Конструирование мутантов серотипа 1 Streptococcus pneumoniae штамма 519/43

Резюме

Здесь мы описываем штамм S. pneumoniae серотипа 1 519/43, который может быть генетически модифицирован, используя его способность естественным образом приобретать ДНК и плазмиду самоубийства. В качестве доказательства принципа был получен изогенный мутант в гене пневмолизина (ply).

Аннотация

Streptococcus pneumoniae серотипа 1 остается огромной проблемой в странах с низким и средним уровнем дохода, особенно в странах Африки к югу от Сахары. Несмотря на его важность, исследования этого серотипа были затруднены из-за отсутствия генетических инструментов для его модификации. В этом исследовании мы описываем метод генетической модификации клинического изолята серотипа 1 (штамм 519/43). Интересно, что это было достигнуто за счет использования способности пневмококка естественным образом приобретать ДНК. Однако, в отличие от большинства пневмококков, использование линейной ДНК не было успешным; Чтобы мутировать этот важный штамм, пришлось использовать плазмиду самоубийства. Эта методология предоставила средства для более глубокого понимания этого неуловимого серотипа, как с точки зрения его биологии, так и патогенности. Чтобы проверить метод, основной известный пневмококковый токсин, пневмолизин, был мутирован, потому что он имеет хорошо известный и простой для понимания фенотип. Мы показали, что мутант, как и ожидалось, утратил способность лизировать эритроциты. Имея возможность мутировать важный ген в интересующем серотипе, мы смогли наблюдать различные фенотипы мутантов потери функции при внутрибрюшинных и интраназальных инфекциях от тех, которые наблюдались для других серотипов. Таким образом, это исследование доказывает, что штамм 519/43 (серотип 1) может быть генетически модифицирован.

Введение

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, пневмококк) является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. До недавнего времени было обнаружено около 100 серотипов S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. Ежегодно инвазивная пневмококковая инфекция (ИПД) уносит около 700 000 смертей детей в возрасте до 5 лет⁸. S. pneumoniae является основной причиной бактериальной пневмонии, среднего отита, менингита и сепсиса во всем мире⁹.

В африканском менингитном поясе серотип 1 ответственен за вспышки менингита, где доминирует тип последовательности (ST) ST217, чрезвычайно вирулентный тип последовательности 10,11,12,13,14,15. Его значение в патологии менингита было сравнимо с значением Neisseria meningitidis в африканском менингитном поясе¹⁶. Серотип 1 часто является основной причиной ИПД; Однако он очень редко встречается в карете. Фактически, в Гамбии на этот серотип приходится 20% всех инвазивных заболеваний, но он был обнаружен только у 0,5% здоровых носителей^14,17,18,19. Генетический обмен и рекомбинация у компетентных пневмококков происходит, как правило, при носительстве, а не при инвазивном заболевании²⁰. Кроме того, было показано, что серотип 1 имеет одну из самых коротких частот носительства, описанных среди пневмококков (всего 9 дней). Поэтому было высказано предположение, что этот серотип может иметь гораздо более низкую скорость рекомбинации, чем другие²¹.

Необходимы углубленные исследования, чтобы понять причину низкой скорости носительства штаммов серотипа 1 и ее значение для инвазивных заболеваний в странах Африки к югу от Сахары.

Здесь мы сообщаем о протоколе, который позволяет проводить полногеномный мутагенез конкретного штамма серотипа 1, 519/43. Этот штамм может легко приобретать и рекомбинировать новую ДНК в свой геном. Этот метод еще не является межштаммовым, но он очень эффективен, когда выполняется в фоновом режиме 519/43 (другие мишени были мутированы, рукописи готовятся). Просто используя штамм 519/43 и используя его естественную компетенцию, а также заменяя способ обеспечения экзогенной ДНК, мы смогли мутировать ген пневмолизина (слой) в этом штамме серотипа 1. Этот метод представляет собой усовершенствование по сравнению с методом, представленным Harvey et ^al.22 , поскольку он выполняется в один этап без необходимости прохождения ДНК через другой серотип. Тем не менее, из-за межштаммовой изменчивости ни один метод не был стандартизирован для всех штаммов. Способность мутировать определенные гены и наблюдать за их эффектами позволит глубже понять штаммы S. pneumoniae серотипа 1 и даст ответы на вопросы о роли этих штаммов в менингите в странах Африки к югу от Сахары.

