Construcción de mutantes en el serotipo 1 Streptococcus pneumoniae cepa 519/43

Resumen

Aquí, describimos una cepa 519/43 del serotipo 1 de S. pneumoniae que puede modificarse genéticamente utilizando su capacidad para adquirir ADN de forma natural y un plásmido suicida. Como prueba de principio, se hizo un mutante isogénico en el gen de la neumolisina (ply).

Resumen

Streptococcus pneumoniae serotipo 1 sigue siendo un gran problema en los países de ingresos bajos y medios, particularmente en el África subsahariana. A pesar de su importancia, los estudios en este serotipo se han visto obstaculizados por la falta de herramientas genéticas para modificarlo. En este estudio, describimos un método para modificar genéticamente un aislado clínico de serotipo 1 (cepa 519/43). Curiosamente, esto se logró explotando la capacidad del neumococo para adquirir ADN de forma natural. Sin embargo, a diferencia de la mayoría de los neumococos, el uso de ADN lineal no tuvo éxito; Para mutar esta importante cepa, se tuvo que usar un plásmido suicida. Esta metodología ha proporcionado los medios para una comprensión más profunda de este esquivo serotipo, tanto en términos de su biología como de patogenicidad. Para validar el método, la principal toxina neumocócica conocida, la neumolisina, fue mutada porque tiene un fenotipo bien conocido y fácil de seguir. Demostramos que el mutante, como era de esperar, perdió su capacidad de lisar los glóbulos rojos. Al poder mutar un gen importante en el serotipo de interés, pudimos observar diferentes fenotipos para la pérdida de función mutantes en infecciones intraperitoneales e intranasales de los observados para otros serotipos. En resumen, este estudio demuestra que la cepa 519/43 (serotipo 1) puede ser modificada genéticamente.

Introducción

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, el neumococo) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. Hasta hace poco, se han descubierto cerca de 100 serotipos de S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Anualmente, la enfermedad neumocócica invasiva (EPI) se cobra alrededor de 700.000 muertes, de niños menores de 5 años⁸. S. pneumoniae es la principal causa de neumonía bacteriana, otitis media, meningitis y septicemia en todo el mundo⁹.

En el cinturón africano de la meningitis, el serotipo 1 es responsable de los brotes de meningitis, donde el tipo de secuencia (ST) ST217, un tipo de secuencia extremadamente virulento, es dominante 10,11,12,13,14,15. Su importancia en la patología de la meningitis ha sido comparada con la de Neisseria meningitidis en el cinturón africano de la meningitis¹⁶. El serotipo 1 es a menudo la causa principal de la EPI; Sin embargo, rara vez se encuentra en el transporte. De hecho, en Gambia, este serotipo es responsable del 20% de todas las enfermedades invasivas, pero solo se encontró en el 0,5% de los portadores sanos^14,17,18,19. El intercambio genético y la recombinación en neumococos competentes ocurren generalmente en el transporte más que en la enfermedad invasiva²⁰. Además, se ha demostrado que el serotipo 1 tiene una de las tasas de transporte más cortas descritas entre los neumococos (solo 9 días). Por lo tanto, se ha propuesto que este serotipo podría tener una tasa de recombinación mucho menor que otros²¹.

Se necesitan estudios en profundidad para comprender la razón detrás de la baja tasa de transporte de las cepas del serotipo 1 y su importancia en la enfermedad invasiva en el África subsahariana.

Aquí informamos un protocolo que permite la mutagénesis de todo el genoma de una cepa particular del serotipo 1, 519/43. Esta cepa puede adquirir y recombinar fácilmente nuevo ADN en su genoma. Este método aún no está inter-cepa, pero es muy eficiente cuando se hace en 519/43 fondo (otros objetivos han sido mutados, manuscritos en preparación). Simplemente utilizando la cepa 519/43 y explotando su competencia natural, así como sustituyendo la forma en que se proporciona el ADN exógeno, pudimos mutar el gen de la neumolisina (ply) en esta cepa del serotipo 1. Este método representa una mejora respecto al presentado por Harvey et ^al.22 ya que se realiza en un solo paso sin necesidad de pasar el ADN a través de un serotipo diferente. Sin embargo, y debido a la variabilidad entre cepas, no se ha estandarizado ningún método para todas las cepas. La capacidad de mutar genes específicos y observar sus efectos permitirá una comprensión profunda de las cepas de S. pneumoniae del serotipo 1 y proporcionará respuestas para el papel de estas cepas en la meningitis en el África subsahariana.

