축 사 초기 세그먼트의 조립을 공부 하는 기본 배양 된 해마 뉴런의 사용

요약

여기서, 우리는 거대한 ankyrin-G의 부재로 인해 사전 조립된 AIS가 부족한 해마 뉴런의 축삭 초기 세그먼트(AIS)의 조립 및 구조를 정량적으로 연구하는 프로토콜을 기술하였다.

초록

신경 축 축 하 초기 세그먼트 (AIS) 행동 잠재력의 개시의 사이트 이며 광범위 하 게 그들의 분자 구조대 한 연구 되었습니다., 조립 및 활동 의존가성 가소성. AIS의 마스터 오거나이저인 거대 앙키린-G는 멤브레인 스패닝 전압 게이트 나트륨(VSVG) 및 칼륨 채널(KCNQ2/3)과 L1CAM 세포 접착 분자인 186 kDa neurofascin과 직접 연결됩니다. 거대한 ankyrin-G는 또한 베타-4-spectrin및 microtubule 결합 단백질, EB1/EB3 및 Ndel1을 포함하여 세포질 AIS 분자를 결합하고 모집합니다. 거대한 ankyrin-G는 ankyrin-G 결핍 뉴런에서 AIS 형성을 구출하기에 충분합니다. Ankyrin-G는 또한 AIS를 대상으로 하거나 ankyrin-G-결핍 뉴런에서 AIS를 구출할 수 없는 AIS 대신 수지상 척추에 위치한 작은 190 kDa 이소형을 포함합니다. 여기서, 우리는 ANK3-E22/23-flox마우스에서 배양 해마 뉴런을 사용하여 프로토콜을 설명했는데, 이는 Cre-BFP로 감염될 때 안키린-G의 모든 동위체의 손실을 나타내고 AIS의 형성을 손상시킵니다. 수정된 뱅커 글리아/뉴런 공동 배양 시스템을 결합하여, AIS의 형성을 구출하기에 충분한 480kDa ankyrin-GFP 플라스미드로 안키린-G널 뉴런을 횡단하는 방법을 개발했습니다. 우리는 또한 해마 뉴런 배양에서 발생하는 신경 세포 체로부터AIS 거리의 변화를 처리하기 위해 Salzer와 동료에 의해 개발 된 정량화 방법을 사용합니다. 이 프로토콜을 사용하면 de novo 어셈블리의 정량적 연구와 AIS의 동적 동작을 허용합니다.

서문

축 사 초기 세그먼트는 대부분의 척추 동물 뉴런에서 근위 축 축 에 위치. 기능적으로 AIS는 이 지역의 전압 게이트 나트륨 채널의 고밀도로 인해 작업 전위가 시작되는 곳입니다. 일부 흥분 성 뉴런의 AIS는 또한 GABAergic 시냅스^{1,2,3형성을}통해 억제 인터뉴런에 의해 표적화된다. 따라서 AIS는 세포 신호를 통합하고 뉴런의 흥분성을 조절하는 중요한 사이트입니다. AIS는 일반적으로 길이가 20-60 μm이며 세포 체체의 20 μm 내에 있습니다. AIS의 길이와 위치는 뇌 영역을 통해 뉴런뿐만 아니라 동일한 뉴런^4,5의다른 발달 단계에서 다릅니다. 축적된 증거는 AIS의 조성및 위치가 뉴런 활동의 변화에 반응하는데 역동적인 것으로 나타났다^4,5,6,7.

