בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

Summary

כאן אנו מתארים זן סרוטיפ 1 של S. pneumoniae serotype 1 519/43 שניתן להנדס גנטית באמצעות יכולתו לרכוש באופן טבעי DNA ופלסמיד מתאבד. כהוכחה עקרונית נוצרה מוטציה איזוגנית בגן הפנאומוליזין (ply).

Abstract

Streptococcus pneumoniae serotype 1 נותר בעיה עצומה במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה. למרות חשיבותו, מחקרים בסרוטיפ זה עוכבו על ידי היעדר כלים גנטיים כדי לשנות אותו. במחקר זה אנו מתארים שיטה לשינוי גנטי של איזולט קליני של סרוטיפ 1 (זן 519/43). באופן מעניין, זה הושג על ידי ניצול יכולתו של הפנאומוקוק לרכוש דנ"א באופן טבעי. עם זאת, בניגוד לרוב הפנאומוקוקים, השימוש בדנ"א ליניארי לא היה מוצלח; כדי לשנות את הזן החשוב הזה, היה צורך להשתמש בפלסמיד מתאבד. מתודולוגיה זו סיפקה את האמצעים להבנה עמוקה יותר של סרוטיפ חמקמק זה, הן מבחינת הביולוגיה והן מבחינת הפתוגנים שלו. כדי לאמת את השיטה, הרעלן העיקרי הידוע של פנאומוקוק, פנאומוליזין, עבר מוטציה מכיוון שיש לו פנוטיפ ידוע וקל למעקב. הראינו שהמוטציה, כצפוי, איבדה את יכולתה ללדת תאי דם אדומים. על ידי היכולת לבצע מוטציה בגן חשוב בסרוטיפ המעניין, הצלחנו לצפות בפנוטיפים שונים לאובדן מוטציות תפקודיות בזיהומים תוך צפקיים ותוך אפיים מאלה שנצפו עבור סרוטיפים אחרים. לסיכום, מחקר זה מוכיח כי זן 519/43 (סרוטיפ 1) יכול להיות מהונדס גנטית.

Introduction

סטרפטוקוקוס דלקת ריאות (S. pneumoniae, הפנאומוקוקוס) הוא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם. עד לאחרונה התגלו קרוב ל-100 סרוטיפים של S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. מדי שנה, מחלת פנאומוקוק פולשנית (IPD) טוענת לכ -700,000 מקרי מוות, של ילדים מתחת לגיל^{5 שנים 8}. S. pneumoniae הוא הגורם העיקרי לדלקת ריאות חיידקית, דלקת אוזניים, דלקת קרום המוח ואלח דם ברחבי העולם⁹.

בחגורת דלקת קרום המוח האפריקאית, סרוטיפ 1 אחראי להתפרצויות דלקת קרום המוח, כאשר סוג הרצף (ST) ST217, סוג רצף אלים ביותר, דומיננטי 10,11,12,13,14,15. חשיבותו בפתולוגיה של דלקת קרום המוח הושוותה לזו של Neisseria meningitidis בחגורת דלקת קרום המוח האפריקאית¹⁶. סרוטיפ 1 הוא לעתים קרובות הגורם העיקרי ל- IPD; עם זאת, הוא נמצא לעתים רחוקות מאוד בכרכרה. למעשה, בגמביה, סרוטיפ זה אחראי ל -20% מכלל המחלות הפולשניות, אך הוא נמצא רק ב -0.5% מהנשאים הבריאים ^14,17,18,19. החלפה גנטית ורקומבינציה בפנאומוקוקים מוסמכים מתרחשת בדרך כלל בהובלה ולא במחלה פולשנית²⁰. יתר על כן, סרוטיפ 1 הוכח כאחד משיעורי ההובלה הקצרים ביותר המתוארים בקרב פנאומוקוקים (9 ימים בלבד). לכן, הוצע כי סרוטיפ זה עשוי להיות בעל שיעור רקומבינציה נמוך בהרבה מאחרים²¹.

