АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описали протокол количественного изучения сборки и структуры исходных сегментов аксона (AIS) нейронов гиппокампа, в которых отсутствует предварительно собранная АИС из-за отсутствия гигантского анкирина-G.

Аннотация

Начальные сегменты аксона нейронов (АИС) являются участками инициации потенциалов действия и были широко изучены на предмет их молекулярной структуры, сборки и пластичности, зависящей от активности. Гигантский анкирин-G, главный организатор АИС, напрямую ассоциируется с мембранными напряжениями закрытого натриевого (VSVG) и калиевого каналов (KCNQ2/3), а также с нейрофасцином 186 кДа, молекулой адгезии клеток L1CAM. Гигантский анкирин-G также связывается и рекрутирует цитоплазматические молекулы АИС, включая бета-4-спектрин, и микротрубочки-связывающие белки, EB1 / EB3 и Ndel1. Гигантского анкирина-G достаточно для спасения образования АИС в нейронах с дефицитом анкирина-G. Анкирин-G также включает меньшую изоформу 190 кДа, расположенную в дендритных шипах вместо АИС, которая не способна нацеливаться на АИС или спасать АИС в нейронах с дефицитом анкирина G. Здесь мы описали протокол с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, которые при трансфекции Cre-BFP демонстрируют потерю всей изоформы анкирина-G и ухудшают образование АИС. Объединив модифицированную систему кокультуры глии и нейронов Банкира, мы разработали метод трансфектации анкирин-G нулевых нейронов с плазмидой 480 кДа анкирин-G-GFP, что достаточно для спасения образования АИС. Мы также используем метод количественной оценки, разработанный Зальцером и его коллегами для борьбы с изменением расстояния АИС от тел нейронных клеток, которое происходит в культурах нейронов гиппокампа. Этот протокол позволяет проводить количественные исследования сборки de novo и динамического поведения АИС.

Введение

Начальный сегмент аксона расположен в проксимальном аксоне в большинстве нейронов позвоночных. Функционально АИС - это место, где инициируются потенциалы действия из-за высокой плотности натриевых каналов с напряжением в этой области. АИС некоторых возбуждающих нейронов также нацелены на тормозные интернейроны путем образования ГАМКергических синапсов1,2,3. Таким образом, АИС является критическим участком для интеграции клеточной сигнализации и модуляции возбудимости нейронов. АИС обычно составляет 20-60 мкм в длину и расположена в пределах 20 мкм от тела клетки. Длина и положение АИС варьируется в нейронах по областям мозга, а также на разных стадиях развития одного и того женейрона4,5. Накопленные данные свидетельствуют о том, что состав и положение АИС динамичны в ответ на изменение активности нейронов4,5,6,7.

480 кДа анкырин-Г является мастер-организатором АИС. 480 кДа анкирин-G представляет собой мембранно-ассоциированный адапторный белок, который непосредственно связывается с напряжением закрытых натриевых каналов, а также с другими основными белками AIS, включая бета4-спектрин, каналы KCNQ2/3, которые модулируют активность натриевых каналов8,9и 186 кДа нейрофасцина, L1CAM, который направляет ГАМКергические синапсы к AIS2,10. 480 кДа анкирин-G разделяет канонические анкириновые домены, обнаруженные в короткой 190 кДа анкирин-G изоформе (ank repeats, спектрин-связывающий домен, регуляторный домен), но отличаются гигантским экзоном, который встречается только у позвоночных и специфически экспрессируется в нейронах(рисунок 1A)11,12. Специфический домен нейронов анкирин-G (НРД) 480 кДа необходим для формирования АИС12. 190 кДа анкирин-G не способствует сборке АИС и не нацеливает АИС в анкирин-G-нулевых нейронах12. Однако 190 кДа анкирина-Г сосредоточено на АИС, содержащей 480 кДа анкирина-Г12. Эта способность 190 кДа анкирина-G нацеливаться на предварительно собранную АИС нейронов дикого типа была источником путаницы в литературе и замедлила оценку критических специализированных функций 480 кДа анкирина-G в сборке АИС. Поэтому крайне важно изучать сборку АИС в анкирин-G-нулевых нейронах, в которым отсутствует предварительно собранная АИС.

