Uso De Las Neuronas Del Hipocampo Cultivadas Primarias Para Estudiar El Ensamblaje De Los Segmentos Iniciales Axón

Resumen

Aquí, se describe un protocolo para estudiar cuantitativamente el montaje y la estructura de los segmentos iniciales de axones (AIS) de las neuronas del hipocampo que carecen de AIS pre-montado debido a la ausencia de una anquiria gigante-G.

Resumen

Los segmentos iniciales de axones neuronales (AIS) son sitios de iniciación de potenciales de acción y han sido ampliamente estudiados por su estructura molecular, ensamblaje y plasticidad dependiente de la actividad. Ankyrin-G gigante, el organizador principal de AIS, asocia directamente con el voltaje membrana-que atraviesa el sodio bloqueado (VSVG) y los canales del potasio (KCNQ2/3), así como el neurofascin 186 del kDa, una molécula de la adherencia de célula de L1CAM. Ankyrin-G gigante también ata a y recluta las moléculas citoplásmicas de AIS incluyendo beta-4-spectrin, y las proteínas microtubule-obligatoria, EB1/EB3 y Ndel1. Ankyrin-G gigante es suficiente rescatar la formación de AIS en neuronas deficientes de ankyrin-G. Ankyrin-G también incluye una isoforma más pequeña de 190 kDa situada en las espinas dendríticas en vez del AIS, que es incapaz de apuntar al AIS o de rescatar el AIS en neuronas ankyrin-G-deficientes. Aquí, se describe un protocolo utilizando neuronas del hipocampo cultivadas de ANK3-E22/23-flox ratones, que, cuando se transfecta con Cre-BFP exhiben la pérdida de toda la isoforma de la anquirina-G y deteriorar la formación de AIS. Combinado un sistema modificado de glía de Banker / neurona co-cultivo, hemos desarrollado un método para transfectar ankyrin-G neuronas nulas con un 480 kDa ankyrin-G-GFP plásmido, que es suficiente para rescatar la formación de AIS. Además, empleamos un método de cuantificación, desarrollado por Salzer y sus colegas para hacer frente a la variación en la distancia AIS de los cuerpos celulares neuronales que se produce en los cultivos de neuronas del hipocampo. Este protocolo permite realizar estudios cuantitativos del ensamblaje de novo y del comportamiento dinámico del AIS.

Introducción

El segmento inicial del axón se encuentra en el axón proximal en la mayoría de las neuronas vertebradas. Funcionalmente, AIS es donde se inician los potenciales de acción debido a la alta densidad de canales de sodio bloqueados por voltaje en esta región. Los AIS de algunas neuronas excitatorias también son atacados por interneuronas inhibitorias a través de la formación de sinapsis GABAérgicas^1,2,3. Por lo tanto, AIS es un sitio crítico para integrar la señalización celular y modular la excitabilidad de las neuronas. AIS es normalmente 20-60 μm de longitud y situado dentro de 20 μm del cuerpo celular. La longitud y posición de AIS varía en las neuronas a través de las regiones del cerebro, así como en diferentes etapas de desarrollo de la misma neurona^4,5. La evidencia acumulada sugiere que la composición y la posición del SIA son dinámicas en respuesta al cambio de la actividad neuronal^4,5,6,7.

480 kDa ankyrin-G es el organizador maestro de AIS. 480 kDa ankyrin-G es una proteína adaptadora asociada a la membrana que se une directamente a los canales de sodio bloqueados por voltaje, así como a otras proteínas AIS importantes, incluidos los canales beta4-spectrin, KCNQ2/3 que modulan la actividad del canal de sodio^8,9,y 186 kDa neurofascin, un L1CAM que dirige las sinapsis GABAérgicas al AIS^2,10. 480 kDa ankyrin-G comparte dominios canónicos de ankyrin encontrados en la isoforma corta de ankyrin-G de 190 kDa (repeticiones DE ANK, dominio de unión a spectrin, dominio regulador), pero se distinguen por un exón gigante que se encuentra solo en vertebrados y se expresa específicamente en neuronas(Figura 1A)^11,12. El dominio específico de la neurona ankyrin-G de 480 kDa (NSD) se requiere para la formación de AIS^12. La ankyrin-G de 190 kDa no promueve el ensamblaje de AIS ni se dirige a AIS en neuronas ankyrin-G-null¹². Sin embargo, 190 kDa ankyrin-G se concentra en el AIS que contiene 480 kDa ankyrin-G^12. Esta capacidad de la anquirina-G de 190 kDa para apuntar a AIS premontado de neuronas de tipo salvaje ha sido una fuente de confusión en la literatura y ha ralentizado la apreciación de las funciones especializadas críticas de la anquirina-G de 480 kDa en el ensamblaje de AIS. Por lo tanto, es fundamental estudiar el ensamblaje de AIS en neuronas ankyrin-G-null que carecen de un AIS preensamblado.

