Costruzione di mutanti nel sierotipo 1 Streptococcus pneumoniae ceppo 519/43

Riepilogo

Qui, descriviamo un sierotipo 1 di S. pneumoniae ceppo 519/43 che può essere geneticamente modificato utilizzando la sua capacità di acquisire naturalmente DNA e un plasmide suicida. Come prova di principio, è stato creato un mutante isogeno nel gene della pneumolisina (compensato).

Abstract

Il sierotipo 1 di Streptococcus pneumoniae rimane un problema enorme nei paesi a basso e medio reddito, in particolare nell'Africa sub-sahariana. Nonostante la sua importanza, gli studi su questo sierotipo sono stati ostacolati dalla mancanza di strumenti genetici per modificarlo. In questo studio, descriviamo un metodo per modificare geneticamente un isolato clinico del sierotipo 1 (ceppo 519/43). È interessante notare che questo è stato ottenuto sfruttando la capacità dello Pneumococco di acquisire naturalmente il DNA. Tuttavia, a differenza della maggior parte degli pneumococchi, l'uso del DNA lineare non ha avuto successo; Per mutare questo importante ceppo, è stato necessario utilizzare un plasmide suicida. Questa metodologia ha fornito i mezzi per una comprensione più profonda di questo sierotipo elusivo, sia in termini di biologia che di patogenicità. Per convalidare il metodo, la principale tossina pneumococcica conosciuta, la pneumolisina, è stata mutata perché ha un fenotipo ben noto e facile da seguire. Abbiamo dimostrato che il mutante, come previsto, ha perso la sua capacità di lisare i globuli rossi. Essendo in grado di mutare un gene importante nel sierotipo di interesse, siamo stati in grado di osservare diversi fenotipi per la perdita di funzione mutanti su infezioni intraperitoneali e intranasali da quelli osservati per altri sierotipi. In sintesi, questo studio dimostra che il ceppo 519/43 (sierotipo 1) può essere geneticamente modificato.

Introduzione

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, lo pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità a livello globale. Fino a poco tempo fa, sono stati scoperti quasi 100 sierotipi di S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ogni anno, la malattia pneumococcica invasiva (IPD) rivendica circa 700.000 decessi, di bambini di età inferiore ai 5 anni⁸. S. pneumoniae è la principale causa di polmonite batterica, otite media, meningite e setticemia in tutto il mondo⁹.

Nella cintura africana della meningite, il sierotipo 1 è responsabile delle epidemie di meningite, dove il tipo di sequenza (ST) ST217, un tipo di sequenza estremamente virulento, è dominante 10,11,12,13,14,15. La sua importanza nella patologia della meningite è stata paragonata a quella di Neisseria meningitidis nella cintura africana della meningite¹⁶. Il sierotipo 1 è spesso la causa principale dell'IPD; tuttavia, si trova molto raramente in carrozza. Infatti, in Gambia, questo sierotipo è responsabile del 20% di tutte le malattie invasive, ma è stato trovato solo nello 0,5% dei portatori sani^14,17,18,19. Lo scambio genetico e la ricombinazione negli pneumococchi competenti avvengono generalmente nel trasporto piuttosto che nella malattia invasiva²⁰. Inoltre, il sierotipo 1 ha dimostrato di avere uno dei tassi di trasporto più brevi descritti tra gli pneumococchi (solo 9 giorni). Pertanto, è stato proposto che questo sierotipo potrebbe avere un tasso di ricombinazione molto più basso rispetto ad altri²¹.

Sono necessari studi approfonditi per comprendere il motivo del basso tasso di trasporto dei ceppi del sierotipo 1 e la sua importanza nelle malattie invasive nell'Africa sub-sahariana.

Qui riportiamo un protocollo che consente la mutagenesi genome-wide di un particolare ceppo di sierotipo 1, 519/43. Questo ceppo può facilmente acquisire e ricombinare nuovo DNA nel suo genoma. Questo metodo non è ancora inter-sforzo, ma è molto efficiente se fatto in background 519/43 (altri obiettivi sono stati mutati, manoscritti in preparazione). Semplicemente utilizzando il ceppo 519/43 e sfruttando la sua competenza naturale, oltre a sostituire il modo in cui viene fornito il DNA esogeno, siamo stati in grado di mutare il gene della pneumolisina (ply) in questo ceppo sierotipo 1. Questo metodo rappresenta un miglioramento rispetto a quello presentato da Harvey et ^al.22 in quanto viene fatto in un unico passaggio senza la necessità di far passare il DNA attraverso un sierotipo diverso. Tuttavia, e a causa della variabilità tra i ceppi, nessun metodo è stato standardizzato per tutti i ceppi. La capacità di mutare geni specifici e osservarne gli effetti permetterà una profonda comprensione dei ceppi di sierotipo 1 S. pneumoniae e fornirà risposte per il ruolo di questi ceppi nella meningite nell'Africa sub-sahariana.