Здесь мы представляем метод изучения сборки и структуры АИС с использованием культивируемых нейронов гиппокампа у мышей ANK3-E22/23-flox, который устраняет все изоформы анкирина-G13 (рисунок 1B). Трансфектируя нейроны с помощью конструкции Cre-BFP до сборки AIS, мы генерировали анкирин-G-дефицитные нейроны, полностью лишенные AIS(рисунок 1B, рисунок 2). Сборка АИС полностью спасена после совместной трансфекции плазмиды анкирин-G-GFP 480 кДа с плазмидой Cre-BFP. Этот метод обеспечивает способ изучения сборки АИС в несборной среде АИС. Мы также модифицировали систему кокультуры глиа-нейрон от Гэри Бэнкера без использования антибиотиков, ранее разработанную для эмбриональных нейронов 18-го дня, для применения к постнатальным нейронам мыши и адаптировали метод количественного определения АИС для усреднения измерений АИС от нескольких нейронов для нормализации вариации АИС14,15.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод культивирования нейронов гиппокампа из постнатальных 0-дневных мышей ANK3-E22/23f/f адаптирован из системы кокультуры глии/нейронов Гэри Банкира. Поэтому крайне важно выполнять все шаги после вскрытия в чистом вытяжке с использованием стерилизованных инструментов. Этот протокол занимает до 1 месяца. Рабочий процесс показан на рисунке 3. Протокол следует рекомендациям по животным Университета Дьюка.

1. Приготовление укрытий и блюд для нанесения нейронной обшивки

  1. По крайней мере, за неделю до дня культивного культивеса загрузите крышки на стойку для чехлов и замочите ее в азотной кислоте (70% Вт / Вт) на ночь (может быть продлена на несколько дней).
  2. Обработанные азотной кислотой крышки промыть дистиллированной водой на низкоскоростном шейкере в стеклянной банке 2 раза по 1 часу каждая.
  3. Инкубационные покровные листы в насыщенном KOH растворенные в 100% этаноле на ночь. Добавьте KOH в этанол до тех пор, пока он больше не растворится.
  4. Повторите этап промывки дистиллированной водой. Промойте крышки 100% этанолом один раз в течение 10 минут.
  5. Перенесите крышки со стойки на стеклянный стакан. Накройте замок алюминиевой фольгой. Запекайте крышки в духовке с 225 °C на ночь, чтобы стерилизовать крышки. (Чехлы могут храниться в мукере неделями).
  6. Поместите обложки в чашку Петри, а затем нанесите 3-4 восковые точки на крышку, чтобы они служили ножками. Используйте пипетку Пастера, чтобы окунуть в кипяченый воск в стеклянной бутылке. Затем быстро коснитесь крышки, чтобы создать точку. Чашка Петри 60 мм может вместить 4 крышки. Чашка Петри 10 мм может вместить ~ 10 обложек.
  7. За 2 дня до дня культивной обработки обложите покровами (сторону с восковыми точками) фильтром, стерилизовав 1 мг/мл поли-L-лизина в 0,1 М борной кислоты (рН 8,5) минимум на 6 часов и смойте водой 2 раза по 1 час каждый раз. Обложки остаются в той же чашке Петри.
  8. Добавляйте гальваночную среду (MEM, дополненную глюкозой 0,6% (масс./об.) и 10% (об/об.) конской сыворотки) в пластины медленно, не нарушая покровов. Поставьте пластины в инкубатор до дня культивации, чтобы посеять нейроны.

2. Приготовление блюд для кормления клеток глии (за 2 недели до дня культивирования)

