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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz es la herramienta más valiosa en biología del desarrollo. Un problema importante en los estudios comparativos es la varianza ambiental. Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea de especímenes múltiples y, por lo tanto, trata este problema favorablemente activamente.

Resumen

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz ofrece soluciones eficientes para estudiar procesos complejos en múltiples escalas biológicamente relevantes. Las configuraciones basadas en cámaras de muestras, que están diseñadas específicamente para preservar la integridad tridimensional de la muestra y generalmente cuentan con rotación de muestras, son la mejor opción en biología del desarrollo. Por ejemplo, se han utilizado para documentar toda la morfogénesis embrionaria de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el escarabajo de la harina roja Tribolium castaneum. Sin embargo, muchos protocolos de imágenes en vivo disponibles proporcionan solo marcos experimentales para embriones individuales. Especialmente para los estudios comparativos, tales enfoques son inconvenientes, ya que las muestras con imágenes secuenciales se ven afectadas por la varianza ambiental. Además, esto limita el número de especímenes que se pueden ensayado dentro de un tiempo determinado. Proporcionamos un marco experimental para imágenes simultáneas en vivo que aumenta el rendimiento en configuraciones basadas en cámaras de muestras y, por lo tanto, garantiza condiciones ambientales similares para todas las muestras. En primer lugar, proporcionamos una guía de calibración para microscopios de fluorescencia de láminas de luz. En segundo lugar, proponemos un método de montaje para múltiples embriones que sea compatible con la rotación de muestras. En tercer lugar, proporcionamos conjuntos de datos de imágenes en vivo tridimensionales ejemplares de Drosophila,para lo cual yuxtaponemos tres líneas transgénicas con núcleos marcados fluorescentemente, así como de Tribolium,para lo cual comparamos el rendimiento de tres sublíneas transgénicas que llevan el mismo transgén, pero en diferentes ubicaciones genómicas. Nuestro protocolo está diseñado específicamente para estudios comparativos, ya que aborda de forma proactiva la varianza ambiental, que siempre está presente en las imágenes en vivo secuenciales. Esto es especialmente importante para los análisis cuantitativos y la caracterización de fenotipos aberrantes, que resultan, por ejemplo, de experimentos knockout. Además, aumenta el rendimiento general, lo que es muy conveniente cuando el acceso a los microscopios de fluorescencia de láminas de luz es limitado. Finalmente, el método de montaje propuesto se puede adaptar para otras especies de insectos y otros organismos modelo, por ejemplo, el pez cebra, básicamente sin esfuerzo de optimización.

Introducción

La microscopía de fluorescencia es una de las técnicas de imagen más esenciales en las ciencias de la vida, especialmente en biología celular y del desarrollo. En los microscopios de fluorescencia confocal1,que son de última generación para imágenes de fluorescencia tridimensionales desde mediados de la década de 1990, la misma lente se utiliza para la excitación de fluoróforos y la detección de luz de emisión. El rayo láser de iluminación excita todos los fluoróforos a lo largo del eje de iluminación/detección y la señal de desfoque respectiva se discrimina antes de la detección por un agujero de alfiler. Por lo tanto, para cada imagen bidimensional, se ilumina todo el espécimen. En consecuencia, para cada imagen tridimensional, es decir, una pila de imágenes bidimensionales espacialmente consecutivas, todo el espécimen se ilumina varias docenas a unos pocos cientos de veces2,lo que promueve el fotoblanqueo y la fototoxicidad3.

