使用光可转换的登德拉2，在老化的蛋白质周转量中，在体内C.Elegans

摘要

这里介绍的是一个协议，用于监测蛋白质亨廷顿蛋白的降解，该蛋白与光可转换的荧光素Dendra2有关。

摘要

蛋白质在细胞内不断合成和降解，以保持平衡。能够监测感兴趣的蛋白质的降解，不仅是了解其生命周期的关键，也是发现蛋白质组网络中的不平衡的关键。此方法演示如何跟踪致病蛋白亨廷顿蛋白的降解。与Dendra2融合的两种亨廷顿蛋白在C.elegans神经系统中表达:一种是生理版本，另一种是含有扩大和致病性的谷氨酰胺。Dendra2是一种光可转换荧光蛋白;在短的紫外线（UV）辐照脉冲下，Dendra2将其激发/发射光谱从绿色切换为红色。与脉冲追逐实验类似，可以监控和量化转换红-Dendra2的周转率，而不管新合成的 green-Dendra2 的干扰。使用基于共体显微镜的，由于C.elegans的光学透明度，可以监测和量化亨廷顿-Dendra2在活体，老化的生物体的降解。神经元亨廷顿蛋白-Dendra2在转换后很快部分退化，并随着时间的推移进一步清除。控制降解的系统缺乏突变亨廷顿蛋白的存在，并且随着老化而进一步受损。同一神经系统内的神经元亚型表现出不同的转液能力，用于亨廷顿-登德拉2。总体而言，监测与Dendra2融合的任何感兴趣的蛋白质，不仅可以提供重要信息，包括其降解和所涉及的蛋白酶网络的玩家，而且可提供有关其位置、贩运和运输的重要信息。

引言

生物体的蛋白质组在不断更新。蛋白质根据细胞的生理需求不断降解和合成。一些蛋白质很快被消除，而另一些则寿命更长。使用基因编码的荧光蛋白 （FPs） 时，监测蛋白质动力学是一项更简单、更准确、侵入性更小的任务。FPs以自动催化形式形成，可以融合到任何感兴趣的蛋白质（POI），但不需要酶折叠或需要辅助因子，但氧气^1。新一代 FP 最近被设计为在照射时使用确定波长的光脉冲切换颜色。这些光激活的FP（PAFP）允许标记和跟踪POIS，或他们居住的细胞器或细胞，并检查其定量和/或定性参数²。FPs 能够跟踪任何 POI 的移动、方向性、运动速率、扩散系数、移动分数与移动分数、它驻留在一个蜂窝隔间中的时间以及其周转率。对于特定的细胞器，运动和运输，或裂变和融合事件可以确定。对于特定的单元格类型，可以建立单元格的位置、分割速率、体积和形状。至关重要的是，PAFP 的使用允许无需连续可视化，也无需任何新合成探头的干扰即可进行跟踪。细胞和整个生物体的研究已经成功地使用PAFP来解决体内的生物问题，如癌症和转移的发展，细胞骨架的组装或分解，以及RNA-DNA/蛋白质相互作用^3。在这份手稿中，光显微镜和PAFP用于在神经退行性疾病的C.elegans模型中发现体内容易聚集的蛋白质亨廷顿蛋白（HTT）的周转率。

此处描述的协议量化了融合蛋白亨廷顿蛋白（HTT-D2）的稳定性和降解性。Dendra2 是第二代单体 PAFP^4，它不可逆转地将其发射/激发光谱从绿色切换到红色，以响应紫外线或可见蓝光，其强度增加高达 4，000 倍^5，,6。亨廷顿是导致亨廷顿舞蹈症（HD）的蛋白质，这是一种致命的遗传性神经退行性疾病。亨廷顿-1含有一段谷氨酰胺（CAG，Q）。当蛋白质以超过39Q表达时，它误入突变、有毒和致病性蛋白质。突变HTT容易聚集，导致神经元细胞死亡和退化，无论是短寡聚物种或较大的高度结构化淀粉样体^7。