  1. Рассеките кору головного мозга 1-дневной мыши и отклейте мозг мозгов.
  2. Ткань коры головного мозга измельчить как можно тоньше чистыми ножницами в чистой чашке Петри на чистой скамейке.
  3. Переместите измельченную ткань в 12 мл HBSS и добавьте 1,5 мл 2,5% трипсина и 1% (мас./об.) ДНКазы. Насиживайте на водяной бане 37 °C в течение 15 мин, качайте каждые 5 мин. Хорошо переваренные ткани становятся липкими и образуют большой кластер. Тритурат 10-15 раз пипеткой 10 мл, чтобы разрушить ткани и получить лучшее пищеварение.
  4. Тритурировать хорошо переваренные ткани 10-15 раз пипеткой объемом 5 мл до тех пор, пока большинство кусков не исчезнет и среда не станет мутной. Пропустите через клеточный ситечко, чтобы удалить оставшиеся куски и добавить 15 мл среды глии (минимальная необходимая среда (MEM), дополненная глюкозой (0,6% масс. / об.), 10% (об./об.) конской сывороткой и пенициллин-стрептомицином (1x), чтобы остановить пищеварение.
  5. Центрифугируют клетки при 120 х г в течение 5 минут и аспирируют супернатант. Повторно суспендируют клеточную гранулу со свежей глийной средой и семенами в блюдах для клеточных культур (около 105 клеток/см2).
  6. Замените среду свежей средой глии на следующий день, чтобы удалить неприкрепленные клетки.
  7. Подкармливаете блюда из глии каждые 3-4 дня свежей глией. Шлепните колбу 5-10 раз рукой, чтобы выбить свободно прикрепленные клетки перед сменой среды.
  8. После 10 дней посева клетки глии должны быть почти сливаться. Отсоедините клетки глии с 0,25% трипсина-ЭДТА и помейте около 105 клеток в новую чашку для культивирования клеток 60 мм. Оставшиеся клетки могут быть заморожены для будущего использования.
  9. За 3 дня до дня культивации измените глию среду на нейрональную культуральную среду (нейробазальная среда А с 1x GlutaMAX-I и 1x B27 добавкой).

3. Культура нейронов гиппокампа

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются при комнатной температуре.

  1. Рассекайте 6-8 гиппокампов от послеродовых 1-дневных детенышей от мышей ANK3-E22/23f/f со средой HBSS в чашке Петри в комнате умеренного пояса. Нарежьте гиппокампы ножницами для рассечения на более мелкие кусочки. Перенесите гиппокампы из чашки Петри в трубку 15 мл.
  2. Вымойте гиппокампи 2x с 5 мл HBSS в трубке. Оставьте гиппокамп в 4,5 мл 1x HBSS после промывки.
  3. Добавьте 0,5 мл 2,5% трипсина в 4,5 мл HBSS и инкубировать на водяной бане при 37 °C в течение 15 минут. Инвертировать трубку каждые 5 минут. Хорошо переваренные гиппокампы должны стать липкими и образовать скопление. При необходимости продлите пищеварение еще на 5 минут.
  4. Мойте гиппокампы HBSS 3 раза по 5 минут каждый. Не используйте пылесос для удаления HBSS. Очень легко удалить гиппокамп.
  5. Добавьте 2 мл HBSS после стирки и пипетку гиппокампа вверх и вниз пипеткой Пастера 15 раз.
  6. Обрубьте ткань огнеполированной пипеткой Пастера (диаметр открытого сужается вдвое) 10 раз. Не выходите за рамки 10 раз, даже если еще остались куски. Подслушивание убивает нейроны.
  7. Устройте трубку в течение 5 минут, пока все куски не уложиться на дно. Осторожно используйте наконечник пипетки 1 мл, чтобы перенести супернатант, содержащий диссоциированные нейроны, на тарелку для покрытия (105 клеток / 60 мм тарелки). Добавьте его непосредственно в предварительно инкубированную гальваническое средство и аккуратно встряхните тарелку.
  8. Повторяйте шаг 3.6-3.7 с оставшимися кусками до тех пор, пока большинство кусков не исчезнут.
  9. Через 2-4 часа после посева проверьте обшивку посуды световым микроскопом. Большинство нейронов должны были прикрепляться к крышке. Прикрепленные клетки круглые и яркие. Переворачивайте крышки с помощью тонкого наконечника щипцов к тарелкам для подачи клеток глии с предварительно подготовленной нейрональной питательной средой с восковыми точками стороной вниз.
  10. Нейроны могут расти в кормушках для клеток глии до 1 месяца. Подкармливаем нейроны каждые 7 дней 1 мл свежей нейрональной питательной среды.
  11. Необязательный этап: через 1 неделю после посева добавить цитозина арабинозид (1-β-D-арабинофураносилцитозина) до конечной концентрации 5 мкМ для сдерживания глиальной пролиферации.