протокол

1. Генерация мутирующего ампликона методом СОЭ-ПЦР²³ и амплификация кассеты спектиномицина

1. Начните с проведения ПЦР для амплификации плеч гомологии (ply 5' (488.н.) и ply3' (715.н.) соответственно) фланкирующих областей ply гена штамма 519/43. Используйте праймеры plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGAGGCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATTCG) и plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCCCTTCTACCTTATCCTCTACC).
2. Используйте следующие условия ПЦР для ply5': денатурация при 94 °C в течение 60 с, шаг 2: денатурация при 94 °C в течение 30 с, шаг 3: отжиг при 58 °C в течение 30 с, шаг 4: удлинение при 72 °C в течение 30 с, шаг 5: возврат к шагу 2 и повторение в течение 35 циклов, шаг 6: окончательное удлинение при 72°C в течение 30 с.
   1. Используйте те же условия ПЦР для ply3', за исключением времени продления на шаге 4 и шаге 6, где оно должно составлять 60 с.
3. Проанализируйте продукты ПЦР методом гель-электрофореза и исключите ампликон из геля.
4. Очистите ампликоны ПЦР в соответствии с протоколом, описанным в инструкциях производителя (Таблица материалов).
5. Используйте эквимолярные количества обоих плеч гомологий в качестве шаблонов в SOE-PCR. Соедините два ампликона с помощью праймеров plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) и plyRv2_NotI (TTTGCGGCCCCATTTTCTACCTACCTTATCCTCTACC).
6. Используйте следующие условия SOE-PCR (шаг 1: денатурация при 94 °C в течение 2 мин, шаг 2: денатурация при 94 °C в течение 30 с, шаг 3: отжиг при 58 °C в течение 30 с, шаг 4: удлинение при 68 °C в течение 60 с, шаг 5: возврат к шагу 2 и повторение в течение 25 циклов, шаг 6: окончательное продление при 68 °C в течение 90 с).
7. Анализ продукта SOE-PCR методом гель-электрофореза. Исключите его из геля с помощью набора для экстракции геля и следуйте прилагаемым инструкциям.
8. Амплифицируют кассету со спектиномицином из плазмиды pR412 с использованием следующих условий ПЦР: шаг 1: денатурация при 94 °C в течение 60 с, шаг 2: денатурация при 94 °C в течение 30 с, шаг 3: отжиг при 55 °C в течение 30 с, шаг 4: удлинение при 68 °C в течение 60 с, шаг 5: вернуться к шагу 2 и повторять в течение 25 циклов, шаг 6: окончательное продление при 68 °C в течение 60 с.
   1. Используйте праймеры BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC) и BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG, ATC). Плазмида pR412 была получена у доктора Marc PrudHomme (CNRS-Universite Paul Sabatier, Тулуза, Франция).
9. Анализ ампликонов ПЦР методом гель-электрофореза. Иссеките и очистите полученный ампликон ПЦР, как описано выше.

2. Генерация плазмиды pSD1 и химическая трансформация E. coli Dh5α

1. Выполните лигирование в соответствии с инструкциями производителя pGEMT-easy system I (таблица материалов). В микроцентрифужную пробирку добавьте 5 мкл 2-кратного лигирующего буфера, 1 мкл pGEMTeasy, 2 мкл продукта ply_SOE, 1 мкл ДНК-лигазы Т4 и воды к общему объему 20 мкл. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C. При этом генерируется плазмида pSD1.
2. Трансформирует химически компетентную кишечную палочку Dh5α с помощью pSD1. Начните с инкубации 50 мкл химически компетентной E. coli Dh5α с 3 мкл реакции лигирования pSD1 в течение 15 минут на льду. Затем продолжайте подвергать клетки термическому удару (42 °C, 30 с). Поместите клетки на лед на 2 мин.
3. Извлеките клетки изо льда и добавьте 350 мкл среды S.O.C. Инкубируют культуру в течение 2 ч при 37 °C, 120 об/мин.
4. Планшет трансформации на агаре Лурия Бертани (LBA) дополнен 0,4 мМ IPTG, 0,24 мг / мл X-Gal для синего / белого отбора и 100 мкг / мл ампициллина, чтобы убедиться, что все колонии, растущие в планшете, имеют плазмидный остов. Белые колонии содержат pSD1.
5. Выберите три белые колонии и создайте ночные наросты в 10 мл LB с добавлением 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируют культуры в течение ночи при температуре 37 °C встряхиванием.
6. На следующий день центрифугируют культуры в дозе 3,082 x g и используют гранулы для плазмидной экстракции.