יש צורך במחקרי עומק כדי להבין את הסיבה לשיעור ההובלה הנמוך של זני סרוטיפ 1 ואת חשיבותו במחלות פולשניות באפריקה שמדרום לסהרה.

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול המאפשר מוטגנזה כלל-גנומית של זן סרוטיפ 1 מסוים, 519/43. זן זה יכול בקלות לרכוש ולשלב מחדש דנ"א חדש בגנום שלו. שיטה זו עדיין אינה בין-זנית, אך היא יעילה מאוד כאשר היא נעשית ברקע 519/43 (מטרות אחרות עברו מוטציה, כתבי יד בהכנה). פשוט על ידי שימוש בזן 519/43, וניצול היכולת הטבעית שלו, כמו גם החלפת האופן שבו הדנ"א האקסוגני מסופק, הצלחנו לשנות את הגן pneumolysin (ply) בזן סרוטיפ 1 זה. שיטה זו מייצגת שיפור מזה שהוצג על ידי Harvey et ^al.22 כפי שהוא נעשה בשלב אחד ללא צורך להעביר את הדנ"א דרך סרוטיפ אחר. עם זאת, ובשל השונות בין הזנים, אף שיטה לא תוקנה לכל הזנים. היכולת לבצע מוטציה בגנים ספציפיים ולצפות בהשפעותיהם תאפשר הבנה מעמיקה של זני סרוטיפ 1 S. pneumoniae ותספק תשובות לתפקידם של זנים אלה בדלקת קרום המוח באפריקה שמדרום לסהרה.

Protocol

1. יצירת אמפליקון מוטציה על ידי SOE-PCR²³ והגברה של קלטת ספקטינומיצין

1. התחל בביצוע PCR להגברה של זרועות ההומולוגיה (ply 5' (488 bp) ו- ply3' (715 bp) בהתאמה) של אזורי האיגוף של גן הרובד מזן 519/43. השתמש פריימרים plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGCCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTC) ו- plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTACCTTATCCTCTACC).
2. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים עבור ply5': דנטורציה ב-94°C למשך 60 שניות, שלב 2: דנטורציה ב-94°C למשך 30 שניות, שלב 3: חישול ב-58°C למשך 30 שניות, שלב 4: הארכה ב-72°C למשך 30 שניות, שלב 5: חזור לשלב 2 וחזור על הפעולה במשך 35 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב-72°C למשך 30 שניות.
   1. השתמש באותם תנאי PCR עבור ply3' למעט זמן ההארכה בשלב 4 ושלב 6 שבו הוא אמור להיות 60 שניות.
3. לנתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל הבלו את אמפליקון מן הג'ל.
4. לטהר את אמפליקוני ה-PCR בהתאם לפרוטוקול המתואר בהוראות היצרן (טבלת חומרים).
5. השתמש בכמויות שוות ערך של שתי זרועות ההומולוגיה כתבניות ב- SOE-PCR. התיך את שני האמפליקונים באמצעות פריימרים plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ו- plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTTTACCTTATCCTCTACC).
6. השתמש בתנאי SOE-PCR הבאים (שלב 1: דנטורינג ב 94 ° C במשך 2 דקות, שלב 2: denaturing ב 94 ° C במשך 30 שניות, שלב 3: חישול 58 ° C עבור 30 שניות, שלב 4: הארכה ב 68 ° C עבור 60 שניות, שלב 5: לחזור לשלב 2 ולחזור במשך 25 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב 68 ° C עבור 90 שניות).
7. לנתח את המוצר SOE-PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל. הבלו אותו מן הג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל ופעל לפי ההוראות שסופקו.
8. הגבירו את קלטת הספקטינומיצין מפלסמיד pR412 באמצעות תנאי ה-PCR הבאים: שלב 1: דנטורינג ב-94 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 2: דנטורינג ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, שלב 3: חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, שלב 4: הארכה ב-68 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 5: חזור לשלב 2 וחזור על הפעולה במשך 25 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב-68°C למשך 60 שניות.
   1. השתמש פריימרים BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC CC) ו- BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG ATC). פלסמיד pR412 נרכשה מד"ר מארק פרודהום (CNRS-Universite Paul Sabatier, טולוז, צרפת).
9. לנתח את אמפליקונים PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל. הבלו ולטהר את אמפליקון PCR המתקבל כמתואר לעיל.