Protocollo

1. Generazione dell'amplicone mutante mediante SOE-PCR²³ e amplificazione della cassetta della spectinomicina

1. Inizia eseguendo la PCR per l'amplificazione dei bracci di omologia (ply 5' (488 bp) e ply3' (715 bp) rispettivamente) delle regioni fiancheggianti del gene ply dal ceppo 519/43. Utilizzare primer plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCCCATTTTCTACCTTATCCTACC).
2. Utilizzare le seguenti condizioni PCR per ply5': denaturazione a 94 °C per 60 s, fase 2: denaturazione a 94 °C per 30 s, fase 3: ricottura a 58 °C per 30 s, fase 4: estensione a 72 °C per 30 s, fase 5: tornare alla fase 2 e ripetere per 35 cicli, fase 6: estensione finale a 72 °C per 30 s.
   1. Utilizzare le stesse condizioni PCR per ply3' ad eccezione del tempo di estensione al punto 4 e al passaggio 6 dove dovrebbe essere di 60 s.
3. Analizzare i prodotti PCR mediante elettroforesi su gel e asportare l'amplicone dal gel.
4. Purificare gli ampliconi PCR seguendo il protocollo descritto nelle istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
5. Utilizzare quantità equimolari di entrambi i bracci di omologia come modelli nella SOE-PCR. Fondere i due ampliconi usando primer plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) e plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTACCTTATCCTCTACC).
6. Utilizzare le seguenti condizioni SOE-PCR (fase 1: denaturazione a 94 °C per 2 minuti, fase 2: denaturazione a 94 °C per 30 s, fase 3: ricottura a 58 °C per 30 s, fase 4: estensione a 68 °C per 60 s, fase 5: tornare alla fase 2 e ripetere per 25 cicli, fase 6: estensione finale a 68 °C per 90 s).
7. Analizzare il prodotto SOE-PCR mediante elettroforesi su gel. Prelevarlo dal gel utilizzando un kit di estrazione del gel e seguire le istruzioni fornite.
8. Amplificare la cassetta di spectinomicina dal plasmide pR412 utilizzando le seguenti condizioni PCR: fase 1: denaturazione a 94 °C per 60 s, fase 2: denaturazione a 94 °C per 30 s, fase 3: ricottura a 55 °C per 30 s, fase 4: estensione a 68 °C per 60 s, fase 5: tornare al punto 2 e ripetere per 25 cicli, fase 6: estensione finale a 68 °C per 60 s.
   1. Utilizzare primer BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) e BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC). Il plasmide pR412 è stato acquisito dal Dr. Marc PrudHomme (CNRS-Université Paul Sabatier Tolosa Francia).
9. Analizzare gli ampliconi della PCR mediante elettroforesi su gel. Accisare e purificare l'amplicone PCR risultante come descritto sopra.

2. Generazione di plasmide pSD1 e trasformazione chimica di E. coli Dh5α

1. Eseguire una legatura seguendo le istruzioni del produttore del sistema pGEMT-easy I (Tabella dei materiali). In una provetta per microcentrifuga, aggiungere 5 μL di tampone di legatura 2x, 1 μL di pGEMTeasy, 2 μL di prodotto ply_SOE, 1 μL di T4 DNA ligasi e acqua per un volume totale di 20 μL. Incubare per una notte a 4 °C. Questo genera plasmide pSD1.
2. Trasformare E. coli Dh5α chimicamente competente con pSD1. Inizia incubando 50 μL di E. coli Dh5α chimicamente competente con 3 μL di reazione di legatura pSD1 per 15 minuti su ghiaccio. Quindi continuare esponendo le cellule a shock termico (42 °C, 30 s). Mettere le celle sul ghiaccio per 2 minuti.
3. Rimuovere le cellule dal ghiaccio e aggiungere 350 μL di media S.O.C. Incubare la coltura per 2 ore a 37 °C, 120 giri/min.
4. Placcare la trasformazione su Luria Bertani Agar (LBA) integrata con 0,4 mM IPTG, 0,24 mg/mL X-Gal per la selezione blu/bianco e 100 μg/mL di ampicillina per garantire che tutte le colonie che crescono nella piastra abbiano la spina dorsale plasmidica. Le colonie bianche contengono pSD1.
5. Scegli tre colonie bianche e imposta crescite notturne in 10 ml di LB, integrate con 100 μg / mL di ampicillina. Incubare le colture per una notte a 37 °C agitando.
6. Il giorno successivo centrifugare le colture a 3.082 x g e utilizzare il pellet per l'estrazione del plasmide.