Hace casi veinte años, la tecnología basada en láminas de luz4 surgió como una alternativa prometedora para las imágenes tridimensionales de fluorescencia y, por lo tanto, se convirtió en una herramienta valiosa en la biología del desarrollo5. En este enfoque, la iluminación y la detección están desacopladas. La lente de iluminación se utiliza para generar una hoja de luz con una profundidad de sólo unos pocos micrómetros dentro del plano focal de la lente de detección dispuesta perpendicularmente. Por lo tanto, para cada imagen bidimensional, solo se ilumina un volumen plano delgado alrededor del plano focal. En consecuencia, para cada imagen tridimensional, todo el espécimen se ilumina una sola vez, lo que disminuye fuertemente el fotoblanqueo y la fototoxicidad6. Por esta razón, los microscopios de fluorescencia de láminas de luz (LSFMs) ofrecen soluciones eficientes para estudiar procesos complejos en múltiples escalas biológicamente relevantes y son, por lo tanto, de particular valor en biología del desarrollo, donde especímenes tan grandes como varios milímetros tienen que ser analizados a nivel subcelular.

Históricamente, los LSFMs han sido de muestra basados encámaras 7,8. En estas configuraciones, los ejes de iluminación (x) y detección (z) generalmente se organizan perpendicularmente al eje de gravedad (y). Las cámaras de muestras ofrecen una amplia libertad experimental. En primer lugar, proporcionan grandes capacidades de tampón de imágenes, lo que a su vez facilita el uso de un sistema de perfusión para controlar el medio ambiente, por ejemplo, para mantener una temperatura específica9 o para aplicar estresores bioquímicos. Además, admiten métodos de montaje personalizados10 que se adaptan a las respectivas necesidades experimentales, preservando al mismo tiempo la integridad tridimensional, en algunos casos dinámica11,de la muestra. Además, las configuraciones basadas en cámaras de muestra generalmente están equipadas con una función de rotación que se utiliza para girar las muestras alrededor del eje y y, por lo tanto, obtener imágenes a lo largo de dos, cuatro o incluso más direcciones. Puesto que los embriones de organismos modelo de uso general son, en el contexto de microscopia, relativamente grandes, la proyección de imagen sucesiva a lo largo de las hachas ventral-dorsales, laterales, y/o anterior-posteriores del cuerpo proporciona una representación más comprensiva. Esto permite, por ejemplo, el seguimiento a largo plazo de las células que se mueven a lo largo de complejas rutas de migracióntridimensionales 12,13.

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz se ha aplicado ampliamente para estudiar la morfogénesis embrionaria de Drosophila melanogaster,tanto sistemáticamente14,15 como con un enfoque específico en los aspectos biofísicos del desarrollo. Por ejemplo, se utilizó para recopilar datos morfogenéticos de alta resolución con el fin de detectar un vínculo biomecánico entre la invaginación del endodermo y la extensión del eje durante el alargamiento de la banda germinal16 y, además, para relacionar el flujo celular complejo con los patrones de generación de fuerza durante la gastrulación17. También se ha combinado con otras técnicas de vanguardia, por ejemplo, optogenética para investigar la regulación de la señalización de Wnt durante el patrón anterior-posterior en la epidermis18.

Sin embargo, el estudio de una sola especie no proporciona información sobre la evolución del desarrollo. Para comprender la embriogénesis dentro del contexto filogenético, se ha llevado a cabo una investigación intensiva con organismos modelo de insectos alternativos. Una de las especies más investigadas es el escarabajo de la harina roja Tribolium castaneum,una plaga de grano almacenado económicamente relevante19,cuya morfogénesis embrionaria también ha sido sistemáticamente fotoizada con LSFM20. La morfogénesis embrionaria de estas dos especies difiere notablemente en varios aspectos, por ejemplo, el modo de segmentación21,así como la formación y degradación de membranas extraembrionarias22. Este último aspecto ya ha sido ampliamente analizado utilizando LSFMs. Por ejemplo, se ha demostrado que la serosa, un tejido extraembrionario que envuelve y protege al embrión de Tribolium de diversos peligros para la mayor parte de su embriogénesis23,24,también actúa como el "conductor" morfogenético para su propio proceso de retirada durante el cierre dorsal25. Además, se ha demostrado que durante la gastrulación, una región particular del blastodermo permanece anclada a la membrana vitelina para crear movimientos tisulares asimétricos26 y, tras esta observación, que la fluidización tisular regionalizada permite a las células salir secuencialmente del borde de la serosa durante el cierre de la ventana de la Serosa27.