Aquí, presentamos un método para estudiar el ensamblaje y la estructura del AIS utilizando neuronas hippocampales cultivadas de ratones ANK3-E22/23-flox que elimina todas las isoformas de ankyrin-G¹³ (Figura 1B). Transfectando neuronas con una construcción Cre-BFP antes de que se ensase el AIS, generamos neuronas deficientes en anquirina-G que carecían completamente de un AIS(Figura 1B, Figura 2). El ensamblaje de AIS se rescata completamente después de la co-transfección del plásmido de anquirina-G-GFP de 480 kDa con un plásmido Cre-BFP. Este método proporciona una manera de estudiar el ensamblado AIS en un entorno AIS no premontado. También modificamos el sistema de co-cultivo de glía-neurona de Gary Banker sin usar antibióticos, previamente diseñado para neuronas embrionarias de día 18, para su aplicación a neuronas de ratón postnatales y adaptamos un método de cuantificación AIS a las mediciones promedio de AIS de múltiples neuronas para normalizar la variación de AIS^14,15.

Protocolo

NOTA: Este método de cultivo de neuronas del hipocampo de ratones postnatales de 0 días ANK3-E22/23^f/f está adaptado del sistema de co-cultivo de glía/neurona de Gary Banker. Por lo tanto, es fundamental realizar todos los pasos después de la disección en una campana limpia utilizando herramientas esterilizadas. Este protocolo tarda hasta 1 mes. El flujo de trabajo se muestra en la figura 3. El protocolo sigue las pautas animales de la Universidad de Duke.

1. Preparación de cubrebocas y platos de chapado neuronal

1. Al menos una semana antes del día de cultivo, cargue los cubrebocas en el estante de cubrebocas y remoje en ácido nítrico (70% P /W) durante la noche (podría extenderse por días).
2. Lave las tapas tratadas con ácido nítrico con agua destilada en una coctelera de baja velocidad en un frasco de vidrio 2 veces, 1 hora cada una.
3. Incubar cubrebocas en KOH saturado disuelto en etanol 100% durante la noche. Agregue KOH en etanol hasta que ya no se disuelva.
4. Repita el paso de lavado con agua destilada. Enjuague las tapas con etanol al 100% una vez durante 10 minutos.
5. Transfiera los cubrebocas del estante a un vaso de precipitados de vidrio. Cubra el casto con papel de aluminio. Hornear las cubrebocas en un horno de 225 °C durante la noche para esterilizar las cubrebocas. (Los cubrebocas podrían almacenarse en el casto durante semanas).
6. Coloque los cubrebocas en una placa de Petri y luego aplique 3-4 puntos de cera en el cubrebocas para servir como pies. Use una pipeta Pasteur para sumergir en cera hervida en una botella de vidrio. A continuación, toque rápidamente el cubrebocas para crear un punto. Una placa de Petri de 60 mm puede contener 4 cubrebocas. Una placa de Petri de 10 mm puede contener ~ 10 cubrebocas.
7. 2 días antes del día de cultivo, cubre los cubrebocas (el lado con los puntos de cera) con filtro esterilizado 1 mg/mL de poli-L-lisina en ácido bórico 0.1 M (pH 8.5) durante un mínimo de 6 horas y enjuague con agua 2 veces, 1 hora cada vez. Los cubrebocas permanecen en la misma placa de Petri.
8. Añadir el medio de chapado (MEM suplementado con glucosa al 0,6% (peso/vol) y 10% (vol/vol) suero de caballo) a las placas lentamente sin molestar los cubrebocas. Coloque placas en la incubadora hasta el día de cultivo para sembrar neuronas.

2. Preparación de platos de alimentación celular de glía (2 semanas antes del día de cultivo)

1. Diseccione la corteza de un cerebro postnatal de ratones de 1 día de edad y desprenda las meninges.
2. Picar el tejido de la corteza tan finamente como sea posible con unas tijeras limpias en una placa de Petri limpia en un banco limpio.
3. Transfiera el tejido picado a 12 mL de HBSS y agregue 1,5 mL de tripsina al 2,5% y DNasa al 1% (peso/vol). Incubar en un baño de agua de 37 °C durante 15 min, columpiarse cada 5 min. El tejido bien digerido se vuelve pegajoso y forma un gran grupo. Triturar 10-15 veces con una pipeta de 10 mL para descomponer el tejido y obtener una mejor digestión.
4. Triturar el tejido bien digerido 10-15 veces con una pipeta de 5 mL hasta que la mayoría de los trozos desaparezcan y el medio se vuelva nublado. Pase a través de un colador celular para eliminar los trozos restantes y agregue 15 mL de medio de glía (Medio esencial mínimo (MEM) suplementado con glucosa (0.6% wt / vol), 10% (vol / vol) suero de caballo y Penicilina-Estreptomicina (1x) para detener la digestión.
5. Centrifugar las células a 120 x g durante 5 minutos y aspirar el sobrenadante. Resuspend el pellet celular con medio de glía fresca y semilla en platos de cultivo celular (aproximadamente 10⁵ células/cm^2).
6. Reemplace el medio con un medio de glía fresca al día siguiente para eliminar las células no unidas.
7. Alimente los platos de la glía cada 3-4 días con el medio fresco de la glía. Abofetee el matraz 5-10 veces con una mano para desalojar las células sueltamente unidas antes de cambiar de medio.
8. Después de 10 días de cultivo, las células de la glía deben ser casi confluentes. Desprenda las células de la glía con la tripsina-EDTA del 0,25% y separe cerca de 10⁵ células en un nuevo plato del cultivo celular de 60 milímetros. Las células restantes podrían congelarse para su uso futuro.
9. 3 días antes del día de cultivo, cambiar el medio de glía a medio de cultivo neuronal (Neurobasal-A Medium con 1x GlutaMAX-I y 1x suplemento B27).

3. Cultivar neuronas del hipocampo

NOTA: Todos los pasos se realizan a temperatura ambiente.

1. Diseccione 6-8 hipocampos de cachorros postnatales de 1 día de ratones ANK3-E22/23^f/f con medio HBSS en una placa de Petri en la habitación templada. Picar el hipocampo con tijeras de disección a trozos más pequeños. Transfiera los hipocampos de la placa de Petri a un tubo de 15 mL.
2. Lavar los hipocampos 2x con 5 mL de HBSS en el tubo. Deje el hipocampo en 4.5 mL de 1x HBSS después del lavado.
3. Añadir 0,5 mL de tripsina al 2,5% en 4,5 mL de HBSS e incubar en un baño de agua de 37 °C durante 15 minutos. Invierta el tubo cada 5 minutos. Los hipocampos bien digeridos deben volverse pegajosos y formar un grupo. Si es necesario, extienda la digestión durante 5 minutos más.
4. Lavar los hipocampos con HBSS 3 veces durante 5 minutos cada una. No utilice una aspiradora para extraer el HBSS. Es muy fácil eliminar el hipocampo.
5. Añadir 2 mL de HBSS después del lavado y pipetear el hipocampo hacia arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur 15 veces.
6. Triturar el tejido con una pipeta Pasteur pulida al fuego (el diámetro del abierto se reduce a la mitad) 10 veces. No vaya más allá de 10 veces, incluso si todavía quedan trozos. La sobreabosía mata a las neuronas.
7. Descanse el tubo durante 5 minutos hasta que todos los trozos se establezcan en la parte inferior. Utilice suavemente una punta de pipeta de 1 mL para transferir el sobrenadante que contiene las neuronas disociadas a los platos de chapado (10⁵ células/ plato de 60 mm). Añádalo directamente al medio de chapado preincubado y agite la placa suavemente.
8. Repita el paso 3.6-3.7 con los fragmentos restantes hasta que la mayoría de los fragmentos hayan desaparecido.
9. 2-4 horas después de la siembra, revise los platos de chapado con un microscopio de luz. La mayoría de las neuronas deberían haberse unido al cubrebocas. Las celdas unidas son redondas y brillantes. Flip coverslips usando un fórceps de punta fina a los platos de alimentación de células de la glía con medio de cultivo neuronal precondicionado con los puntos de cera laterales mirando hacia abajo.
10. Las neuronas pueden crecer en los platos de alimentación de células de la glía hasta por 1 mes. Alimentar a las neuronas cada 7 días con 1 mL de medio de cultivo neuronal fresco.
11. Paso opcional: 1 semana después de la siembra, añadir arabinósido de citosina (1-β-D-arabinofuranosilcitosina) a una concentración final de 5 μM para frenar la proliferación glial.