Protocolo

1. Generación del amplicón mutante por SOE-PCR²³ y amplificación del casete de espectinomicina

1. Comience realizando PCR para la amplificación de los brazos de homología (ply 5' (488 pb) y ply3' (715 pb) respectivamente) de las regiones flanqueantes del gen ply de la cepa 519/43. Use imprimaciones plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGCGGATCC AGAACCAAACTTGTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTGTGTCTATATTTCG) y plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACCACC).
2. Utilice las siguientes condiciones de PCR para la capa 5': desnaturalización a 94 °C durante 60 s, paso 2: desnaturalización a 94 °C durante 30 s, paso 3: recocido a 58 °C durante 30 s, paso 4: extensión a 72 °C durante 30 s, paso 5: volver al paso 2 y repetir durante 35 ciclos, paso 6: extensión final a 72 °C durante 30 s.
   1. Utilice las mismas condiciones de PCR para ply3' con la excepción del tiempo de extensión en el paso 4 y el paso 6, donde debe ser de 60 s.
3. Analizar los productos de PCR mediante electroforesis en gel y extirpar el amplicón del gel.
4. Purificar los amplicones de PCR siguiendo el protocolo descrito en las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales).
5. Utilizar cantidades equimolares de ambos brazos de homología como plantillas en la SOE-PCR. Fusione los dos amplicones usando cebadores plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) y plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
6. Utilice las siguientes condiciones SOE-PCR (paso 1: desnaturalización a 94 °C durante 2 min, paso 2: desnaturalización a 94 °C durante 30 s, paso 3: recocido a 58 °C durante 30 s, paso 4: extensión a 68 °C durante 60 s, paso 5: volver al paso 2 y repetir durante 25 ciclos, paso 6: extensión final a 68 °C durante 90 s).
7. Analizar el producto SOE-PCR mediante electroforesis en gel. Extirparlo del gel con un kit de extracción en gel y seguir las instrucciones proporcionadas.
8. Amplificar el casete de espectinomicina del plásmido pR412 utilizando las siguientes condiciones de PCR: paso 1: desnaturalización a 94 °C durante 60 s, paso 2: desnaturalización a 94 °C durante 30 s, paso 3: recocido a 55 °C durante 30 s, paso 4: extensión a 68 °C durante 60 s, paso 5: volver al paso 2 y repetir durante 25 ciclos, paso 6: extensión final a 68 °C durante 60 s.
   1. Utilice cebadores BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) y BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). El plásmido pR412 fue adquirido del Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Universite Paul Sabatier Toulouse France).
9. Analizar los amplicones de PCR mediante electroforesis en gel. Extirpar y purificar el amplicón de PCR resultante como se describió anteriormente.

2. Generación del plásmido pSD1 y transformación química de E. coli Dh5α

1. Realizar una ligadura siguiendo las instrucciones del fabricante del sistema pGEMT-easy I (Tabla de Materiales). En un tubo de microcentrífuga, añadir 5 μL de tampón de ligadura 2x, 1 μL de pGEMTeasy, 2 μL del producto ply_SOE, 1 μL de ADN ligasa T4 y agua a un volumen total de 20 μL. Incubar durante la noche a 4 °C. Esto genera el plásmido pSD1.
2. Transformar E. coli Dh5α químicamente competente con pSD1. Comience incubando 50 μL de E. coli Dh5α químicamente competente con 3 μL de reacción de ligadura pSD1 durante 15 minutos en hielo. A continuación, continúe exponiendo las células a un choque térmico (42 °C, 30 s). Coloque las celdas en hielo durante 2 minutos.
3. Retire las células del hielo y agregue 350 μL de medios S.O.C. Incubar el cultivo durante 2 h a 37 °C, 120 rpm.
4. Placa de la transformación en agar Luria Bertani (LBA) suplementado con 0,4 mM de IPTG, 0,24 mg/ml de X-Gal para la selección azul/blanca y 100 μg/ml de ampicilina para asegurar que todas las colonias que crecen en la placa tengan la columna vertebral del plásmido. Las colonias blancas contienen pSD1.
5. Elija tres colonias blancas y establezca crecimientos durante la noche en 10 ml de LB, complementados con ampicilina de 100 μg / ml. Incubar los cultivos durante la noche a 37 °C con agitación.
6. Al día siguiente centrifugar los cultivos a 3.082 x g y utilizar el pellet para la extracción de plásmidos.