En todos los estudios asociados a Drosophilay Triboliumcitados anteriormente, se han utilizado LSFMs basados en cámaras de muestra. En la mayoría, los embriones se registraron a lo largo de múltiples direcciones utilizando la función de rotación de la muestra. Aunque no se indica explícitamente, se puede suponer que se han registrado individualmente y, por lo tanto, independientes entre sí en ensayos secuenciales de imágenes en vivo, similar a nuestro trabajo anterior en Tribolium20,28. En ciertos escenarios, tal enfoque es aceptable, pero especialmente en los enfoques comparativos cuantitativos, la varianza ambiental puede distorsionar los resultados. Por ejemplo, desde hace mucho tiempo se sabe que la velocidad de desarrollo de los insectos depende de la temperatura29,pero un estudio más reciente sugiere además que en Drosophila,la temperatura también puede afectar la concentración de morfógenos30. En consecuencia, si ciertas características de la embriogénesis, por ejemplo, las proporciones dinámicas, las tasas de división y las velocidades de migración de las células, deben cuantificarse con precisión, se requieren suficientes repeticiones sin varianza ambiental. Esto minimiza las desviaciones estándar y los errores estándar, lo que a su vez facilita la yuxtaposición con otras condiciones experimentales, incluso marginalmente divergentes.

Sin embargo, los LSFMs basados en cámaras de muestras están diseñados principalmente para ensayos de alto contenido en lugar de ensayos de alto rendimiento. A diferencia de los microscopios confocales, que normalmente están equipados con mecanismos de abrazadera estandarizados para portaobjetos de microscopía, placas de Petri y placas de pozos, casi todos los LSFMs basados en cámaras de muestras utilizan mecanismos de abrazadera basados en cilindros. Estos mecanismos están destinados a portamuebadores de muestras a medida que son compatibles con la rotación, así como no invasivos10,pero por lo general no diseñados para más de una muestra20,31,32. Un marco para la obtención simultánea de imágenes en vivo de dos o más embriones, en el que las ventajas de las configuraciones basadas en cámaras de muestras no se ven comprometidas, aborda el problema de la varianza ambiental, lo que aumenta el valor de los LSFMs para estudios comparativos.

En nuestro protocolo, presentamos un marco experimental para la proyección de imagen viva comparativa en LSFMs cámara-basada de la muestra(figura 1A)en el cual el eje de y se utiliza como opción para "apilar" embriones. En primer lugar, proporcionamos una guía de calibración fluorescente basada en microesfera para LSFMs basados en cámaras de muestras, que es especialmente importante para los instrumentos que carecen de un asistente de calibración. En segundo lugar, describimos un método de montaje para múltiples embriones basado en el soporte de telaraña28 (Figura 1B)que es compatible con la rotación de la muestra y, por lo tanto, permite la obtención simultánea de imágenes de múltiples especímenes a lo largo de múltiples direcciones(Figura 1C). Varios embriones se alinean en la parte superior de una fina película de agarosa y, después de la inserción en la cámara de muestra, se mueven sucesivamente a través de la lámina de luz para adquirir imágenes tridimensionales. En tercer lugar, proporcionamos tres conjuntos de datos de imágenes en vivo ejemplares para Drosophila, así como para Tribolium. Para los primeros, yuxtaponemos líneas transgénicas con núcleos marcados fluorescentemente. Para este último, comparamos el rendimiento de las sublíneas transgénicas que llevan el mismo transgén, pero en diferentes ubicaciones genómicas. Finalmente, discutimos la importancia de la paralelización con respecto a la proyección de imagen viva comparativa y la variación ambiente33,debatimos el límite de rendimiento de nuestro marco experimental y evaluamos la adaptación de nuestro enfoque a otros organismos modelo.

Protocolo

1. Trabajos preparatorios

  1. Elija una combinación de lente de iluminación/lente de detección/cámara para el LSFM que se adapte a la pregunta científica y configure el microscopio. El tamaño del campo de visión es el cociente del tamaño del chip de la cámara y el aumento de la lente de detección. La lente de iluminación debe elegirse de modo que todo el campo de visión esté cubierto por una hoja de luz aproximadamente plana34. En la Tabla 1se enumeran tres combinaciones recomendadas.
  2. Para preparar alícuotas de agarosa y platos de recuperación, agregue 2 g de agarosa de baja fusión a 200 mL de agua del grifo en autoclave y caliente la mezcla en un horno de microondas a 600-800 W hasta que se disuelvan todas las partículas de agarosa. Prepare varias alícuotas de agarosa de 1 mL en tubos de reacción de 1,5 mL o 2 mL, luego llene varias placas de Petri de 90 mm de Ø de 3-5 mm de altura con agarosa. Guarde las alícuotas y platos solidificados a 4 °C.
  3. Para Drosophila:Para preparar viales de cría frescos, cocine una cantidad adecuada de medio Drosophila hecho a medida o disponible comercialmente, transfiera 5-15 ml en viales anchos y guárdelos a 4 °C. Para preparar platos de puesta de huevos, agregue 1 g de agarosa de baja fusión a 50 mL de agua del grifo en autoclave y caliente la mezcla en un horno de microondas a 600-800 W hasta que se disuelvan todas las partículas de agarosa. Deje que la mezcla se enfríe a 45 °C, luego agregue 50 mL de jugo de fruta (preferiblemente manzana o uva roja) y mezcle bien. Vierta la mezcla en placas de Petri de 35 mm Ø y guarde las placas de puesta de huevos solidificadas a 4 °C.
  4. Para Tribolium: Para preparar el medio de crecimiento, pase la harina de trigo integral, así como la levadura seca inactiva a través de un tamiz de tamaño de malla de 710 μm, luego complemente la harina tamizada con levadura tamizada al 5% (p/p). Para preparar el medio de puesta de huevos, pase la harina de trigo fino, así como la levadura seca inactiva a través de un tamiz de tamaño de malla de 250 μm, luego complemente la harina tamizada con levadura tamizada al 5% (p/p).

2. Calibración de LSFMs basados en cámaras de muestras utilizando microesferas fluorescentes

NOTA: El propósito de la calibración es alinear los puntos focales de las lentes de iluminación y detección (Figura 2A), ya que esta es la premisa para imágenes claras. Los LSFMs deben calibrarse regularmente, al menos una vez cada 3-4 semanas.

  1. Vuelva a licuar una alícuota de agarosa en un calentador/mezclador de bloque seco a 80 °C, luego deje que la alícuota de agarosa se enfríe a 35 °C.
  2. Transferir 50 μL de agarosa a un tubo de reacción de 1,5 mL y añadir 0,5 μL de solución fluorescente de microesfera. Mezclar a 1.400 rpm durante 1 min.
  3. Llene el orificio ranurado del soporte de la telaraña con 10 μL de mezcla de solución de agarosa/microesfera fluorescente, luego aspire tanta agarosa como sea posible hasta que solo quede una película de agarosa delgada. Espere 30-60 s para la solidificación.
  4. Llene la cámara de muestra con agua del grifo en autoclave. Inserte el soporte de la telaraña lentamente en la cámara de muestra y mueva el orificio ranurado con las etapas de microtraducción delante de la lente de detección.
  5. Gire el soporte de la telaraña con la etapa de rotación a una posición de 45° en relación con los ejes de iluminación (x) y detección (z). El soporte de la telaraña no debe ser visible en el canal de luz de transmisión.
  6. Cambie al canal de fluorescencia respectivo y ajuste la potencia del láser, así como el tiempo de exposición para que las microesferas fluorescentes proporcionen la señal adecuada.
  7. Especifique un volumen de vista que cubra completamente la película de agarosa ahora orientada transversalmente. Defina el espaciado z calculando la resolución axial máximamente posible para la combinación respectiva de lente de iluminación/lente de detección34. Alternativamente, 4 veces la resolución lateral se puede utilizar como una aproximación aproximada.
  8. Registre una pila z de prueba tridimensional de las microesferas fluorescentes y compare las proyecciones máximas x, y y z con la tabla de calibración (Figura 2). Si las microesferas aparecen borrosas, difusas y/o distorsionadas (Figura 2B,C), ajuste las posiciones de la lente de iluminación y/o detección.

