Quantificazione in vivo del fatturato proteico nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Dendra2 fotoconvertibile

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per monitorare la degradazione della proteina huntingtina fusa al fluoroforo fotoconvertibile Dendra2.

Abstract

Le proteine sono sintetizzate e degradate costantemente all'interno di una cellula per mantenere l'omeostasi. Essere in grado di monitorare la degradazione di una proteina di interesse è fondamentale per comprendere non solo il suo ciclo di vita, ma anche per scoprire gli squilibri nella rete proteostasi. Questo metodo mostra come monitorare la degradazione della proteina huntingtina che causa la malattia. Due versioni di huntingtina fusa a Dendra2 sono espresse nel sistema nervoso C. elegans: una versione fisiologica o una con un tratto espanso e patogeno di glutammine. Dendra2 è una proteina fluorescente fotoconvertibile; su un breve impulso ultravioletto di irradiazione (UV), Dendra2 commuta i suoi spettri di eccitazione/emissione dal verde al rosso. Simile a un esperimento di pulse-chase, il turnover del red-Dendra2 convertito può essere monitorato e quantificato, indipendentemente dall'interferenza da nuovo sintetizzato verde-Dendra2. Utilizzando la microscopia a base confocale e grazie alla trasparenza ottica di C. elegans,è possibile monitorare e quantificare la degradazione della huntingtina-Dendra2 in un organismo vivente e invecchiato. La huntingtina-Dendra2 neuronale è parzialmente degradata subito dopo la conversione e cancellata ulteriormente nel tempo. I sistemi che controllano la degradazione sono carenti in presenza di huntingtina mutata e sono ulteriormente compromessa dall'invecchiamento. I sottotipi neuronali all'interno dello stesso sistema nervoso presentano diverse capacità di turnover per huntingtina-Dendra2. Nel complesso, il monitoraggio di qualsiasi proteina di interesse fusa in Dendra2 può fornire informazioni importanti non solo sul suo degrado e sugli attori della rete proteostasis coinvolti, ma anche sulla sua posizione, traffico e trasporto.

Introduzione

Il proteoma di un organismo vivente si rinnova costantemente. Le proteine sono continuamente degradate e sintetizzate in base alla domanda fisiologica di una cellula. Alcune proteine vengono rapidamente eliminate, mentre altre sono più vissute. Il monitoraggio delle dinamiche delle proteine è un compito più semplice, più accurato e meno invasivo quando si utilizzano proteine fluorescenti geneticamente codificate (FP). Le FP si formano automaticamente e possono essere fuse in qualsiasi proteina di interesse (POI), ma non richiedono enzimi per piegare o hanno bisogno di cofattori risparmiano per^{l'ossigeno 1}. Una nuova generazione di SP è stata recentemente progettata per cambiare colore all'irradiazione con un impulso luminoso di lunghezza d'onda determinata. Questi FP fotoattivabili (PAFP) consentono l'etichettatura e il tracciamento dei POI, o degli organelli o delle cellule in cui risiedono, e di esaminare i loro parametri quantitativi e/o qualitativi². Gli FP consentono di tracciare qualsiasi movimento, direzionalità, tasso di locomozione, coefficiente di diffusione, frazioni mobili o frazioni immobili, il tempo in cui risiede in un vano cellulare, nonché il suo tasso di avvicendamento. Per organelli specifici, è possibile determinare eventi di fissione e fusione. Per un particolare tipo di cella, è possibile stabilire la posizione di una cella, la velocità di divisione, il volume e la forma. Fondamentalmente, l'uso di PAFP consente il monitoraggio senza visualizzazione continua e senza interferenze da qualsiasi sonda appena sintetizzata. Studi sia nelle cellule che in organismi interi hanno impiegato con successo PAFP per affrontare questioni biologiche in vivo, come lo sviluppo di cancro e metastasi, l'assemblaggio o lo smontaggio del citoscheletro e le interazioni RNA-DNA/proteina³. In questo manoscritto, la microscopia leggera e i PAFP sono utilizzati per scoprire i tassi di rotazione della huntingtina proteica incline all'aggregazione (HTT) in vivo in un modello C. elegans della malattia neurodegenerativa.

