In Vivo Quantificação do Volume de Negócios de Proteínas no Envelhecimento C. Elegans usando Dendra2 Fotoconvertível

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para monitorar a degradação da proteína huntingtin fundida ao fluorohore fotoconvertível Dendra2.

Resumo

As proteínas são sintetizadas e degradadas constantemente dentro de uma célula para manter a homeostase. Ser capaz de monitorar a degradação de uma proteína de interesse é fundamental para entender não apenas seu ciclo de vida, mas também para descobrir desequilíbrios na rede de proteostase. Este método mostra como rastrear a degradação da inseção de proteínas causadoras de doenças. Duas versões de huntingtin fundidas a Dendra2 são expressas no sistema nervoso C. elegans: uma versão fisiológica ou uma com um trecho expandido e patogênico de glutaminas. Dendra2 é uma proteína fluorescente fotoconvertível; após um pulso de irradiação ultravioleta curto (UV), o Dendra2 muda seu espectro de excitação/emissão de verde para vermelho. Semelhante a um experimento de perseguição de pulso, o volume de negócios do Convertido red-Dendra2 pode ser monitorado e quantificado, independentemente da interferência do recém-sintetizado green-Dendra2. Utilizando microscopia baseada em confocal e devido à transparência óptica de C. elegans,é possível monitorar e quantificar a degradação da huntingtin-Dendra2 em um organismo vivo e envelhecido. A caça neuronaltin-Dendra2 é parcialmente degradada logo após a conversão e liberada mais ao longo do tempo. Os sistemas que controlam a degradação são deficientes na presença de caça mutante e são ainda mais prejudicados com o envelhecimento. Subtipos neuronais dentro do mesmo sistema nervoso apresentam diferentes capacidades de rotatividade para huntingtin-Dendra2. No geral, o monitoramento de qualquer proteína de interesse fundida à Dendra2 pode fornecer informações importantes não apenas sobre sua degradação e os atores da rede de proteostase envolvida, mas também sobre sua localização, tráfico e transporte.

Introdução

O proteome de um organismo vivo está constantemente se renovando. As proteínas são continuamente degradadas e sintetizadas de acordo com a demanda fisiológica de uma célula. Algumas proteínas são rapidamente eliminadas, enquanto outras são mais vividas. Monitorar a dinâmica proteica é uma tarefa mais simples, mais precisa e menos invasiva ao usar proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (FPs). Os FPs formam-se autocatalyticamente e podem ser fundidos a qualquer proteína de interesse (POI), mas não requerem enzimas para dobrar ou precisam de cofatores para economizar oxigênio¹. Uma nova geração de FPs foi recentemente projetada para mudar de cor após a irradiação com um pulso leve de determinado comprimento de onda. Esses FPs fotoativados (PAFPs) permitem a rotulagem e rastreamento de POIs, ou as organelas ou células em que residem, e examinar seus parâmetros quantitativos e/ou qualitativos². Os FPs possibilitam rastrear qualquer movimento, direcionalidade, taxa de locomoção, coeficiente de difusão, frações móveis versus imóveis, o tempo em que reside em um compartimento celular, bem como sua taxa de rotatividade. Para organelas específicas, podem ser determinadas atividades de locomoção e transporte, ou eventos de fissão e fusão. Para um determinado tipo de célula, a posição de uma célula, a taxa de divisão, o volume e a forma podem ser estabelecidos. Crucialmente, o uso de PAFPs permite o rastreamento sem visualização contínua e sem interferência de qualquer sonda recém-sintetizada. Estudos tanto em células quanto em organismos inteiros têm utilizado com sucesso PAFPs para abordar questões biológicas in vivo, como o desenvolvimento de câncer e metástase, montagem ou desmontagem do citoesqueleto, e interações RNA-DNA/proteína³. Neste manuscrito, microscopia leve e PAFPs são usados para descobrir as taxas de rotatividade da caça de proteínas propensas à agregação (HTT) in vivo em um modelo C. elegans de doença neurodegenerativa.

O protocolo aqui descrito quantifica a estabilidade e a degradação da proteína de fusão huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 é um PAFP⁴ monomédico de segunda geração que muda irreversivelmente seu espectro de emissão/excitação de verde para vermelho em resposta à luz azul UV ou visível, com um aumento em sua intensidade de até 4.000^{vezes 5,6}. Huntingtin é a proteína responsável por causar a doença de Huntington (HD), uma doença neurodegenerativa hereditária fatal. Huntingtin exon-1 contém um trecho de glutaminas (CAG, Q). Quando a proteína é expressa com mais de 39T, ela se dobra em uma proteína mutante, tóxica e patogênica. O HTT mutante é propenso à agregação e leva à morte e degeneração celular neuronal, seja como espécies oligomericas curtas ou como amiloides altamente estruturados⁷.

O nematoide é um sistema modelo para estudar o envelhecimento e a neurodegeneração graças à sua facilidade de manipulação, natureza isogênica, vida útil curta e sua transparência óptica⁸. Para estudar a estabilidade do HTT in vivo, uma construção de fusão foi expressa no sistema nervoso de C. elegans. Um transgene HTT-D2 contendo um trecho fisiológico de 25Qs (HTTQ25-D2) ou um trecho patológico de 97Qs (HTTQ97-D2) é superexpresso pan-neuronalmente durante toda a vida do nematodo⁹. Ao submeter C. elegans ao vivo a um breve e focado ponto de luz, um único neurônio é fotowitched e o HTT-D2 convertido é rastreado ao longo do tempo. Para estabelecer a quantidade de HTT-D2 degradada, a diferença entre o sinal vermelho do HTT-D2 recém-convertido é comparada com o sinal vermelho restante de HTT-D2 após um determinado período de tempo. Portanto, torna-se possível investigar como a cantina é degradada quando encontrada em sua forma expandida e tóxica em comparação com sua forma fisiológica; como os neurônios anteriores ou posteriores respondem de forma diferente à presença do Q97 versus Q25, especialmente em períodos de tempo prolongados; e como o colapso da rede de proteostase (PN) durante o envelhecimento contribui para as diferenças nas taxas de degradação. Estes resultados descrevem apenas um pequeno conjunto de observações sobre o volume de negócios do HTT-D2. No entanto, muitas outras questões biológicas relevantes tanto para o campo da agregação de proteínas quanto para a proteostase podem ser abordadas com essa aplicação in vivo.

Protocolo

1. Geração de C. elegans expressando proteína de fusão Neuronal Huntingtin-Dendra2

1. Clone o gene codificando o POI em um vetor de expressão nematoide (ou seja, pPD95_75, Addgene #1494), pela enzima de restrição tradicional digestão¹⁰, conjunto Gibson¹¹, ou qualquer método de escolha. Insira um promotor para conduzir a expressão em um tecido desejado ou em um estágio de desenvolvimento desejado. Insira o fluoróforo Dendra2 em n ou C-terminalmente na estrutura com o POI.
2. Gerar C. elegans transgênicos expressando o construto de fusão (por exemplo, via microinjeção)¹².
   NOTA: O plasmídeo que carrega o transgene permanecerá como uma matriz extracromosomal. A integração da construção não é necessária, mas pode ser realizada se desejar¹³. Neste protocolo, C. elegans foram microinjetados com um plasmídeo carregando a construção de fusão huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) sob o controle do promotor pan-neuronal Prgef-1. A espinha dorsal da expressão C. elegans foi obtida de Kreis et al.¹⁴, o garon huntingtin 1 com Q25 ou Q97 foi obtido de Juenemann et al.¹⁵, e Dendra2 foi obtido de Hamer et al.¹⁶.

2. Correspondência etária e manutenção de C. elegans

1. A idade corresponde a todos os nematoides sincronizando com o tratamento da solução alcalina hipoclorito¹⁷ ou através de ovo deitado por 4h a 20 °C. Para a colocação de ovos, coloque 10 adultos gravid em uma placa de mídia de crescimento de nematode (NGM) recém-semeada e deixe por 4h antes de remover. Os ovos colocados neste tempo-de-tempo darão origem a nematoides sincronizados.
2. Mantenha c. elegans experimentais em placas de mídia de crescimento de nematoide (NGM) semeadas com a fonte de alimento bacteriano E. coli OP50, seguindo a criação padrão de nematoides¹⁸.
3. Cresça nematoides a 20 °C até o estágio desejado. Para este protocolo, as idades exigidas são dias 4 e 10.
   NOTA: Os adultos jovens no dia 4 podem ser identificados pela presença de ovos em suas gôngas e sua alta mobilidade. Os nematoides do dia 10 são pós-férteis, e sofrem deterioração tecidual e declínio da locomotiva¹⁹.
4. Para o dia 10 nematoides, passagem diária após a etapa L4 no dia 3, uma vez que os nematoides são férteis, para evitar uma população mista.