3. Estrazione del DNA plasmide, digestione di restrizione del gene pSD1 e spectinomicina e assemblaggio di pSD2

1. Estrarre il DNA plasmidico seguendo le istruzioni fornite con il kit commerciale (Table of Materials).
2. Impostare una digestione a restrizione BamHI sia per il plasmide pSD1 che per la cassetta di spectinomicina precedentemente amplificata e purificata. Utilizzare le seguenti condizioni e quantità descritte nella tabella 1.
3. Incubare le reazioni di digestione di restrizione e controllare a 37 °C per 3 ore.
4. Analizzare il digesto di restrizione mediante elettroforesi, asportare la fascia e purificare seguendo le istruzioni fornite con il kit commerciale (Table of Materials).
5. Quindi, preparare una reazione di legatura seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali) utilizzando la pSD1 digerita da BamHI e la spectinomicina (dal punto 3.2). In una provetta da microcentrifuga, aggiungere i seguenti componenti di reazione: 5 μL di tampone di legatura 2x, 2 μL di pSD1, 2 μL di cassetta di spectinomicina, 1 μL di T4 DNA ligasi e incubare per una notte a 4 °C. Questo genera plasmide pSD2.
6. Trasformare il plasmide pSD2 in E. coli Dh5α chimicamente competente come descritto nella fase 2.2.
7. Selezionare i trasformanti portatori di plasmide pSD2 in base alla loro capacità di crescere in LBA integrato con 100 μg/ml di spectinomicina e ampicillina.
8. Eseguire un'estrazione del DNA plasmidico (pSD2) come descritto sopra e seguendo le istruzioni del produttore (μL).

4. Trasformazione del ceppo di S. pneumoniae 519/43

1. Preparare una coltura notturna di S. pneumoniae 519/43 in BHI e lasciarlo crescere staticamente a 37 °C, 5% CO₂.
2. Il giorno seguente diluire le colture 1:50 e 1:100 in 10 ml di brodo fresco BHI. Incubare le colture staticamente a 37 °C fino a quando l'OD_595nm è compreso tra 0,05 e 0,1 (acquisizione ottimale del DNA più vicina a 0,1 OD).
3. Una volta raggiunto un OD di 0,1, prendere 860 μL e trasferirli in una provetta per microcentrifuga. In questo stesso tubo di microcentrifuga aggiungere: 100 μL di 100 mM NaOH, 10 μL di 20% (p/v) BSA, 10 μL di 100 mM CaCl 2,₂ μL di 50 ng/mL CSP1²⁴ e 500 ng di pSD2.
4. Incubare la reazione staticamente a 37 °C per 3 ore.
5. Piastra 330 μL su piastre di agar sangue al 5% (BA) integrate con 100 μg/mL di spectinomicina, ogni ora durante le 3 ore di incubazione.
6. Incubare le piastre per una notte a 37 °C, 5% CO₂. Patch colonie resistenti alla spectinomicina su un'altra piastra BA integrata con 100 μg/mL di spectinomicina e su piastre di BA integrate con 100 μg/mL di ampicillina. Incubare entrambi i set di piastre durante la notte nelle condizioni sopra indicate. Le piastre di ampicillina devono verificare la presenza della spina dorsale plasmide.
7. Confermare la presenza della cassetta di spectinomicina mediante PCR utilizzando primer plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) e SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Confermare la mutazione mediante PCR utilizzando i primer plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) e plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) che si attaccano al di fuori della regione mutata.
8. Confermare l'integrazione nella corretta posizione del genoma mediante sequenziamento utilizzando primer plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), nonché primer con il loro sito di legame nella cassetta spectinomicina sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAGA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) e spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Risultati

Il protocollo qui descritto inizia utilizzando la PCR per amplificare i bracci di omologia sinistro e destro, eliminando contemporaneamente 191 bp dalla regione centrale del gene ply . Durante l'esecuzione della PCR viene introdotto un sito BamHI al 3' del braccio di omologia sinistro e all'estremità 5' del braccio di omologia destro (Figura 1A). Questo è seguito da PCR-SOE dove i bracci di omologia sinistro e destro sono fusi in un unico amplicone (Figura 1B<...

Discussione

Streptococcus pneumoniae, in particolare il sierotipo 1, continua ad essere una minaccia globale che causa malattie invasive da pneumococco e meningite. Nonostante l'introduzione di vari vaccini che dovrebbero essere protettivi contro il sierotipo 1, in Africa, questo sierotipo è ancora in grado di causare epidemie che portano ad alta morbilità e mortalit๳. La capacità di manipolare geneticamente questo sierotipo è di fondamentale importanza a causa della sua rilevanza clinica. Il ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase	Invitrogen	12344024	Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base	Oxoid	CM0055	Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine	sigma	55470	used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135	used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2	Sigma	449709	used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1	AnaSpec	AS-63779	used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar	Gibco	22700025	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation)	Gibco	12795027	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit	NEB	T1020S	Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy	Promega	A1360	used as suicide plasmid
S.O.C.	Invitrogen	15544034	used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S0899	used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride	SigmaAldrich	PHR1426	Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265017	used for the creation of pSD1 and pSD2