Il protocollo qui descritto quantifica la stabilità e la degradazione della proteina di fusione huntingtina-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 è un PAFP⁴ monomerico di seconda generazione che cambia irreversibilmente i suoi spettri di emissione/eccitazione dal verde al rosso in risposta ai raggi UV o alla luce blu visibile, con un aumento della sua intensità fino a 4.000-fold^5,6. L'huntingtina è la proteina responsabile della malattia di Huntington (HD), un disturbo neurodegenerativo ereditario fatale. Huntingtina exon-1 contiene un tratto di glutammine (CAG, Q). Quando la proteina è espressa con oltre 39Q, si trasforma male in una proteina mutante, tossica e patogena. Mutant HTT è incline all'aggregazione e porta alla morte e degenerazione delle cellule neuronali, sia come specie oligomeriche corte o come amiloidi altamente strutturati più grandi^{7 .}

Il nematode è un sistema modello per studiare l'invecchiamento e la neurodegenerazione grazie alla sua facilità di manipolazione, natura isogenica, breve durata di vita e la sua trasparenza ottica⁸. Per studiare la stabilità dell'HTT in vivo, un costrutto di fusione è stato espresso nel sistema nervoso di C. elegans. Un transgene HTT-D2 contenente un tratto fisiologico di 25Q (HTTQ25-D2) o un tratto patologico di 97Q (HTTQ97-D2) è sovraespresso pan-neuronalmente per tutta la durata del nematode⁹. Sottoponendo C. elegans dal vivo a un breve e concentrato punto di luce, un singolo neurone viene commutato foto e l'HTT-D2 convertito viene tracciato nel tempo. Per stabilire la quantità di HTT-D2 degradata, la differenza tra il segnale rosso dell'HTT-D2 appena convertito viene confrontata con il segnale rosso rimanente di HTT-D2 dopo un determinato periodo di tempo. Pertanto, diventa possibile studiare come la huntingtina viene degradata quando si trova nella sua forma espansa e tossica rispetto alla sua forma fisiologica; come i neuroni anteriori o posteriori rispondono in modo diverso alla presenza di Q97 rispetto al Q25, specialmente in periodi di tempo prolungati; e come il collasso della rete proteostasi (PN) durante l'invecchiamento contribuisca alle differenze nei tassi di degradazione. Questi risultati descrivono solo una piccola serie di osservazioni sul fatturato di HTT-D2. Tuttavia, molte altre questioni biologiche rilevanti sia per il campo dell'aggregazione proteica che per la proteostasi possono essere affrontate con questa applicazione in vivo.

Protocollo

1. Generazione di C. elegans che esprimono proteina di fusione neuronale Huntingtina-Dendra2

1. Clonare il gene che codifica il POI in un vettore di espressione nematode (cioè, pPD95_75, Addgene #1494), con l'enzima di restrizione tradizionale digest¹⁰, Gibson assembly^11,o qualsiasi metodo di scelta. Inserire un promotore per guidare l'espressione in un tessuto desiderato o in una fase di sviluppo desiderata. Inserire il fluoroforo Dendra2 N o C nel telaio con il POI.
2. Generare C. elegan transgenici che esprimano il costrutto di fusione (ad esempio, tramite microiniezione)¹².
   NOTA: Il plasmide che trasporta il transgene rimarrà come un array extracromosomico. L'integrazione del costrutto non è necessaria, ma può essere eseguita se lo si desidera¹³. In questo protocollo, C. elegans sono stati microiniettati con un plasmide che trasporta il costrutto di fusione huntingtina exon 1-Dendra2 (HTT-D2) sotto il controllo del promotore pan-neuronale Prgef-1. La spina dorsale di espressione C. elegans è stata ottenuta da Kreis et al.¹⁴, la huntingtina exon 1 con Q25 o Q97 è stata ottenuta da Juenemann et al.¹⁵, e Dendra2 è stato ottenuto da Hamer et al.¹⁶.

2. Corrispondenza dell'età e manutenzione di C. elegans

1. L'età corrisponde a tutti i nematodi sincronizzandosi con il trattamento della soluzione ipoclotorite alcalina¹⁷ o tramite deposizione delle uova per 4 h a 20 gradi centigradi. Per la deposizione delle uova, mettere 10 adulti gravidi su un supporto di crescita nematode appena seminato (NGM) piastra e lasciare per 4 h prima di rimuovere. Le uova deposte in questo lasso di tempo daranno origine a nematodi sincronizzati.
2. Mantenere sperimentale C. elegans su nematode crescita media (NGM) piastre seminato con la fonte di cibo batterico E. coli OP50, seguendo l'allevamento nematode standard¹⁸.
3. Coltivare nematodi a 20 gradi centigradi fino allo stadio desiderato. Per questo protocollo, le età richieste sono giorni 4 e 10.
   NOTA: I giovani adulti al giorno 4 possono essere identificati dalla presenza di uova nelle loro gonadi e dalla loro elevata mobilità. I nematodi invecchiati 10 sono post-fertili e subiscono il deterioramento dei tessuti e il declino della locomotiva¹⁹.
4. Per i nematodi del giorno 10, passaggio giornaliero dopo la fase L4 al giorno 3, una volta che i nematodi sono fertili, per evitare una popolazione mista.

3. Preparazione di vetrini di microscopia per l'imaging

1. Preparare i vetrini di microscopia il giorno dell'imaging. In un forno a microonde, sciogliere l'agarose di grado generale ad una concentrazione del 3% (w/v) in ddH₂O. Lasciare raffreddare leggermente.
2. Tagliare la punta di una punta di pipetta da 1 mL e aspirare circa 400 lofdi di agarose fuse. Posizionare delicatamente alcune gocce di agarose su uno scivolo di vetro pulito e posizionare immediatamente un altro scivolo sulla parte superiore, assicurandosi che si crei un sottile cuscinetto di agarose tra i due. Lasciare asciugare prima di scivolare delicatamente o sollevare il riscivolo superiore.
3. Posizionare i vetrini del cuscinetto agarose in un contenitore umidificato per evitare che si asciughino. Questi possono essere utilizzati entro 2-3 h.
   NOTA: Evitare la formazione di piccole bolle nell'agarose, in quanto i nematodi possono essere intrappolati all'interno.

4. Definizione dei parametri del microscopio confocale

NOTA: prima di montare i nematodi e l'acquisizione dei dati, definire tutte le impostazioni del software di acquisizione confocale. Le impostazioni possono essere adattate all'hardware di imaging e al software di scelta.

1. Aprire il software confocale e definire le impostazioni di imaging laser. Impostare il percorso della luce per l'eccitazione/emissione per dendra2 verde a 486-553 nm e per il rosso Dendra2 a 580-740 nm. Regolare la potenza e il guadagno di entrambi i canali / laser in base all'intensità del fluoroforo. Non modificare il guadagno digitale o offset e impostare il foro stenopeico come completamente aperto.
2. Definire l'impostazione di acquisizione: selezionare una modalità canale sequenziale e passare alla traccia ogni fotogramma. Impostare la modalità di scansione come frame e la dimensione del fotogramma su 1.024 x 1.024, con un passaggio di linea pari a 1. Impostare la media su 2 e il metodo media per media e la modalità di linea unidirezionale. Impostare la profondità di bit su 8 bit.
3. Definire le impostazioni delle acquisizioni multidimensionali per la conversione di Dendra2. Per la conversione e lo sbiancamento utilizzare il set di laser a diodo da 405 nm al 60% di energia energetica. Se disponibile, attivare il GaAsP sbiancante sicuro per proteggere i rilevatori.
4. Selezionare una serie temporale di due cicli, con un intervallo di 0,0 ms compresi tra e inizio e arresto normali. Iniziare lo sbiancamento dopo la scansione 1 di 2 e ripetere per 30 iterazioni. Smettere di sbiancare quando l'intensità scende al 50%.
5. Definire la velocità di acquisizione/dimora dei pixel in modo rapido (ad es. massimo 12) per la conversione e velocità media (ad es., medio 5) per l'acquisizione di un'immagine snap.
   NOTA: i parametri di sbiancamento qui definiti sono linee guida. Per altri POS con tag Dendra2, le impostazioni di alimentazione laser e le iterazioni e i valori di sbiancamento devono essere stabiliti empiricamente.

5. Montaggio di C. elegans su vetrini di microscopia

NOTA: Se possibile, posizionare uno stereomicroscopio di montaggio vicino alla configurazione del microscopio confocale e montare i nematodi appena prima dell'imaging.

1. Sulla vetrina di copertina in vetro sul lato opposto del pad agarose, disegnare una finestra con quattro quadrati con un pennarello permanente e numerati.
2. Pipette 15 - L di levamisole al centro del pad agarose. La concentrazione di levamisole varia a seconda dell'età del nematode: quando si immagina il giorno 4 nematodi utilizzare 2 mM levamisole; quando il giorno di imaging 10 nematodi utilizzano levamisole 0,5 mM.
3. Trasferire quattro nematodi nel liquido utilizzando un plettro filo. Con l'aiuto di un plettro ciglia, spostare delicatamente ogni singolo nematode in un quadrato della finestra. Girare la ciglia in modo che qualsiasi traccia di E. coli OP50 viene diluita e il suo sfondo fluorescente non interferisce con l'acquisizione del segnale.
4. Attendere che i nematodi smettano quasi di muoversi e posizionare delicatamente uno slip di copertura sopra il liquido per immobilizzare i nematodi nello strato di levamisole tra il pad agarose e lo slip di copertura.
5. Posizionare la diapositiva rovesciata sullo stage confocale per immaginare i nematodi.

6. Conversione di Dendra2 verde: Acquisizione dei dati al momento zero

NOTA: Gli esperimenti di pulse-chase iniziano convertendo in modo irreversibile la proteina di fusione Dendra2 da un fluoroforo verde che emette in uno rosso.