3. Preparação de slides de microscopia para imagem

1. Prepare os slides de microscopia no dia da imagem. Em um micro-ondas, derreta o grau geral agarose a uma concentração de 3% (w/v) em ddH₂O. Deixe esfriar ligeiramente.
2. Corte a ponta de uma ponta de pipeta de 1 mL e aspire cerca de 400 μL de agarose derretida. Coloque delicadamente algumas gotas de agarose em um escorregador de vidro limpo e coloque imediatamente outro slide em cima, certificando-se de que uma fina almofada de agarose seja criada entre os dois. Deixe secar antes de deslizar suavemente ou levantar a parte superior.
3. Coloque os slides da almofada agarose em um recipiente umidificado para evitar que eles sequem. Estes podem ser usados dentro de 2-3 h.
   NOTA: Evite a formação de pequenas bolhas na ágarose, pois os nematoides podem ficar presos dentro.

4. Definição de parâmetros de microscópio confocal

NOTA: Antes de montar os nematoides e a aquisição de dados, defina todas as configurações do software de aquisição confocal. As configurações podem ser adaptadas ao hardware de imagem e software de escolha.

1. Abra o software confocal e defina as configurações de imagem a laser. Defina o caminho de luz para excitação/emissão para Dendra2 verde em 486-553 nm e para Dendra2 vermelho em 580-740 nm. Ajuste a potência e o ganho de ambos os canais/lasers de acordo com a intensidade do fluoróforo. Não altere o ganho digital ou deslocamento e coloque o pinhole totalmente aberto.
2. Defina a configuração de aquisição: selecione um modo de canal sequencial e alterne cada quadro. Defina o modo de varredura como quadro, e o tamanho do quadro como 1.024 x 1.024, com um passo de linha de 1. Defina a média para 2, e média por método médio e modo de linha unidirecional. Ajuste a profundidade da broca para 8 bits.
3. Defina as configurações de aquisições multidimensionais para a conversão de Dendra2. Para conversão e branqueamento use o conjunto de laser de diodo de 405 nm a 60% de energia. Se disponível, ative o GaAsP de branqueamento seguro para proteger os detectores.
4. Selecione uma série temporal de dois ciclos, com um intervalo de 0,0 ms no meio, e início e parada normais. Comece a branquear após a varredura 1 de 2 e repita para 30 iterações. Pare de branquear quando a intensidade cair para 50%.
5. Defina a velocidade de aquisição/pixel como rápida (por exemplo, máxima = 12) para conversão e velocidade média (por exemplo, média = 5) para capturar uma imagem snap.
   NOTA: Os parâmetros de branqueamento definidos aqui são as diretrizes. Para outros POIs marcados por Dendra2, as configurações de energia a laser e as iterações e valores branqueados devem ser estabelecidos empiricamente.

5. Montagem de C. elegans em slides de microscopia

NOTA: Se possível, coloque um estereótipo de montagem perto da configuração do microscópio confocal e monte os nematoides pouco antes da imagem.

1. No deslizamento de tampa de vidro no lado oposto da almofada de agarose, desenhe uma janela com quatro quadrados com um marcador permanente e numera-os.
2. Pipeta 15 μL de levamisole no meio da almofada agarose. A concentração de levamisole vai variar de acordo com a idade do nematoide: Quando a imagem dia 4 nematoides usarem levamisole de 2 mM; quando a imagem dia 10 nematoides usam 0,5 mM levamisole.
3. Transfira quatro nematoides para o líquido usando uma picareta de arame. Com a ajuda de uma picareta de cílios, mova suavemente cada nematoide individual para um quadrado da janela. Gire o cílio para que qualquer traço de E. coli OP50 seja diluído e seu fundo fluorescente não interfira na aquisição de sinal.
4. Espere que os nematoides quase parem de se mover e coloque suavemente um deslizamento de cobertura em cima do líquido para imobilizar os nematoides na camada de levamisole entre a almofada de agarose e o deslizamento de cobertura.
5. Coloque o slide invertido no estágio confocal para a imagem dos nematoides.

6. Conversão de Dendra2 verde: Aquisição de dados no momento zero

NOTA: Os experimentos de perseguição de pulso começam convertendo irreversivelmente a proteína de fusão Dendra2 de um fluoróforo emissor verde para um vermelho.