2. יצירת פלסמיד pSD1 וטרנספורמציה כימית של E. coli Dh5α

1. ביצוע קשירה בהתאם להוראות היצרן של מערכת pGEMT-easy I (טבלת חומרים). בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף 5 μL של 2x חיץ קשירה, 1 μL של pGEMTeasy, 2 μL של המוצר ply_SOE, 1 μL של T4 DNA ligase ומים לנפח כולל של 20 μL. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F). זה מייצר פלסמיד pSD1.
2. הפוך E. coli Dh5α בעל יכולת כימית עם pSD1. התחל על ידי דגירה של 50 μL של E. coli Dh5α בעל כשירות כימית עם 3 μL של תגובת קשירה pSD1 למשך 15 דקות על קרח. לאחר מכן המשך על ידי חשיפת התאים להלם תרמי (42 ° C, 30 שניות). מניחים את התאים על קרח למשך 2 דקות.
3. הסר את התאים מקרח והוסף 350 μL של מדיה S.O.C. לדגור את התרבות במשך 2 שעות ב 37 ° C, 120 סל"ד.
4. צלחת את השינוי על לוריא ברטאני אגר (LBA) בתוספת 0.4 mM IPTG, 0.24 מ"ג / מ"ל X-Gal עבור בחירה כחול/לבן ו 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין כדי להבטיח שכל המושבות הגדלות בצלחת יש את עמוד השדרה פלסמיד. מושבות לבנות מכילות pSD1.
5. בחרו שלוש מושבות לבנות והקימו גידולי לילה ב-10 מ"ל ליברות, בתוספת אמפיצילין של 100 מיקרוגרם/מ"ל. לדגור על התרביות במשך הלילה ב 37 °C (77 °F) עם רעידות.
6. למחרת צנטריפוגו את התרביות בגודל 3,082 x גרם והשתמשו בגלולה להפקת פלסמיד.

3. מיצוי DNA פלסמיד, הגבלת עיכול הגן pSD1 וספקטינומיצין והרכבת pSD2

1. לחלץ את DNA פלסמיד בהתאם להוראות שסופקו עם הערכה המסחרית (טבלה של חומרים).
2. הגדר עיכול הגבלת BamHI הן עבור פלסמיד pSD1 והן עבור קלטת ספקטינומיצין שהוגברה וטוהרה בעבר. השתמש בתנאים ובכמויות הבאים המתוארים בטבלה 1.
3. לדגור את הגבלת העיכול תגובות ובקרות ב 37 ° C במשך 3 שעות.
4. לנתח את העיכול הגבלה על ידי אלקטרופורזה, הבלו את הרצועה ולטהר בהתאם להוראות שסופקו עם הערכה המסחרית (טבלה של חומרים).
5. לאחר מכן, הכינו תגובת קשירה בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים) באמצעות pSD1 וספקטינומיצין מעוכל BamHI (משלב 3.2). בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף את רכיבי התגובה הבאים: 5 μL של 2x חיץ קשירה, 2 μL pSD1, 2 μL של קלטת ספקטינומיצין, 1 μL של T4 DNA ligase ודגור לילה ב 4 ° C. זה מייצר פלסמיד pSD2.
6. הפוך פלסמיד pSD2 ל- E. coli Dh5α בעל יכולת כימית כמתואר בשלב 2.2.
7. בחר את הטרנספורמנטים הנושאים פלסמיד pSD2 בהתבסס על יכולתם לגדול ב- LBA בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל של ספקטינומיצין ואמפיצילין.
8. ביצוע מיצוי DNA פלסמיד (pSD2) כמתואר לעיל ובהתאם להוראות היצרן (μL).