1. Utilizzando l'oculare del microscopio, individuare il primo nematode con un obiettivo 20x sotto fluorescenza verde. Concentrarsi sulla testa o sulla coda e passare alla modalità confocale.
2. Avviare la scansione laser dal vivo con il laser blu 488 nm per visualizzare il verde Dendra2 nel canale verde EGFP (es. Selezionare un singolo neurone e metterlo a fuoco. Ingrandire 3x e aumentare la destinazione del raggio laser⁴.
   NOTA: Selezionare un neurone per nematode. Ogni neurone costituirà un campione o un punto dati.
3. Trovare il piano di proiezione massimo e, in base alla luminosità del fluoroforo, aumentare o diminuire il guadagno o la potenza laser per ottenere un'immagine satura ma non sovraesposta identificabile dall'indicatore della gamma di colori. Una volta definito, interrompere la scansione.
   NOTA: Non irradiare il campione per troppo tempo o con troppa potenza, poiché l'eccitazione con luce blu visibile 488 nm può anche convertire Dendra2, anche se lentamente e meno efficiente⁴.
4. Nel software, aprire la scheda per selezionare le aree di interesse (ROI) e disegnare un primo ROI intorno al neurone selezionato. Definire una seconda regione di interesse più grande che comprende la testa del nematode e compreso il primo ROI.
5. Nelle impostazioni di sbiancamento, selezionare per il primo ROI da acquisire, sbiancare e analizzare. Selezionare per il secondo ROI da acquisire e analizzare ma non sbiancare.
6. Impostare la velocità di scansione al massimo (cioè, abitano pixel veloce) e avviare l'esperimento per convertire i neuroni Dendra2 selezionati.
   NOTA: Una volta che l'esperimento è fatto l'immagine acquisita si tradurrà in due immagini: uno prima e uno dopo la conversione. Per il canale verde, la prima immagine dovrebbe avere un segnale verde più alto che diminuisce nella seconda immagine a causa della conversione del Dendra2 verde. Per il canale rosso, la prima immagine deve essere negativa e non deve mostrare alcun segnale, con un segnale rosso che appare nell'immagine post conversione. Se il segnale verde non diminuisce, la conversione non si è verificata e le impostazioni, come la potenza laser 405 o il numero di iterazioni, devono essere modificate. Se c'è un segnale rosso nella prima immagine, allora la potenza laser a 488 nm utilizzata era troppo alta e una parte del Dendra2 verde era già stata convertita in rosso. In questo caso, dovrebbe essere selezionato un nuovo neurone/nematode.
7. Subito dopo la conversione, avviare la scansione in tempo reale con il laser verde 561 nm per visualizzare Dendra2 nel canale rosso (es. Trovare la messa a fuoco e la rispettiva proiezione massima del neurone convertito utilizzando l'indicatore del colore intervallo per evitare la sovraesposizione.
8. Impostare rapidamente la velocità di scansione su una velocità di abitatura inferiore (ad esempio, 5x) e acquisire un'immagine istantanea di entrambi i canali con una risoluzione più alta. Questa immagine è definita come timepoint zero (T0) dopo la conversione.
   NOTA: la velocità di acquisizione dell'immagine convertita può essere variata. Tuttavia, una volta scelto, questa velocità deve rimanere costante per tutta la raccolta dei dati.
9. Salvare la scansione con un nome e/o un numero identificabili, seguito dall'etichetta zero del tempo (T0).
   NOTA: Si consiglia inoltre di salvare l'immagine dell'esperimento di conversione (passaggio 6.6) per illustrare la mancanza di segnale rosso prima della conversione e il suo aspetto in seguito.

7. Imaging del Dendra2 rosso convertito per l'acquisizione dei dati in un secondo momento selezionato

1. Per monitorare la degradazione di Dendra2 nel tempo, definire un secondo punto temporale per ricreare lo stesso nematode/neurone. Selezionare sperimentalmente il secondo timepoint per affrontare qualsiasi questione biologica pertinente. Per il protocollo descritto qui, Dendra2 è immagine sia a 2 h (T2) e 24 h (T24) post conversione.
   1. Al momento selezionato, trovare lo stesso nematode/neurone con l'uso dell'oculare e della fluorescenza rossa.
   2. Aprire l'immagine T0 del rispettivo nematodo/neurone e ricaricare/riutilizzare le impostazioni dell'immagine. Assicurarsi che le impostazioni di acquisizione dell'istantanea siano esattamente le stesse quando si acquisiscono le immagini T0, T2 e T24 h.
   3. Scansione dal vivo nel canale rosso, portare il neurone rosso convertito a fuoco. Poiché il Dendra2 rosso si degrada nel tempo, l'indicatore di intervallo mostrerà una proiezione massima meno intensa. Non modificare i parametri di acquisizione e ottenere un'istantanea alla stessa velocità (ad esempio, 5x) della prima immagine.
2. Per monitorare la degradazione di Dendra2 dopo 4 ore o più, salvare i nematodi dopo la conversione.
   1. Rimuovere il vetrino dal microscopio subito dopo la conversione e l'imaging dei quattro nematodi. Rimuovere delicatamente il coperchio e con l'uso di un plettro di filo, sollevare ogni nematode dal pad agarose.
   2. Posizionare ogni nematode singolarmente su una piastra NGM opportunamente etichettata e identificabile.
   3. Per il secondo punto, montare nuovamente il nematode su un pad agarose fresco e procedere con l'imaging del Dendra2 rosso convertito seguendo le istruzioni nella sezione 6.