4. Interrupción de AIS por knockout de Ankyrin-G en la etapa anterior del desarrollo de la neurona

1. En 3 div (día in vitro),voltear las cubiertas con puntos de cera lado mirando hacia arriba a un plato alimentador de células de glía con medio de cultivo neuronal acondicionado.
2. Mezcle 0,25 μg de ADN Cre-BFP con 0,5 μg de ADN ankyrin-G-GFP (WT/mutante) en un tubo de 1,7 mL para transfectar 4 cubrebocas (~ 2:1 proporción del número de copias de ADN). Agregue 100 μL de medio de cultivo (por ejemplo, Opti-MEM), mezcle y descanse en un rack. Si sólo se transfecta Cre-BFP, la columna vertebral del plásmido GFP se utiliza para igualar la cantidad total de ADN.
3. Mezcle 3 μL de reactivo de transfección (por ejemplo, Lipofectamina 2000) (~ 3 veces de ADN) con un medio de cultivo de 100 μL en un nuevo tubo de 1,7 mL. Incubar durante 5 minutos en RT.
4. Mezclar 100 μL de solución de ADN de la etapa 4.2 con 100 μL de reactivo de transfección de la etapa 4.3. Descanse durante 5-10 minutos en un estante.
5. Agregue 50 μL de mezcla de ADN del paso 4.4 justo en la parte superior de cada cubrebocas insertando la punta justo debajo del medio sin tocar los cubrebocas. Pipetee lentamente para evitar la propagación de la mezcla de ADN.
6. Lleve lentamente el plato de vuelta a la incubadora e incube durante 30-45 minutos.
7. Voltee las cubiertas de nuevo al plato alimentador de glía casera con puntos de cera hacia abajo y vuelva a colocar el plato en la incubadora.

5. Cuantificación del segmento inicial del axón

1. Fijar las neuronas en 7-10 div y manchar con marcador AIS siguiendo el protocolo de inmunocitoquímica estándar para la proteína de interesante.
2. Recoger imágenes fluorescentes con microscopía deseada.
   1. Tome las secciones de la serie Z para recoger la señal de todo el AIS. Mantenga la misma profundidad Z para todas las imágenes.
   2. Ajuste la intensidad del láser para alcanzar el mejor rango dinámico de intensidad de píxeles.
   3. Asegúrese de que todas las imágenes AIS se toman en la misma configuración del microscopio.
   4. Compruebe siempre la señal de Cre-BFP.
3. Cuantificación de AIS
   1. Imagen abierta con Fiji (https://fiji.sc).
   2. Generar la máxima proyección de imágenes de la serie Z.
   3. Reste la señal de fondo de coverslip vacía de la imagen.
   4. Dibuje una línea a lo largo del AIS. El ancho de la línea debe cubrir completamente el AIS. Comience la línea antes de que la señal AIS se eleve sobre el fondo y pare después de que caiga al fondo.
   5. Mida la intensidad media de píxeles solo la línea y exporte a una hoja de cálculo (se necesitan ~ 10-15 AISs).
   6. Genere la curva de intensidad media de AIS utilizando el script MATLAB adaptado de Berger et al.¹⁵.
   7. Para cada experimento, incluya Cre solamente y Cre más las neuronas transfectadas de ankyrin-G del tipo salvaje 480 kDa como controles negativos y positivos para asegurarse de que el knockout de AIS sea la eficacia y el rescate sea acertado.

Resultados

Un conjunto completo de experimentos debe incluir la transfección de Cre-BFP solamente como control negativo, Cre-BFP más la co-transfección de ankyrin-G de 480 kDa como control positivo y una condición no transfectada como control de la técnica. En el control sólo de Cre-BFP, las neuronas transfectadas carecen de la acumulación de marcadores AIS, incluyendo anquirina-G (ankG), beta4-espectrina (β4), neurofascina (Nf) y canales de sodio bloqueados por voltaje (VSVG) (Figura 4A)

Discusión

El montaje de AIS está organizado por 480 kDa ankyrin-G. Sin embargo, la anquirona-G tiene isoformas más cortas que pueden apuntar al AIS de las neuronas de tipo salvaje, lo que puede conducir a la dificultad en la interpretación de los análisis de estructura-función del ensamblaje de AIS. Aquí presentamos un método utilizando neuronas de ratones ANK3-E22/23-flox que permite el estudio del ensamblaje de novo del AIS. Al transfectar con Cre-BFP a 3 div, eliminamos todas las isoformas endógenas d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10xHBSS	Thermo Fisher Scientific	14065-056
18mm coverglass (1.5D)	Fisher Scientific	12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFP	Addgene	#31059
2.5% Tripsin without phenol red	Thermo Fisher Scientific	14065-056
480kDa ankyrin-G-GFP	lab made	Provide upon request
ANK3-E22/23f/f mice	JAX	Stock No: 029797	B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 serum-free supplement	Thermo Fisher Scientific	A3582801
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768
Cell strainer with 70-mm mesh	BD Biosciences	352350
Ceramic coverslip-staining rack	Thomas Scientific	8542E40
Cre-BFP	Addgene	#128174
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995073
GlutaMAX-I supplement	Thermo Fisher Scientific	A1286001
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668030
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103-049
Nitric acid 70%	Sigma-Aldrich	225711
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Poly-L-lysine hydrochloride	Sigma-Aldrich	26124-78-7
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3