3. Extracción de ADN plásmido, digestión restrictiva del gen pSD1 y espectinomicina y ensamblaje de pSD2

1. Extraiga el ADN plásmido siguiendo las instrucciones proporcionadas con el kit comercial (Tabla de materiales).
2. Establezca una digestión de restricción BamHI tanto para el plásmido pSD1 como para el casete de espectinomicina previamente amplificado y purificado. Utilice las siguientes condiciones y cantidades descritas en la Tabla 1.
3. Incubar las reacciones de digestión restrictiva y los controles a 37 °C durante 3 h.
4. Analizar el digest de restricción por electroforesis, extirpar la banda y purificar siguiendo las instrucciones proporcionadas con el kit comercial (Tabla de Materiales).
5. A continuación, prepare una reacción de ligadura siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales) utilizando la pSD1 digerida por BamHI y la espectinomicina (a partir del paso 3.2). En un tubo de microcentrífuga, añadir los siguientes componentes de reacción: 5 μL de tampón de ligadura 2x, 2 μL de pSD1, 2 μL de casete de espectinomicina, 1 μL de ADN ligasa T4 e incubar durante la noche a 4 °C. Esto genera el plásmido pSD2.
6. Transformar el plásmido pSD2 en E. coli Dh5α químicamente competente como se describe en el paso 2.2.
7. Seleccione los transformadores que transportan plásmido pSD2 en función de su capacidad para crecer en LBA suplementado con 100 μg/ml de espectinomicina y ampicilina.
8. Realice una extracción de ADN plásmido (pSD2) como se describe anteriormente y siguiendo las instrucciones del fabricante (μL).

4. Transformación de la cepa 519/43 de S. pneumoniae

1. Preparar un cultivo nocturno de S. pneumoniae 519/43 en BHI y dejar que crezca estáticamente a 37 °C, 5% CO₂.
2. Al día siguiente diluir los cultivos 1:50 y 1:100 en 10 mL de caldo fresco de BHI. Incubar los cultivos estáticamente a 37 °C hasta que el OD_595nm esté entre 0,05 y 0,1 (adquisición óptima de ADN más cercana a 0,1 OD).
3. Una vez que se alcanza un OD de 0,1, tomar 860 μL y transferir a un tubo de microcentrífuga. En este mismo tubo de microcentrífuga añadir: 100 μL de NaOH de 100 mM, 10 μL de BSA al 20% (p/v), 10 μL de CaCl 2 de 100 mM,₂ μL de CSP1 de 50 ng/mL de²⁴ y 500 ng de pSD2.
4. Incubar la reacción estáticamente a 37 °C durante 3 h.
5. Placa 330 μL en placas de agar sangre al 5% (BA) suplementadas con espectinomicina de 100 μg/ml, cada hora durante las 3 horas de incubación.
6. Incubar las placas durante la noche a 37 °C, 5%_CO2. Parche colonias resistentes a la espectromicina en otra placa BA suplementada con 100 μg/ml de espectinomicina, así como en placas BA suplementadas con 100 μg/ml de ampicilina. Incubar ambos juegos de placas durante la noche en las condiciones indicadas anteriormente. Las placas de ampicilina son para probar la presencia de la columna vertebral del plásmido.
7. Confirmar la presencia del casete de espectinomicina mediante PCR utilizando cebadores plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) y SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Confirmar la mutación mediante PCR utilizando cebadores plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) y plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) que se adhieren fuera de la región mutada.
8. Confirmar la integración en la correcta localización del genoma mediante secuenciación mediante cebadores plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), así como cebadores con su sitio de unión en el casete de espectinomicina sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG) y spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Resultados

El protocolo descrito aquí comienza utilizando PCR para amplificar los brazos de homología izquierda y derecha, mientras que simultáneamente elimina 191 pb de la región media del gen ply . Durante la realización de la PCR se introduce un sitio BamHI en los 3' del brazo de homología izquierdo y en el extremo 5' del brazo de homología derecho (Figura 1A). Esto es seguido por PCR-SOE donde los brazos de homología izquierda y derecha se fusionan en un amplicón (

Discusión

Streptococcus pneumoniae, en particular el serotipo 1, sigue siendo una amenaza mundial que causa enfermedad neumocócica invasiva y meningitis. A pesar de la introducción de varias vacunas que deberían ser protectoras contra el serotipo 1, en África, este serotipo todavía es capaz de causar brotes que conducen a una alta morbilidad y mortalidad¹³. La capacidad de manipular genéticamente este serotipo es de importancia crítica debido a su relevancia clínica. El método descrito en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase	Invitrogen	12344024	Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base	Oxoid	CM0055	Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine	sigma	55470	used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135	used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2	Sigma	449709	used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1	AnaSpec	AS-63779	used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar	Gibco	22700025	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation)	Gibco	12795027	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit	NEB	T1020S	Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy	Promega	A1360	used as suicide plasmid
S.O.C.	Invitrogen	15544034	used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S0899	used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride	SigmaAldrich	PHR1426	Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265017	used for the creation of pSD1 and pSD2