4. טרנספורמציה של זן S. pneumoniae 519/43

1. הכינו תרבית לילה של S. pneumoniae 519/43 ב- BHI ואפשרו לו לגדול באופן סטטי ב 37 °C, 5% CO₂.
2. למחרת לדלל את התרביות 1:50 ו 1:100 ב 10 מ"ל של מרק BHI טרי. לדגור על התרביות באופן סטטי ב 37 ° C עד OD_595nm הוא בין 0.05 ל 0.1 (רכישה אופטימלית של DNA קרוב יותר 0.1 OD).
3. ברגע שמגיעים ל-OD של 0.1, לוקחים 860 μL ומעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה. באותו צינור מיקרוצנטריפוגה להוסיף: 100 μL של 100 mM NaOH, 10 μL של 20% (w/v) BSA, 10 μL של 100 mM CaCl 2,₂ μL של 50 ng/mL CSP1²⁴ ו 500 ng של pSD2.
4. לדגור את התגובה באופן סטטי ב 37 ° C במשך 3 שעות.
5. צלחת 330 μL על 5% צלחות אגר דם (BA) בתוספת ספקטינומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, כל שעה במשך 3 שעות הדגירה.
6. לדגור על צלחות לילה ב 37 ° C, 5% CO₂. מושבות עמידות בפני ספקטינומיצין טלאי על צלחת BA אחרת בתוספת ספקטינומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל וכן על לוחות BA בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. יש לדגור על שתי מערכות הצלחות למשך הלילה בתנאים שצוינו לעיל. לוחות ampicillin הם לבדוק את נוכחותו של עמוד השדרה פלסמיד.
7. אשר את נוכחותה של קלטת spectinomycin על ידי PCR באמצעות פריימרים plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) ו- SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). אשר את המוטציה על ידי PCR באמצעות פריימרים plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) ו- plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) המתחברים מחוץ לאזור שעבר מוטציה.
8. אשר את האינטגרציה במיקום הנכון של הגנום על ידי ריצוף באמצעות פריימרים plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), כמו גם פריימרים עם אתר הקישור שלהם בקלטת spectinomycin sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) ו- spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מתחיל בשימוש ב- PCR כדי להגביר את זרועות ההומולוגיה השמאלית והימנית, תוך מחיקת 191 bp מהאזור האמצעי של גן הרובד . בעת ביצוע ה-PCR מציגים אתר BamHI ב-3' של זרוע ההומולוגיה השמאלית ובקצה ה-5' של זרוע ההומולוגיה הימנית (איור 1A). אחריו מגיע PCR-SOE, שבו זרועות הומולוגי...

Discussion

דלקת ריאות סטרפטוקוקוס, במיוחד סרוטיפ 1, ממשיכה להוות איום עולמי הגורם למחלת פנאומוקוק פולשנית ולדלקת קרום המוח. למרות הכנסת חיסונים שונים שאמורים להגן מפני סרוטיפ 1, באפריקה סרוטיפ זה עדיין מסוגל לגרום להתפרצויות שיובילו לתחלואה ותמותה גבוהה¹³. היכולת לבצע מניפולציה גנט...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase	Invitrogen	12344024	Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base	Oxoid	CM0055	Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine	sigma	55470	used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135	used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2	Sigma	449709	used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1	AnaSpec	AS-63779	used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar	Gibco	22700025	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation)	Gibco	12795027	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit	NEB	T1020S	Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy	Promega	A1360	used as suicide plasmid
S.O.C.	Invitrogen	15544034	used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S0899	used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride	SigmaAldrich	PHR1426	Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265017	used for the creation of pSD1 and pSD2