480 kDa ankyrin-G는 AIS의 마스터 오거나이저입니다. 480 kDa ankyrin-G는 전압 게이트 나트륨 채널뿐만 아니라 베타4-스펙트린, KCNQ2/3 채널을 포함한 다른 주요 AIS 단백질에 직접 결합하는 멤브레인 관련 어댑터 단백질로 나트륨 채널 활성^8,9,및 186 kDa neurofascin, GABAergicssic을 직접 하는 L1CAM입니다. 480 kDa ankyrin-G는 짧은 190 kDa ankyrin-G isoform (ANK 반복, 스펙트럼 결합 도메인, 규제 도메인)에서 발견되는 표준 앙키린 도메인을 공유하지만 척추 동물에서만 발견되며 뉴런(그림 1A)^11,12에서구체적으로 표현되는 거대한 엑소로 구별됩니다. 480 kDa ankyrin-G 뉴런 특이 도메인(NSD)은 AIS^{형성(12)에}필요하다. 190 kDa ankyrin-G는 ankyrin-G-null^{뉴런(12)에서}AIS 어셈블리 또는 타겟 AIS를 촉진하지 않는다. 그러나, 190 kDa ankyrin-G는 480 kDa ankyrin-G^12를포함하는 AIS에 집중된다. 190kDa ankyrin-G의 이러한 능력은 야생형 뉴런의 사전 조립된 AIS를 표적으로 하는 것이 문헌의 혼란의 원천이었으며 AIS 어셈블리에서 480kDa ankyrin-G의 중요한 전문 기능에 대한 인식을 늦추고 있다. 따라서 사전 조립된 AIS가 부족한 안키린-G-null 뉴런에서 AIS 어셈블리를 연구하는 것이 중요합니다.

여기서, 안키린-G^13(도 1B)의모든 등색을 제거하는 ANK3-E22/23-flox 마우스로부터 배양된 해마 뉴런을 사용하여 AIS의 조립 및 구조를 연구하는 방법을 제시한다. AIS가 조립되기 전에 Cre-BFP 구조로 뉴런을 변형시킴으로써, 우리는 완전히 AIS(도 1B, 도 2)가부족한 ankyrin-G-결핍 뉴런을 생성했습니다. AIS의 조립은 Cre-BFP 플라스미드와 480 kDa ankyrin-G-GFP 플라스미드의 공동 변환에 따라 완전히 구출된다. 이 방법은 사전 조립되지 않은 AIS 환경에서 AIS 어셈블리를 연구하는 방법을 제공합니다. 또한 이전에 배아일 18뉴런을 위해 설계된 항생제를 사용하지 않고 게리 뱅커로부터 글리아-뉴런 공동 배양 시스템을 수정하여 산후 마우스 뉴런에 적용하고 AIS^14,15의변이를 정상화하기 위해 여러 뉴런으로부터 AIS 측정을 평균하는 AIS 수량 방법을 적용하였다.

프로토콜

참고: 산후 0일 ANK3-E22/23^f/f 마우스에서 해마 뉴런의 이 배양 방법은 게리 뱅커의 glia/neuron 공동 배양 시스템에서 채택된다. 따라서 멸균 도구를 사용하여 깨끗한 후드에서 해부 후 모든 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 최대 1개월이 소요됩니다. 워크플로가 그림 3에표시됩니다. 이 프로토콜은 듀크 대학의 동물 지침을 따릅니다.

1. 커버립 및 뉴런 도금 접시 준비

1. 문화일 최소 1주일 전에 커버슬립 랙에 덮개를 적재하고 하룻밤 사이에 질산(70%W/W)에 담급니다(며칠 동안 연장될 수 있음).
2. 질산 처리 커버립을 유리 항아리에 있는 저속 셰이커에 증류수로 입술을 2회, 1시간 씩 세척합니다.
3. 포화 KOH의 커버립을 포화 된 KOH로 하룻밤 사이에 100 % 에탄올로 용해. KOH를 에탄올에 추가하면 더 이상 용해되지 않습니다.
4. 증류수로 세척 단계를 반복합니다. 10분 동안 100% 에탄올로 커버립을 헹구고 있습니다.
5. 랙에서 유리 비커로 커버립을 옮기. 비커를 알루미늄 호일로 덮습니다. 커버립을 밤새 225°C 오븐에 굽고 커버립을 살균합니다. (커버립은 몇 주 동안 비커에 보관할 수 있습니다.).
6. 페트리 접시에 커버립을 놓고 커버슬립에 3-4 왁스 점을 바르면 발역할을 합니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 유리 병에 삶은 왁스에 담급드세요. 그런 다음 빠르게 커버슬립을 터치하여 점을 만듭니다. 60mm 페트리 디쉬가 커버립 4개수. 10mm 페트리 디쉬가 ~10개의 커버립을 담을 수 있습니다.
7. 문화일 2일 전, 필터 살균 1 mg/mL 폴리-L-리신을 0.1M boric acid(pH 8.5)로 살균한 코트 커버립(왁스 도트 사이드)은 최소 6시간 동안 물로 2회, 1시간 씩 헹구고 있다. 커버립은 페트리 요리에 남아 있습니다.
8. 도금 매체(포도당 0.6%(wt/vol)와 10%(vol/vol) 말 세럼으로 보충된 MEM을 커버립을 방해하지 않고 천천히 접시에 넣습니다. 배양의 날까지 인큐베이터에 플레이트를 넣고 뉴런을 종자합니다.

2. 글리아 세포 피더 요리 준비 (문화일 2 주 전)

1. 산후 1 일 된 마우스 뇌에서 피질을 해부하고 수막을 벗겨냅니다.
2. 깨끗한 벤치에 깨끗한 페트리 접시에 깨끗한 가위로 피질 조직을 가능한 한 잘게 자릅니다.
3. 다진 조직을 HBSS 12mL로 옮기고 1.5mL의 트립신과 1%(wt/vol) DNase를 추가합니다. 37°C 수조에서 15분 동안 배양하고 5분마다 스윙합니다. 잘 소화 된 조직은 끈적해지고 큰 클러스터를 형성합니다. 조직을 분해하고 더 나은 소화를 얻기 위해 10 mL 파이펫으로 10-15 번 트리투레이.
4. 대부분의 덩어리가 사라지고 중간이 흐려질 때까지 잘 소화된 조직을 5mL 파이펫으로 10-15번 트리투레이합니다. 남은 덩어리를 제거하고 15mL의 글리아 배지(최소 필수 매체(MEM)를 포도당(0.6% wt/vol), 10%(vol/vol) 말 혈청 및 페니실린-스트렙토마이신(1x)으로 첨가하여 소화를 막습니다.
5. 세포를 120 x g에서 5분간 원심분리하고 수퍼나탄을 흡인시합니다. 세포 배양 접시에 신선한 glia 매체와 종자 셀 펠릿을 다시 중단 (약 10⁵ 세포/cm^2).
6. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 다음 날 신선한 신경교 매개체로 배지를 대체하십시오.
7. 신선한 glia 매체로 3-4 일마다 glia 접시를 먹입니다. 플라스크를 손으로 5-10번 때려 느슨하게 부착된 세포를 빼내게 한 후 배지를 변경합니다.
8. 문화의 10 일 후에, glia 세포는 거의 confluent되어야 합니다. 0.25% 트립신-EDTA를 가진 분리된 glia 세포 및 새로운 60 mm 세포 배양 접시에 있는 대략¹⁰⁵ 개의 세포를 종자. 남은 세포는 향후 사용을 위해 동결될 수 있습니다.
9. 문화일 3일 전, 신경 배양 배지로 글리아 배지를 변경합니다(글루타맥스-I 1x 및 B27 보충제를 곁들인 신경병대-A 배지).

3. 문화 해마 뉴런

참고: 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.

1. 방 온대에서 페트리 접시에 HBSS 배지와 ANK3-E22/23^{f / f} 마우스에서 산후 1 일 된 새끼에서 6-8 해마를 해부. 해부 가위로 해마를 작은 조각으로 자릅니다. 페트리 접시에서 15mL 튜브로 해마를 옮는다.
2. 튜브에 5mL의 HBSS로 해마 2x를 씻으십시오. 세척 후 1x HBSS의 4.5mL에 해마를 둡니다.
3. HBSS의 4.5mL에 2.5%의 트립신의 0.5mL를 추가하고 15 분 동안 37 ° C 수조에 인큐베이션하십시오. 5분마다 튜브를 반전시면 됩니다. 잘 소화 된 해마는 끈적거리고 클러스터를 형성해야합니다. 필요한 경우 소화를 5분 더 연장합니다.
4. HBSS로 해마를 각각 5분간 3회 세척합니다. 진공을 사용하여 HBSS를 제거하지 마십시오. 해마를 제거하는 것은 매우 쉽습니다.
5. 세척 후 HBSS 2mL을 추가하고 파스퇴르 파이펫으로 해마를 위아래로 15 번 넣습니다.
6. 불을 연마한 파스퇴르 파이펫(개방의 직경이 절반으로 좁혀져 있음)으로 조직을 10회 트리투레이합니다. 여전히 덩어리가 남아 있더라도 10 배를 넘지 마십시오. 과열은 뉴런을 죽인다.
7. 모든 덩어리가 바닥으로 설정될 때까지 튜브를 5분간 쉬게 합니다. 부드럽게 1mL 파이펫 팁을 사용하여 분리된 뉴런을 함유한 상체를 도금 접시(105셀/60mm 접시)로 옮길 수 있습니다. 사전 배양 된 도금 매체에 직접 추가하고 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다.
8. 대부분의 청크가 사라질 때까지 나머지 청크와 함께 3.6-3.7 단계를 반복합니다.
9. 파종 후 2-4시간 후에는 가벼운 현미경으로 도금 접시를 확인하십시오. 뉴런의 대부분은 커버 슬립에 부착해야합니다. 부착 된 셀은 둥글고 밝습니다. 왁스 점 측이 아래쪽을 향하고 있는 사전 조건화된 뉴런 배양 배지를 사용하여 미세 팁 집게를 사용하여 커버립을 뒤집습니다.
10. 뉴런은 최대 1개월 동안 glia 세포 피더 접시에서 자랄 수 있습니다. 신선한 신경 배양 배지의 1 mL로 7 일마다 뉴런을 공급하십시오.
11. 선택적 단계: 시토신 아라비노사이드(1-β-D-아라비노실시토신)를 5μM의 최종 농도에 추가하여 교아세포의 확산을 억제합니다.

4. 뉴런 개발의 초기 단계에서 Ankyrin-G의 녹아웃에 의해 AIS의 중단

1. 3 div (체외에서)커버립을 왁스 도트 측으로 조절 된 신경 배양 배지가있는 glia 세포 피더 접시까지 향합니다.
2. Cre-BFP DNA의 0.25 μg와 ankyrin-G-GFP(WT/돌연변이) DNA를 1.7mL 튜브에 혼합하여 4개의 커버립(DNA 카피 번호의 2:1 비율)을 변환합니다. 배양 매체(예: Opti-MEM)의 100μL을 넣고 랙에 혼합하고 휴식을 취합니다. Cre-BFP만 전염되는 경우, GFP 플라스미드 백본은 총 DNA 양과 일치하도록 사용된다.
3. 새로운 1.7mL 튜브에 100 μL 배양 배지와 함께 3 μL의 형질 전환 시약(예를 들어, Lipofectamine 2000)(DNA의 3배)을 혼합한다. RT에서 5분간 배양하세요.
4. 4.2단계에서 DNA 용액 100 μL을 4.3단계에서 100 μL의 트랜스페트 시약과 혼합합니다. 랙에서 5-10분 간 휴식을 취하십시오.
5. 커버립을 건드리지 않고 중간 크기 바로 아래에 팁을 삽입하여 각 커버슬립 의 상단에 4.4 단계에서 50 μL의 DNA 믹스를 추가합니다. 피펫은 DNA 혼합의 확산을 피하기 위해 천천히.
6. 접시를 인큐베이터로 천천히 가져와 서 30-45 분 동안 배양하십시오.
7. 커버립을 왁스 도트 측이 내려다보고 접시를 인큐베이터에 다시 넣은 홈 글리아 피더 접시에 다시 플립합니다.

5. 축축기 초기 세그먼트의 정량화

1. 흥미로운 단백질에 대한 표준 면역 세포화학 프로토콜에 따라 AIS 마커로 7-10 div 및 얼룩에 뉴런을 수정합니다.
2. 원하는 현미경 검사법과 형광 사진을 수집합니다.
   1. Z 시리즈 섹션을 사용하여 전체 AIS의 신호를 수집합니다. 모든 사진에 대해 동일한 Z 깊이를 유지합니다.
   2. 레이저 강도를 조정하여 최상의 픽셀 강도 동적 범위에 도달합니다.
   3. 모든 AIS 사진이 동일한 현미경 설정에서 촬영되는지 확인합니다.
   4. 항상 Cre-BFP의 신호를 확인합니다.
3. AIS 정량화
   1. 피지 (https://fiji.sc)와 함께 사진을 엽니 다.
   2. Z 시리즈 이미지의 최대 투영을 생성합니다.
   3. 이미지에서 빈 커버 슬립 배경 신호를 뺍니다.
   4. AIS를 따라 선을 그립니다. 선의 너비는 AIS를 완전히 커버해야 합니다. AIS 신호가 배경 위로 올라오기 전에 선을 시작하고 배경으로 떨어뜨린 후 중지합니다.
   5. 평균 픽셀 강도를 단독으로 측정하고 스프레드시트로 내보냅니다(~10-15개의 AI가 필요합니다).
   6. Berger^등에서조정된 MATLAB 스크립트를 사용하여 AIS의 평균 강도 곡선을 생성합니다.
   7. 각 실험에 대해, Cre 전용 및 Cre 플러스 야생형 480 kDa ankyrin-G 를 음수 및 양성 제어로 트랜스감염시킨 뉴런을 포함하여 AIS의 녹아웃이 효율이고 구조가 성공했는지 확인합니다.

결과

실험의 완전한 세트는 음성 제어로 Cre-BFP 만 트랜스페션을 포함해야, Cre-BFP 플러스 480 kDa ankyrin-G 는 양성 제어로 공동 트랜스페이션및 기술 제어로 비 이상 감염 상태를 포함한다. Cre-BFP 전용 대조군에서, 전감염된 뉴런은 ankyrin-G(ankG), 베타4-스펙트린(β4), 신경파신(Nf) 및 전압 게이트 나트륨 채널(VSVG)(도 4A)^16을포함한 AIS 마커의 축적이 부족하다. 대조적으로...

토론

AIS의 조립은 480 kDa ankyrin-G에 의해 조직된다. 그러나, ankyrin-G는 AIS 어셈블리의 구조 기능 분석의 해석에 어려움을 초래할 수 있는 야생형 뉴런의 AIS를 표적으로 할 수 있는 짧은 동소형을 갖는다. 여기서 우리는 AIS의 드 노보 조립의 연구를 허용하는 ANK3-E22/23-flox 마우스에서 뉴런을 사용하는 방법을 제시한다. 3 div에서 Cre-BFP와 변형함으로써, 우리는 ankyrin-G의 모든 내인성 동소형을 제...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10xHBSS	Thermo Fisher Scientific	14065-056
18mm coverglass (1.5D)	Fisher Scientific	12-545-84-1D
190kDa ankyrin-G-GFP	Addgene	#31059
2.5% Tripsin without phenol red	Thermo Fisher Scientific	14065-056
480kDa ankyrin-G-GFP	lab made	Provide upon request
ANK3-E22/23f/f mice	JAX	Stock No: 029797	B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J;
B27 serum-free supplement	Thermo Fisher Scientific	A3582801
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768
Cell strainer with 70-mm mesh	BD Biosciences	352350
Ceramic coverslip-staining rack	Thomas Scientific	8542E40
Cre-BFP	Addgene	#128174
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995073
GlutaMAX-I supplement	Thermo Fisher Scientific	A1286001
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668030
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	11095-080
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103-049
Nitric acid 70%	Sigma-Aldrich	225711
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Poly-L-lysine hydrochloride	Sigma-Aldrich	26124-78-7
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1310-58-3