4. Нарушение АИС нокаутом Анкирина-G на более ранней стадии развития нейронов

  1. На 3 див (день in vitro)переверните крышки с восковыми точками стороной вверх к тарелке для подачи клеток глии с кондиционированной нейрональной питательной средой.
  2. Смешайте 0,25 мкг ДНК Cre-BFP с 0,5 мкг ДНК анкирина-G-GFP (WT/мутант) в пробирке 1,7 мл для трансфектации 4 покровных листа (~ 2:1 соотношение числа копий ДНК). Добавить 100 мкл питательной среды (например, Opti-MEM), перемешать и уложить на стойку. Если трансфицируется только Cre-BFP, плазмидная основа GFP используется для сопоставления общего количества ДНК.
  3. Смешайте 3 мкл трансфекционного реагента (например, Lipofectamine 2000) (~ 3 раза ДНК) со 100 мкл культуральной среды в новой пробирке 1,7 мл. Инкубировать в течение 5 минут на RT.
  4. Смешайте 100 мкл раствора ДНК со ступени 4.2 со 100 мкл трансфекционного реагента со ступени 4.3. Отдохните 5-10 минут на стойке.
  5. Добавьте 50 мкл смеси ДНК с шага 4.4 прямо поверх каждого обтекателя, вставив наконечник чуть ниже среды, не касаясь обтекателей. Пипетка медленно, чтобы избежать распространения смеси ДНК.
  6. Медленно доведите блюдо обратно в инкубатор и высиживите в течение 30-45 минут.
  7. Переверните крышки обратно в домашнюю тарелку для подачи глии с восковыми точками стороной вниз и поставьте тарелку обратно в инкубатор.

5. Количественная оценка начального сегмента аксона

  1. Фиксируют нейроны на 7-10 div и окрашивают маркером АИС по стандартному протоколу иммуноцитохимии для белка интересного.
  2. Собирайте флуоресцентные снимки с помощью нужной микроскопии.
    1. Возьмите секции серии Z, чтобы собрать сигнал всей АИС. Сохраняйте одинаковую Z-глубину для всех изображений.
    2. Отрегулируйте интенсивность лазера для достижения наилучшего динамического диапазона интенсивности пикселей.
    3. Убедитесь, что все снимки AIS сделаны на одном и том же микроскопе.
    4. Всегда проверяйте сигнал Cre-BFP.
  3. Количественная оценка АИС
    1. Открыть картинку с Фиджи (https://fiji.sc).
    2. Генерация максимальной проекции изображений Z-серии.
    3. Вычтите из изображения пустой фоновый сигнал обложки.
    4. Провести линию вдоль АИС. Ширина линии должна полностью охватывать АИС. Начните линию до того, как сигнал AIS будет поднят над фоном, и остановитесь после того, как он опустится на задний план.
    5. Измерьте среднюю интенсивность пикселей только линии и экспортируйте в электронную таблицу (требуется ~10-15 AIS).
    6. Сгенерировать кривую средней интенсивности АИС с помощью скрипта MATLAB, адаптированного из Berger et al.15.
    7. Для каждого эксперимента включайте только Cre и Cre плюс трансфективные нейроны дикого типа 480 кДа анкирин-G в качестве отрицательного и положительного контроля, чтобы убедиться, что нокаут АИС является эффективностью и спасение успешным.

Результаты

Полный набор эксперимента должен включать только трансфекцию Cre-BFP в качестве отрицательного контроля, Cre-BFP плюс 480 кДа анкирин-G ко-трансфекцию в качестве положительного контроля и неперетерфраженное состояние в качестве контроля техники. В контроле только Cre-BFP трансфектированные ней?...