8. Analisi dell'immagine di Dendra2 convertito

NOTA: l'analisi della degradazione di Dendra2 viene eseguita con il software Fiji/ImageJ²⁰.

1. Aprire Figi e trascinare il file .lsm nella barra Fiji. Aprire l'immagine T0 scattata subito dopo la conversione e l'immagine dello stesso nematode scattata nel momento selezionato dopo la conversione (T2 o T24 h).
   NOTA: Per monitorare la degradazione della proteina di interesse fusa in Dendra2 solo il canale rosso deve essere analizzato.
2. Stabilire i parametri di misurazione dal menu: Analizzare Imposta misure. Selezionare le funzioni Area e Densità integrata.
3. Selezionare l'immagine ottenuta con il canale rosso. Selezionate lo strumento selezione poligono dalla barra Figi.
4. Identificare il neurone convertito sull'immagine T0 e disegnare un ROI intorno ad esso utilizzando lo strumento di selezione.
   1. Per identificare correttamente i contorni del neurone, evidenziare le soglie di intensità selezionando dalla barra Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Trascinare il cursore a barre per delineare la soglia e tracciare intorno all'area con lo strumento poligono. Per generare un ROI accurato, è anche possibile utilizzare il contorno del neurone selezionato dal canale verde.
5. Una volta effettuata la selezione nella finestra del canale rosso, premere Analizza Misurare. Verrà visualizzata una finestra popup denominata Risultati che includerà i valori ROI per Area, IntDene RawIntDen.
6. Eseguire lo stesso processo di selezione e misurazione per l'immagine del secondo punto temporale (T2 o T24 h).
7. Copiare i valori ottenuti in un software per fogli di calcolo, facendo attenzione a registrare in modo appropriato i valori in T0 dopo la conversione e in T2 o T24 h dopo la conversione.

9. Calcolo del rapporto di degradazione di Dendra2

1. Per calcolare il rapporto di degradazione, assegnare prima un valore di 1 (o 100%) volta la degradazione dal punto zero del tempo (cioè subito dopo la conversione, quando tutto il Rosso Dendra2 convertito è ancora presente). Ciò deriva dalla divisione del valore di IntRawDen di T0 per se stesso.
2. Per calcolare la riduzione del segnale di intensità Dendra2 rosso nel tempo e la degradazione, dividere il valore di RawIntDen del secondo punto temporale (ad esempio, T2 o T24 h) per il valore di RawIntDen di T0. Il numero risultante deve essere minore di 1. Questi valori possono anche essere espressi come percentuali, definendo T0 come 100%.
3. Ripetere la sezione 7 per ogni nematodo convertito. Per una rappresentazione grafica della degradazione di Dendra2, rappresentare graficamente un grafico a dispersione o a barre con i valori percentuali o di rapporto della diminuzione della fluorescenza ottenuti nell'asse y. Applicare qualsiasi analisi statistica desiderata e illustrarla sul grafico.

Risultati

Due ceppi di nematodi che esprimono il frammento di proteina huntingtina esoneso-1 nel telaio con la proteina fotoconvertibile Dendra2 sono stati ottenuti tramite microiniezione e i plasmidi sono stati mantenuti come un array extracromosomico. Il costrutto di fusione è stato espresso in tutto il sistema nervoso C. elegans dallo sviluppo durante l'invecchiamento. In questo caso, hTT-D2 conteneva il tratto fisiologico di 25 poliglutamine (HTTQ25-D2, Figura 1

Discussione

Per comprendere la funzione di una proteina è importante comprenderne la sintesi, la posizione e la degradazione. Con lo sviluppo di FP nuovi, stabili e luminosi, la visualizzazione e il monitoraggio dei POI sono diventati più facili ed efficienti. I PAFP di fusione geneticamente espressi come Dendra2 sono posizionati in modo univoco per studiare la stabilità di un POI. Dopo l'esposizione alla luce viola-blu, Dendra2 si rompe in una posizione precisa all'interno di una triade di aminoacidi conservati. Il fluoroforo su...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software