1. Usando a ocular do microscópio, localize o primeiro nematoides com um objetivo de 20x sob fluorescência verde. Concentre-se na cabeça ou na cauda e mude para o modo confocal.
2. Inicie a varredura a laser ao vivo com o laser azul de 488 nm para visualizar o Dendra2 verde no canal verde EGFP (ex/em = 486-553 nm). Selecione um único neurônio e o deixe em foco. Amplie em 3x e aumente a meta do raio laser⁴.
   NOTA: Selecione um neurônio por nematoide. Cada neurônio constituirá uma amostra ou ponto de dados.
3. Encontre o plano de projeção máxima e, de acordo com o brilho do fluoróforo, aumente ou diminua o ganho ou a potência do laser para obter uma imagem saturada, mas não superexposta identificável pelo indicador de faixa de cor. Uma vez que isso seja definido, pare a varredura.
   NOTA: Não irradie a amostra por muito tempo ou com muita potência, pois a excitação com luz azul visível de 488 nm também pode converter Dendra2, embora lentamente e menos^{eficientemente 4}.
4. No software, abra a guia para selecionar as regiões de interesse (ROIs) e desenhar um primeiro ROI em torno do neurônio selecionado. Defina uma segunda região maior de interesse abrangendo a cabeça do nematoide e incluindo o primeiro ROI.
5. Nas configurações de branqueamento, selecione para que o primeiro ROI seja adquirido, branqueado e analisado. Selecione para o segundo ROI a ser adquirido e analisado, mas não branqueado.
6. Defina a velocidade da varredura ao máximo (ou seja, ponto de pixel rápido) e inicie o experimento para converter os neurônios Dendra2 selecionados.
   NOTA: Uma vez feito o experimento, a imagem adquirida resultará em duas imagens: uma antes e outra após a conversão. Para o canal verde, a primeira imagem deve ter um sinal verde maior que diminui na segunda imagem devido à conversão do Dendra2 verde. Para o canal vermelho, a primeira imagem deve ser negativa e não mostrar nenhum sinal, com um sinal vermelho aparecendo na imagem após a conversão. Se o sinal verde não diminuir, a conversão não ocorreu, e as configurações, como a potência laser 405 ou o número de iterações, devem ser modificadas. Se há um sinal vermelho na primeira imagem, então a potência laser de 488 nm usada era muito alta e uma parte do Dendra2 verde já foi convertida em vermelha. Neste caso, deve ser selecionado um novo neurônio/nematoide.
7. Imediatamente após a conversão, comece a digitalizar ao vivo com o laser verde de 561 nm para visualizar Dendra2 no canal vermelho (ex/em = 580-740 nm). Encontre o foco e a respectiva projeção máxima do neurônio convertido usando o indicador de cor de faixa para evitar a superexposição.
8. Defina rapidamente a taxa de varredura para uma velocidade de moradia de pixels mais baixa (por exemplo, 5x) e adquira uma imagem instantânea de ambos os canais em uma resolução mais alta. Esta imagem é definida como ponto de tempo zero (T0) após a conversão.
   NOTA: A velocidade de aquisição da imagem convertida pode ser variada. No entanto, uma vez escolhida, essa velocidade precisa permanecer constante durante toda a coleta de dados.
9. Salve a varredura com um nome e/ou número identificáveis, seguido pelo rótulo time zero (T0).
   NOTA: É aconselhável também salvar a imagem do experimento de conversão (etapa 6.6) para ilustrar a falta de sinal vermelho antes da conversão e sua aparência posteriormente.

7. Imagem de Dendra2 vermelho convertido para aquisição de dados em um ponto de segunda tempo selecionado

1. Para rastrear a degradação de Dendra2 ao longo do tempo, defina um segundo ponto de tempo para reimagem o mesmo nematode/neurônio. Selecione o segundo ponto de tempo experimentalmente para abordar qualquer questão biológica relevante. Para o protocolo descrito aqui, Dendra2 é imaged tanto a 2 h (T2) quanto 24 h (T24) pós-conversão.
   1. No ponto de tempo selecionado, encontre o mesmo nematodo/neurônio com o uso da ocular e fluorescência vermelha.
   2. Abra a imagem T0 do respectivo nematode/neurônio e recarregue/reuuse as configurações da imagem. Certifique-se de que as configurações de aquisição do snapshot são precisamente as mesmas ao adquirir as imagens T0, T2 e T24 h.
   3. Escaneando ao vivo no canal vermelho, trazer o neurônio vermelho convertido em foco. Como o Dendra2 vermelho degrada com o tempo o indicador de faixa mostrará uma projeção máxima menos intensa. Não altere nenhum parâmetro de aquisição e obtenha um instantâneo na mesma velocidade (por exemplo, 5x) como a primeira imagem.
2. Para acompanhar a degradação de Dendra2 após 4h ou mais, resgate os nematoides após a conversão.
   1. Remova o slide do microscópio imediatamente após a conversão e imagem dos quatro nematoides. Remova suavemente a tampa e com o uso de uma picareta de arame, levante cada nematoide da almofada agarose.
   2. Coloque cada nematoide individualmente em uma placa NGM devidamente rotulada e identificável.
   3. Para o segundo ponto, monte o nematoide novamente em uma nova almofada de agarose e prossiga com a imagem do Dendra2 vermelho convertido seguindo as instruções na seção 6.