Обсуждение

Сборка АИС организована 480 кДа анкырин-Г. Однако анкирин-G имеет более короткие изоформы, которые могут нацеливаться на АИС нейронов дикого типа, что может привести к трудностям в интерпретации структурно-функционального анализа сборки АИС. Здесь мы представляем метод с использованием ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Гэри Банкира за предложение по протоколу нейронной культуры. Эта работа поддерживается Медицинским институтом Говарда Хьюза, грантом NIH и профессорским саном Джорджа Барта Геллера (V.B.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10xHBSSThermo Fisher Scientific14065-056
18mm coverglass (1.5D)Fisher Scientific12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFPAddgene#31059
2.5% Tripsin without phenol redThermo Fisher Scientific14065-056
480kDa ankyrin-G-GFPlab madeProvide upon request
ANK3-E22/23f/f miceJAXStock No: 029797B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 serum-free supplementThermo Fisher ScientificA3582801
Boric acidSigma-AldrichB6768
Cell strainer with 70-mm meshBD Biosciences352350
Ceramic coverslip-staining rackThomas Scientific8542E40
Cre-BFPAddgene#128174
D-GlucoseSigma-AldrichG7021
DMEMThermo Fisher Scientific11995073
GlutaMAX-I supplementThermo Fisher ScientificA1286001
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668030
MEM with Earle’s salts and L-glutamineThermo Fisher Scientific11095-080
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103-049
Nitric acid 70%Sigma-Aldrich225711
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin-streptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Poly-L-lysine hydrochlorideSigma-Aldrich26124-78-7
Potassium hydroxideSigma-Aldrich1310-58-3

Ссылки

  1. Nelson, A. D., et al. Correction: Ankyrin-G regulates forebrain connectivity and network synchronization via interaction with GABARAP. Molecular Psychiatry. , (2019).
  2. Tseng, W. C., Jenkins, P. M., Tanaka, M., Mooney, R., Bennett, V. Giant ankyrin-G stabilizes somatodendritic GABAergic synapses through opposing endocytosis of GABAA receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 1214-1219 (2015).
  3. Tai, Y., Gallo, N. B., Wang, M., Yu, J. R., Van Aelst, L. Axo-axonic Innervation of Neocortical Pyramidal Neurons by GABAergic Chandelier Cells Requires AnkyrinG-Associated L1CAM. Neuron. 102 (2), 358-372 (2019).
  4. Hofflin, F., et al. Heterogeneity of the Axon Initial Segment in Interneurons and Pyramidal Cells of Rodent Visual Cortex. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 332 (2017).
  5. Schluter, A., et al. Structural Plasticity of Synaptopodin in the Axon Initial Segment during Visual Cortex Development. Cerebral Cortex. 27 (9), 4662-4675 (2017).
  6. Kuba, H., Oichi, Y., Ohmori, H. Presynaptic activity regulates Na(+) channel distribution at the axon initial segment. Nature. 465 (7301), 1075-1078 (2010).
  7. Grubb, M. S., Burrone, J. Activity-dependent relocation of the axon initial segment fine-tunes neuronal excitability. Nature. 465 (7301), 1070-1074 (2010).
  8. Pan, Z., et al. A common ankyrin-G-based mechanism retains KCNQ and NaV channels at electrically active domains of the axon. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2599-2613 (2006).
  9. Cooper, E. C. Made for "anchorin": Kv7.2/7.3 (KCNQ2/KCNQ3) channels and the modulation of neuronal excitability in vertebrate axons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (2), 185-192 (2011).
  10. Zhou, D., et al. AnkyrinG is required for clustering of voltage-gated Na channels at axon initial segments and for normal action potential firing. The Journal of Cell Biology. 143 (5), 1295-1304 (1998).
  11. Kordeli, E., Lambert, S., Bennett, V. AnkyrinG. A new ankyrin gene with neural-specific isoforms localized at the axonal initial segment and node of Ranvier. Journal of Biological Chemistry. 270 (5), 2352-2359 (1995).
  12. Jenkins, P. M., et al. Giant ankyrin-G: a critical innovation in vertebrate evolution of fast and integrated neuronal signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 112 (4), 957-964 (2015).
  13. Jenkins, P. M., et al. E-cadherin polarity is determined by a multifunction motif mediating lateral membrane retention through ankyrin-G and apical-lateral transcytosis through clathrin. Journal of Biological Chemistry. 288 (20), 14018-14031 (2013).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocol. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  15. Berger, S. L., et al. Localized Myosin II Activity Regulates Assembly and Plasticity of the Axon Initial Segment. Neuron. 97 (3), 555-570 (2018).
  16. Yang, R., et al. Neurodevelopmental mutation of giant ankyrin-G disrupts a core mechanism for axon initial segment assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 116 (39), 19717-19726 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168GAIS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены