Verwendung von primär kultivierten Hippocampus-Neuronen zur Untersuchung der Anordnung von Axon-Anfangssegmenten

Zusammenfassung

Hier beschrieben wir ein Protokoll zur quantitativen Untersuchung der Anordnung und Struktur der Axon-Anfangssegmente (AIS) von Hippocampus-Neuronen, denen aufgrund des Fehlens eines riesigen Ankyrin-G ein vormontiertes AIS fehlt.

Zusammenfassung

Neuronale Axon-Initialsegmente (AIS) sind Orte der Initiierung von Aktionspotentialen und wurden umfassend auf ihre molekulare Struktur, Anordnung und aktivitätsabhängige Plastizität untersucht. Giant Ankyrin-G, der Hauptorganisator von AIS, verbindet sich direkt mit membranübergreifenden spannungsgesteuerten Natrium- (VSVG) und Kaliumkanälen (KCNQ2/3) sowie 186 kDa-Neurofaszin, einem L1CAM-Zelladhäsionsmolekül. Riesen-Ankyrin-G bindet und rekrutiert auch zytoplasmatische AIS-Moleküle, einschließlich Beta-4-Spectrin und die Mikrotubuli-bindenden Proteine EB1 / EB3 und Ndel1. Riesiges Ankyrin-G reicht aus, um die AIS-Bildung in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Ankyrin-G enthält auch eine kleinere 190 kDa-Isoform, die sich an dendritischen Stacheln anstelle des AIS befindet, die nicht in der Lage ist, auf den AIS zu zielen oder den AIS in Ankyrin-G-defizienten Neuronen zu retten. Hier beschrieben wir ein Protokoll mit kultivierten Hippocampus-Neuronen von ANK3-E22/23-Flox-Mäusen, die, wenn sie mit Cre-BFP transfiziert werden, einen Verlust aller Isoformen von Ankyrin-G aufweisen und die Bildung von AIS beeinträchtigen. In Kombination eines modifizierten Banker-Glia/Neuron-Co-Culture-Systems entwickelten wir eine Methode, um Ankyrin-G-Nullneuronen mit einem 480 kDa Ankyrin-G-GFP-Plasmid zu transfizieren, das ausreicht, um die Bildung von AIS zu retten. Darüber hinaus verwenden wir eine quantifizierungsmethode, die von Salzer und Kollegen entwickelt wurde, um die Variation der AIS-Entfernung von den neuronalen Zellkörpern zu behandeln, die in Hippocampus-Neuronenkulturen auftritt. Dieses Protokoll ermöglicht quantitative Untersuchungen der De-novo-Assemblierung und des dynamischen Verhaltens von AIS.

Einleitung

Das Axon-Anfangssegment befindet sich am proximalen Axon in den meisten Wirbeltierneuronen. Funktional ist AIS der Ort, an dem Aktionspotentiale aufgrund der hohen Dichte spannungsgesteuerter Natriumkanäle in diesem Bereich initiiert werden. AIS einiger exzitatorischer Neuronen werden auch von inhibitorischen Interneuronen durch die Bildung von GABAergen Synapsen^1,2,3angegriffen. Daher ist AIS ein kritischer Ort, um Zellsignale zu integrieren und die Erregbarkeit von Neuronen zu modulieren. AIS ist normalerweise 20-60 μm lang und befindet sich innerhalb von 20 μm des Zellkörp....