисуйте первый рентабельность инвестиций вокруг выбранного нейрона. Определите большую вторую область интересов, охватывающую голову нематода и включая первую рентабельность инвестиций.
5. В условиях отбеливания выберите первый рентабельность инвестиций, который будет приобретен, обесцвечен и проанализирован. Выберите второй рентабельность инвестиций, который будет приобретен и проанализирован, но не обесцвечен.
6. Установите скорость сканирования до максимума (т.е. быстрое пиксельное жилище) и начните эксперимент по преобразованию выбранных нейронов Dendra2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как только эксперимент будет завершен, приобретенная картинка приведет к двум изображениям: одному до и одному после преобразования. Для зеленого канала, первое изображение должно иметь более высокий зеленый сигнал, который уменьшается во втором изображении из-за преобразования зеленого Dendra2. Для красного канала первое изображение должно быть отрицательным и не показывать сигнала, а красный сигнал отображается на изображении после преобразования. Если зеленый сигнал не уменьшается, преобразование не произошло, и настройки, такие как 405 лазерной мощности или количество итераций, должны быть изменены. Если есть красный сигнал на первом изображении, то 488 нм лазерная мощность используется была слишком высока, и часть зеленого Dendra2 уже преобразуется в красный. В этом случае следует выбрать новый нейрон/нематод.
7. Сразу же после преобразования, начать живое сканирование с зеленым 561 нм лазера для визуализации Dendra2 в красном канале (ex/em 580-740 нм). Найти фокус и соответствующую максимальную проекцию преобразованного нейрона с помощью индикатора цвета диапазона, чтобы избежать передержки.
8. Быстро установите скорость сканирования до более низкой скорости пиксельного жилища (например, 5x) и приобретите моментальное изображение обоих каналов с более высоким разрешением. Это изображение определяется как точка времени ноль (T0) после преобразования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость приобретения для переделанного изображения может быть различной. Однако, как только выбрано, эта скорость должна оставаться постоянной на протяжении всего сбора данных.
9. Сохранить сканирование с идентифицируемым именем и/или номером, за которым следует метка времени нулевой (T0).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется также сохранить изображение эксперимента преобразования (шаг 6.6), чтобы проиллюстрировать отсутствие красного сигнала перед преобразованием и его появление впоследствии.

7. Изображение преобразованного красного Dendra2 для получения данных в выбранной точке второго времени

1. Чтобы отслеживать деградацию Dendra2 с течением времени, определите второй пункт времени, чтобы обрамить того же нематода/нейрона. Выберите вторую точку времени экспериментально для решения любого соответствующего биологического вопроса. Для протокола, описанного здесь, Dendra2 изображен как на 2 ч (T2) и 24 ч (T24) после преобразования.
   1. В выбранной точке времени, найти тот же нематод / нейрон с использованием окуляра и красной флуоресценции.
   2. Откройте изображение T0 соответствующего нематода/нейрона и перезагрузите/повторное использование настроек изображения. Убедитесь, что параметры приобретения снимка точно такие же при получении изображений T0, T2 и T24 h.
   3. Сканирование жить в красном канале, принести преобразованный красный нейрон в фокус. Поскольку красный Dendra2 деградирует с течением времени, индикатор диапазона покажет менее интенсивную максимальную проекцию. Не меняйте параметры приобретения и получите снимок с той же скоростью (например, 5x), что и первое изображение.
2. Чтобы отслеживать деградацию Dendra2 после 4 ч или дольше, спасти нематод после преобразования.
   1. Удалите слайд из микроскопа сразу после преобразования и изображения четырех нематод. Аккуратно снимите крышку и с помощью проволочного кирки поднимите каждый нематод с агарозной площадки.
   2. Поместите каждый нематод индивидуально на соответствующую маркированную и идентифицируемую пластину NGM.
   3. Во второй раз, смонтировать нематод снова на свежий агарозной площадке и приступить к изображению преобразованы красный Dendra2 следующие инструкции в разделе 6.

8. Анализ изображений преобразованных Dendra2

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ деградации Dendra2 осуществляется с помощью программного обеспечения Фиджи/ImageJ²⁰.

1. Откройте Фиджи и перетащите и падение файла .lsm в бар Фиджи. Откройте изображение T0, сделанное сразу после преобразования, и изображение того же нематода, сделанное в выбранной точке времени после преобразования (T2 или T24 h).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для отслеживания деградации интересующего протеина, слитого с Dendra2, необходимо проанализировать только красный канал.
2. Установить параметры измерения из меню: Анализ Набор измерений. Выберите функции области и интегрированной плотности.
3. Выберите изображение, полученное с помощью красного канала. Выберите инструмент выбора полигона из бара Фиджи.
4. Определите преобразованный нейрон на изображении T0 и нарисуйте рентабельность инвестиций вокруг него с помощью инструмента выбора.
   1. Чтобы правильно определить контуры нейрона, выделите пороговые значения интенсивности, выбрав из бара Изображение Отрегулируйте Порог. Перетащите курсор бара, чтобы разграничить порог и отслеживать вокруг этой области с помощью инструмента полигона. Для генерации точной рентабельности инвестиций можно также использовать контур выбранного нейрона из зеленого канала.
5. После того, как выбор был сделан в окне красного канала, нажмите Анализ Мера. Появится всплывающее окно с именем Результаты, включанное значения рентабельности инвестицийдля Area, IntDenи RawIntDen.
6. Выполните тот же процесс отбора и измерения для изображения второй точки времени (T2 или T24 h).
7. Копировать полученные значения в программное обеспечение электронной таблицы, заботясь, чтобы надлежащим образом записывать значения на T0 после преобразования, и на T2 или T24 ч после преобразования.

9. Расчет соотношения деградации Dendra2

1. Для расчета соотношения деградации сначала назначить значение 1 (или 100%) время деградации от момента до нуля (т.е. сразу после преобразования, когда все красные Dendra2 преобразованы все еще присутствует). Это является результатом деления значения IntRawDen T0 само по себе.
2. Для расчета уменьшения красного сигнала интенсивности Dendra2 с течением времени и деградации разделите значение RawIntDen второй точки времени (например, T2 или T24 h) по значению RawIntDen T0. Полученное число должно быть меньше 1. Эти значения также могут быть выражены в процентах, определяя T0 как 100%.
3. Повторите раздел 7 для каждого нематода преобразуется. Для графического представления деградации Dendra2 наметьте участок рассеяния или штрих-график с процентными или коэффициентными значениями уменьшения флуоресценции, полученными в оси y. Примените любой желаемый статистический анализ и проиллюстрируйте его на графике.

Результаты

Два штамма нематод, выражающих фрагмент белка охотничьих экзон-1 в кадре с фотоопровержимым белком Dendra2, были получены с помощью микроинъекции, а плазмиды хранились как экстрахромосомный массив. Конструкция синтеза была выражена во всей нервной системе C. elegans от р...

Обсуждение

Чтобы понять функцию белка, важно понимать его синтез, расположение и деградацию. С развитием новых, стабильных и ярких FPs, визуализация и мониторинг POI стала проще и эффективнее. Генетически выраженный фьюжн PAFPs, такие как Dendra2, имеют уникальную возможность изучить стабильность POI. При во...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software