3. Экстракция плазмидной ДНК, рестрикционное расщепление гена pSD1 и спектиномицина и сборка pSD2

1. Извлеките плазмидную ДНК в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к коммерческому набору (Таблица материалов).
2. Установите BamHI-рестрикционное разложение как для плазмиды pSD1, так и для предварительно усиленной и очищенной кассеты со спектиномицином. Используйте следующие условия и количества, описанные в таблице 1.
3. Инкубируют реакцию ограничения и контроля пищеварения при 37 °C в течение 3 ч.
4. Проанализируйте рестрикционный дайджест с помощью электрофореза, иссеките полосу и очистите, следуя инструкциям, прилагаемым к коммерческому набору (Таблица материалов).
5. Затем приготовьте реакцию лигирования в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов) с использованием BamHI-расщепленного pSD1 и спектиномицина (из шага 3.2). В микроцентрифужную пробирку добавляют следующие компоненты реакции: 5 мкл 2-кратного лигирующего буфера, 2 мкл pSD1, 2 мкл спектиномициновой кассеты, 1 мкл ДНК-лигазы Т4 и инкубируют в течение ночи при 4 °C. При этом генерируется плазмида pSD2.
6. Трансформируйте плазмиду pSD2 в химически компетентную E. coli Dh5α, как описано на шаге 2.2.
7. Выбор трансформантов, несущих плазмиду pSD2, основан на их способности расти в LBA с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина и ампициллина.
8. Выполните экстракцию плазмидной ДНК (pSD2), как описано выше, и следуя инструкциям производителя (мкл).

4. Трансформация штамма S. pneumoniae 519/43

1. Подготовьте ночную культуру S. pneumoniae 519/43 в BHI и дайте ей расти статически при 37 ° C, 5% CO₂.
2. На следующий день разбавьте культуры 1:50 и 1:100 в 10 мл свежего бульона BHI. Инкубируют культуры статически при 37 ° C до тех пор, пока OD_{595 нм} не составит от 0,05 до 0,1 (оптимальное получение ДНК ближе к 0,1 OD).
3. Как только OD 0,1 достигнут, возьмите 860 мкл и переложите в микроцентрифужную пробирку. В эту же микроцентрифужную пробирку добавляют: 100 мкл 100 мМ NaOH, 10 мкл 20% (мас./об.) BSA, 10 мкл 100 мМ CaCl2_{, 2} мкл 50 нг/мл CSP1²⁴ и 500 нг pSD2.
4. Инкубируйте реакцию статически при 37 °C в течение 3 ч.
5. Планшет 330 мкл на 5% пластины с кровяным агаром (BA) с добавлением 100 мкг / мл спектиномицина каждый час в течение 3 инкубационных часов.
6. Инкубировать пластины в течение ночи при 37 °C, 5% CO₂. Пластырь колоний, устойчивых к спектиномицину, на другую пластину БА с добавлением 100 мкг/мл спектиномицина, а также на пластины БА с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте оба набора пластин в течение ночи в условиях, указанных выше. Ампициллиновые пластины предназначены для проверки на наличие плазмидного остова.
7. Подтвердить наличие кассеты со спектиномицином методом ПЦР с использованием праймеров plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) и SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). Подтвердите мутацию методом ПЦР с использованием праймеров plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) и plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), которые прикрепляются за пределами мутировавшей области.
8. Подтвердить интеграцию в правильном расположении генома можно секвенированием с использованием праймеров plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), а также праймеров с их сайтом связывания в кассете спектиномицина sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG) и spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

Результаты

Описанный здесь протокол начинается с использования ПЦР для амплификации левого и правого плеч гомологии с одновременным удалением 191.н. из средней области гена ply . При выполнении ПЦР сайт BamHI вводится в 3' левого плеча гомологии и в 5'-конце правого плеча гомологии (рис. 1A<...

Обсуждение

Streptococcus pneumoniae, в частности серотип 1, по-прежнему представляет собой глобальную угрозу, вызывающую инвазивную пневмококковую инфекцию и менингит. Несмотря на внедрение различных вакцин, которые должны защищать от серотипа 1, в Африке этот серотип все еще способен вызывать вспышки, ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx DNA polymerase	Invitrogen	12344024	Used for amplification of the fragments
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Used for bacterial selection on stage 1(pSD1)
Blood Agar Base	Oxoid	CM0055	Used to plate S. pneumoniae transformants
Bovine Serum Albumine	sigma	55470	used for S. pneumoniae Transformation
Brain Heart Infusion	Oxoid	CM1135	used to grow S. pneumoniae cells
Calcium Chloride Cacl2	Sigma	449709	used for S. pneumoniae Transformation
Competence stimulating peptide 1	AnaSpec	AS-63779	used for S. pneumoniae Transformation
Luria Broth Agar	Gibco	22700025	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Luria Broth Base (Miller's formulation)	Gibco	12795027	used for plating and selection of pSD1 and pSD2
Monarch Gel Extraction Kit	NEB	T1020S	Used to extract the bands from the DNA gel
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010S	Used to extract plasmid from the cells
pGEM T-easy	Promega	A1360	used as suicide plasmid
S.O.C.	Invitrogen	15544034	used for recovery of cells after transformation
Sodium Hydroxide (NaOH)	Sigma	S0899	used for S.pneumoniae Transformation
Spectinomycin Hydrochloride	SigmaAldrich	PHR1426	Used for bacterial selection
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells	Invitrogen	18265017	used for the creation of pSD1 and pSD2