线虫是研究衰老和神经退化的模型系统，由于其操作方便性、等基因性、寿命短和光学透明度^8。为了研究HTT体内的稳定性，在C.elegans的神经系统中表达了一种融合结构。HTT-D2 转基因含有 25Qs （HTTQ25-D2） 或 97Qs （HTTQ97-D2） 的病理拉伸，在整个线虫的生命周期⁹中，泛神经表达过度。通过将实时C. elegans接受简短且聚焦的光点，单个神经元被拍照切换，并随着时间的推移跟踪转换的 HTT-D2。为了确定HTT-D2的降解量，将刚转换的HTT-D2的红色信号与确定一段时间后HTT-D2的剩余红色信号进行比较。因此，与生理形态相比，发现亨廷顿蛋白的膨胀和毒性形式时，可以研究亨廷顿素是如何降解的;前神经元或后神经元对Q97与Q25的存在的反应如何不同，尤其是在较长的时间段内;以及蛋白质组菌网络 （PN） 在老化期间的崩溃如何导致降解率的差异。这些结果只描述了一组关于HTT-D2周转率的少量观测结果。然而，与蛋白质聚集和蛋白质结合领域相关的更多生物学问题可以通过这种体内应用加以解决。

研究方案

1. 表达神经元亨廷顿-登德拉2融合蛋白的C.elegans的一代

1. 通过传统的限制性酶消化^10、吉布森组装¹¹或任何选择方法，克隆线虫表达载体（即pPD95_75、Addgene #1494）中编码POI的基因。插入启动子，在所需的组织中或在所需的发育阶段驱动表达。将 Dendra2 荧光团（N-或C-终端）与POI一起插入框架中。
2. 生成表达聚变构造的转基因C.elegans（例如，通过微注射^）12。
   注:携带转基因质粒将用作染色体外阵列。构造的集成是没有必要的，但如果需要，可以执行¹³。在该协议中，C.elegans被微注入一个质粒携带融合结构亨廷顿1-Dendra2（HTT-D2）在泛神经元促进剂Prgef-1的控制之下。C. elegans表达骨干来自克雷斯等人^14，第25或Q97的亨廷顿1号从Juenemann等人^第15名获得，Dendra2从哈默等人^获得。

2. C. elegans 的年龄匹配和维护

1. 年龄匹配所有线虫，通过同步碱性次氯酸盐溶液^处理17或通过产卵4小时在20°C。对于产卵，将10名成年成人放在新鲜种子线虫生长介质（NGM）板上，在取出前离开4小时。在这个时间跨度下蛋会产生同步线虫。
2. 保持实验C.埃利根在线虫生长介质（NGM）板种子与细菌食物来源大肠杆菌OP50，遵循标准线虫养殖^18。
3. 在20°C下将线虫生长到所需的阶段。对于此协议，所需年龄为第 4 天和 10 天。
   注:第4天的年轻人可以通过他们的性腺中蛋的存在和他们的高流动性来识别。年龄10天线虫是后肥，并经历组织恶化和机车下降^19。
4. 对于第10天线虫，每天经过L4阶段后的第3天，一旦线虫是肥沃的，以避免混合种群。

3. 准备用于成像的显微镜幻灯片

1. 在成像当天准备显微镜幻灯片。在微波炉中，在ddH₂O中以浓度为3%（w/v）的熔融一般品位的阿加糖。让微冷。
2. 切开1 mL移液器尖端，吸气约400μL的融化的藻糖。轻轻地将几滴阿加糖放在干净的玻璃滑梯上，并立即将另一张滑轨放在顶部，确保在两者之间创建细薄的阿加罗斯垫。在轻轻滑动或提起顶部滑轨之前，请晾干。
3. 将加湿容器中的气糖垫滑梯放在，以防止其干燥。这些可以在2-3小时内使用。
   注:避免在红糖中形成小气泡，因为线虫可能被困在里面。

4. 共体显微镜参数的定义

注:在安装线虫和数据采集之前，请定义共和采集软件上的所有设置。这些设置可以适应所需的成像硬件和软件。

1. 打开共和软件并定义激光成像设置。将绿色 Dendra2 的激发/发射光路设置为 486-553 nm，将红色 Dendra2 设置为 580-740 nm。根据荧光团的强度调整两个通道/激光的功率和增益。不要更改数字增益或偏移，将针孔设置为完全打开。
2. 定义采集设置:选择顺序通道模式并切换跟踪每帧。将扫描模式设置为帧，帧大小设置为 1，024 x 1，024，线步数为 1。将平均值设置为 2，按均值方法和单向线模式进行平均。将位深度设置为 8 位。
3. 定义 Dendra2 转换的多维采集设置。对于转换和漂白，请使用 405 nm 二极管激光器，其功率为 60%。如果可用，请激活安全漂白 GaAsP 以保护探测器。
4. 选择两个周期的时间序列，间隔为 0.0 ms，并且正常启动和停止。扫描 1 后开始漂白 2，重复 30 次迭代。当强度降至 50% 时，停止漂白。
5. 定义用于转换的采集/像素停留速度（例如，最大值 = 12）和用于捕获快照图像的中等速度（例如，中等 = 5）。
   注:此处定义的漂白参数是指南。对于其他 Dendra2 标记的 POIS，必须以经验方式建立激光功率设置和漂白迭代和值。