8. Análise de imagem do Dendra2 convertido

NOTA: A análise da degradação do Dendra2 é realizada com o software Fiji/ImageJ²⁰.

1. Abra Fiji e arraste e solte o arquivo .lsm na barra de Fiji. Abra a imagem T0 tirada logo após a conversão e a imagem do mesmo nematoide tirada no ponto de tempo selecionado após a conversão (T2 ou T24 h).
   NOTA: Para acompanhar a degradação da proteína de interesse fundida ao Dendra2 apenas o canal vermelho precisa ser analisado.
2. Estabeleça os parâmetros de medição a partir do menu: Analisar | Medidas de conjunto. Selecione as funções Área e Densidade Integrada.
3. Selecione a imagem obtida com o canal vermelho. Selecione a Ferramenta de Seleção de Polígono na barra de Fiji.
4. Identifique o neurônio convertido na imagem T0 e desenhe um ROI ao seu redor usando a ferramenta de seleção.
   1. Para identificar corretamente os contornos do neurônio, destaque os limiares de intensidade selecionando na barra Imagem | Ajuste | Limiar. Arraste o cursor da barra para delinear o limiar e rastreie ao redor desta área com a ferramenta polígono. Para gerar um ROI preciso, também é possível usar o contorno do neurônio selecionado a partir do canal verde.
5. Uma vez que a seleção tenha sido feita na janela do canal vermelho, pressione Analisar | Medida. Uma janela pop-up chamada Results aparecerá e incluirá os valores de ROI para Area, IntDene RawIntDen.
6. Realize o mesmo processo de seleção e medição para a imagem do segundo ponto de tempo (T2 ou T24 h).
7. Copie os valores obtidos em um software de planilha, tomando o cuidado de registrar adequadamente os valores em T0 após a conversão, e em T2 ou T24 h após a conversão.

9. Calculando a razão da degradação de Dendra2

1. Para calcular a razão de degradação, primeiro atribua um valor de 1 (ou 100%) até o momento a degradação do ponto zero do tempo (ou seja, logo após a conversão, quando todo o Dendra2 vermelho convertido ainda está presente). Isso resulta da divisão do valor de IntRawDen de T0 por si só.
2. Para calcular a redução do sinal de intensidade de Dendra2 vermelho ao longo do tempo, e a degradação, divida o valor de RawIntDen do segundo ponto de tempo (por exemplo, T2 ou T24 h) pelo valor do RawIntDen de T0. O número resultante deve ser inferior a 1. Esses valores também podem ser expressos em percentuais, definindo T0 como 100%.
3. Repita a seção 7 para cada nematoide convertido. Para uma representação gráfica da degradação de Dendra2, mapeie um gráfico de gráfico de dispersão ou barra com os valores percentuais ou de razão de diminuição da fluorescência obtidos no eixo y. Aplique qualquer análise estatística desejada e ilustre-a no gráfico.

Resultados

Duas cepas de nematoides expressando o fragmento de proteína de 5on-1 de huntingtina em quadro com a proteína fotoconvertível Dendra2 foram obtidas via microinjeção e os plasmídeos foram mantidos como uma matriz extracromosomal. A construção de fusão foi expressa em todo o sistema nervoso C. elegans a partir do desenvolvimento ao longo do envelhecimento. Aqui, o HTT-D2 continha o estiramento fisiológico de 25 poliglutamina (HTTQ25-D2, Figura 1

Discussão

Para compreender a função de uma proteína é importante entender sua síntese, localização e degradação. Com o desenvolvimento de FPs novos, estáveis e brilhantes, visualizar e monitorar POIs tornou-se mais fácil e eficiente. PAFPs de fusão geneticamente expressos como o Dendra2 estão posicionados exclusivamente para estudar a estabilidade de um POI. Após a exposição à luz azul-roxa, Dendra2 quebra em um local preciso dentro de uma tríade de aminoácidos conservados. O fluoróforo sofre uma pequena mudan?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software