5.将 C. elegans安装到显微镜幻灯片上

注:如果可能，在共声显微镜设置附近放置一个安装式立体显微镜，并在成像前安装线虫。

1. 在阿加罗斯垫对面的玻璃盖幻灯片上，画一个带四个方块的窗口，并加一个永久标记并编号。
2. 在阿加罗斯垫中间的 Levamisole 中移液 15 μL。列维米索的浓度会因线虫的年龄而变化:成像第4天线虫使用2mM列维米索;当成像第 10 天线虫使用 0.5 mM levamisole 时。
3. 使用线挑将四根线虫转移到液体中。在睫毛选择的帮助下，轻轻地将每个线虫移动到窗口广场。旋转睫毛，使大肠杆菌OP50的任何痕迹被稀释，其荧光背景不会干扰信号采集。
4. 等待线虫几乎停止移动，轻轻地将盖滑放在液体顶部，以固定线虫在阿加罗斯垫和盖滑之间的利瓦米索层。
5. 将倒置的幻灯片放在共和舞台上，以成像线虫。

6. 绿色 Dendra2 的转换:时间零时的数据采集

注:脉冲追逐实验从不可逆转地将Dendra2融合蛋白从绿色发射荧光团转化为红色荧光蛋白开始。

1. 使用显微镜的目镜，在绿色荧光下定位具有 20 倍目标的第一个线虫。聚焦头部或尾部，切换到共聚焦模式。
2. 使用 488 nm 蓝色激光开始实时激光扫描，以可视化 EGFP 绿色通道中的绿色 Dendra2（ex/em = 486-553 nm）。选择单个神经元并聚焦它。放大3倍，增加激光束^4的目标。
   注:每个线虫选择一个神经元。每个神经元将构成一个样本或数据点。
3. 查找最大投影平面，根据荧光团的亮度，增加或减少增益或激光功率，以获得颜色范围指示器可识别的饱和且未曝光的图像。定义后，停止扫描。
   注意:不要照射样品太久或功率太大，因为用可见的蓝色488 nm光的激发也可以转换Dendra2，尽管速度缓慢，效率较低^。
4. 在软件中，打开选项卡以选择感兴趣的区域 （ROI），并在所选神经元周围绘制第一个 ROI。定义更大的第二个感兴趣区域，包括线虫的头部，包括第一个 ROI。
5. 在漂白设置中，选择要获取、漂白和分析的第一个 ROI。选择要获取和分析但未漂白的第二个 ROI。
6. 将扫描速度设置为最大值（即快速像素停留），并开始实验以转换选定的 Dendra2 神经元。
   注:实验完成后，获取的图片将产生两个图像:一个在转换前，一个在转换后。对于绿色通道，第一个图像应具有较高的绿色信号，该信号由于绿色 Dendra2 的转换而在第二个图像中减小。对于红色通道，第一个图像应为负数且不显示任何信号，转换后图像中将显示红色信号。如果绿色信号不减小，则未发生转换，应修改设置，如 405 激光功率或迭代次数。如果第一个图像中存在红色信号，则使用的 488 nm 激光功率过高，并且部分绿色 Dendra2 已转换为红色。在这种情况下，应选择新的神经元/线虫。
7. 转换后，立即开始使用绿色 561 nm 激光进行实时扫描，以在红色通道中可视化 Dendra2（ex/em = 580-740 nm）。使用范围颜色指示器查找转换神经元的焦点和相应最大投影，以避免过度曝光。
8. 快速将扫描速率设置为较低的像素停留速度（例如 5 倍），以更高的分辨率获取两个通道的快照图像。此图像定义为转换后的时间点零 （T0）。
   注:转换图像的采集速度可以变化。但是，一旦选择，此速度需要在整个数据收集过程中保持不变。
9. 使用可识别的名称和/或数字保存扫描，后跟时间零标签 （T0）。
   注:建议还保存转换实验的图像（步骤 6.6），以说明转换前和转换后出现的红色信号不足。

7. 在选定的第二时间点对转换后的红色 Dendra2 进行数据采集的成像

1. 要跟踪 Dendra2 随时间而退化，请定义第二个时间点以重新成像相同的线虫/神经元。以实验方法选择第二个时间点，以解决任何相关的生物问题。对于此处描述的协议，Dendra2 在转换后两次图像均在 2 小时 （T2） 和 24 小时 （T24） 。
   1. 在选定的时间点，使用目镜和红色荧光找到相同的线虫/神经元。
   2. 打开相应线虫/神经元的 T0 图像，并重新加载/重用图像设置。在获取 T0、T2 和 T24 h 图像时，确保快照的采集设置完全相同。
   3. 在红色通道中实时扫描，将转换后的红色神经元集中到焦点。由于红色 Dendra2 会随着时间的推移而降级，因此范围指示器将显示不太强烈的最大投影。不要更改任何采集参数，并且以与第一张图像相同的速度（例如 5 倍）获取快照。
2. 为了跟踪Dendra2在4小时或更长时间后退化，在转换后拯救线虫。
   1. 转换和成像四个线虫后立即从显微镜上取下幻灯片。轻轻取下盖玻片，并使用线挑，从 agarose 垫上提起每个线虫。
   2. 将每个线虫单独放在贴有适当标签和可识别的 NGM 板上。
   3. 对于第二个时间点，再次将线虫安装到新鲜的红糖垫上，按照第 6 节中的说明继续对转换后的红色 Dendra2 进行成像。

8. 转换的登德拉2的图像分析

注:使用斐济/ImageJ软件20对Dendra2的^{降解进行分析}。

1. 打开斐济，然后将 .lsm 文件拖下斐济栏。打开转换后拍摄的 T0 图像以及转换后在所选时间点（T2 或 T24 h）拍摄的相同线虫的图像。
   注:要跟踪与Dendra2融合的蛋白质的降解，只需要分析红色通道。
2. 从菜单中建立测量参数:分析 |设置测量。选择"面积"和"集成密度"功能。
3. 选择使用红色通道获得的图像。从斐济条中选择多边形选择工具。
4. 识别 T0 图像上转换的神经元，并使用选择工具在图像周围绘制 ROI。
   1. 要正确识别神经元的轮廓，请通过从条形图像中选择突出强度阈值 |调整 |阈值。拖动条形光标以描绘阈值，然后使用多边形工具跟踪此区域。为了产生准确的投资回报率，还可以使用绿色通道中所选神经元的轮廓。
5. 在红色通道窗口中进行选择后，按"分析| "测量。将显示一个名为"结果"的弹出窗口，其中包括"区域Area"、"IntDen"和"RawIntDen"的 ROI 值。 IntDen
6. 对第二个时间点（T2 或 T24 h）的图像执行相同的选择和测量过程。
7. 将获取的值复制到电子表格软件中，注意在转换后在 T0 和转换后 T2 或 T24 h 适当记录值。

9. 计算登德拉2降解比率

1. 要计算降解比率，请先分配值 1（或 100%）时间从时间点零（即，转换后，当所有红色Dendra2转换仍然存在）的退化时间）。这是由于 T0 的 IntRawDen 值本身而导致的。
2. 要计算红色 Dendra2 强度信号随时间而减少和退化，请将第二个时间点（例如 T2 或 T24 h）的 RawIntDen 值除以 T0的 RawIntDen值。结果数字应小于 1。这些值也可以表示为百分比，将 T0 定义为 100%。
3. 对转换的每个线虫重复第 7 节。对于 Dendra2 退化的图形表示，使用 y 轴中荧光减减的百分比或比率值绘制散点图或条形图。应用任何所需的统计分析，并在图表上说明。

结果

通过微注射获得两种线虫菌株，在框架中表达亨廷顿-1蛋白片段，并结合光可转换蛋白Dendra2获得，质粒作为染色体外阵列保存。融合结构从整个老化过程中在整个C.elegans神经系统中表达。在这里，HTT-D2 包含生理 25 多聚聚聚三聚胺拉伸 （HTTQ25-D2，图 1A ） 或完全青素和致病性重复与 97 谷氨酰胺 （HTTQ97-D2，图 1

讨论

要理解蛋白质的功能，了解其合成、位置和降解非常重要。随着新型、稳定、明亮的 FP 的发展，可视化和监控 POIs 变得更加简单和高效。基因表达聚变PAFP，如Dendra2具有独特的定位，可以研究POI的稳定性。当暴露在紫蓝色光下时，Dendra2在保存的氨基酸三合体内的精确位置断裂。荧光团经历了一个小的结构变化，导致光谱从绿色到红色^{23的完全转移}。这种转变允许检测和监测与Dend...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software