3. Colección de embriones de Drosophila

  1. Transfiera 100-200 adultos de la línea de elección de Drosophila a un vial de cría fresco 2-3 días antes del ensayo de imágenes para establecer un cultivo de recolección de huevos. Si aún no existe, considere el uso del viejo vial de cría para iniciar un cultivo de progenie. Para asegurarse de que los adultos no tienen más de dos semanas de edad, reemplace el cultivo de recolección de embriones a tiempo con el cultivo de progenie.
  2. Caliente un plato de puesta de huevos a temperatura ambiente y agregue una gota de pasta de levadura encima del agar.
  3. Transfiera a los adultos del cultivo de recolección de huevos a un frasco estrecho vacío y colóvelo encima del plato de puesta de huevos. Incubar la configuración de recolección de huevos a temperatura ambiente durante 15 min. Evite la anestesia (frío, CO2)durante este paso si es posible.
  4. Devuelva a los adultos al vial de crianza. Incube el plato de puesta de huevos a una combinación conveniente de temperatura y tiempo, luego transfiera 10-20 embriones con un pequeño pincel desde el plato de puesta de huevos a un colador celular de tamaño de malla de 100 μm. Deseche el plato de puesta de huevos.
  5. Repita los pasos 3.1 a 3.4 para cada línea de Drosophila.

4. Colección de embriones de Tribolium

NOTA: Para mayor comodidad, se proporciona un esquema del procedimiento de recolección de huevos de Tribolium (Figura 3A) al que también se refieren los números dentro de los corchetes en este paso.

  1. Transfiera 200-300 adultos (aproximadamente 400-700 mg) de la línea de tribolio de elección a una botella de vidrio vacía de 1 L 2-10 días antes del ensayo de imágenes para establecer un cultivo de recolección de huevos (Figura 3A_01). Llene la botella con 50-100 g de medio de crecimiento fresco. Si aún no existe, considere comenzar un cultivo de progenie utilizando larvas y pupas disponibles. Para asegurarse de que los adultos no tienen más de 3 meses de edad, reemplace el cultivo de recolección de huevos a tiempo con el cultivo de progenie.
  2. Pasar el cultivo de recolección de huevos a través de un tamiz de tamaño de malla de 800 μm (Figura 3A_02). Devolver el medio de crecimiento, que contiene embriones no estadados, a la botella inicial (Figura 3A_03) y transferir a los adultos a una botella de vidrio vacía de 1 L (Figura 3A_04). Añadir 10 g de medio de puesta de huevos (Figura 3A_05) e incubar la configuración de recolección de huevos a temperatura ambiente durante 1 h (Figura 3A_06,07).
  3. Pase la configuración de recolección de huevos a través del tamiz de tamaño de malla de 800 μm (Figura 3A_08). Devolver a los adultos a su botella inicial (Figura 3A_09). Dependiendo del proceso de desarrollo que se debe foto, incubar el medio de puesta de huevos, que ahora contiene alrededor de 30-100 embriones, a una combinación conveniente de temperatura / tiempo (Figura 3A_10).
  4. Pase el medio de puesta de huevos a través del tamiz de tamaño de malla de 300 μm(Figura 3A_11)y transfiera los embriones(Figura 3A_12)a un colador celular de tamaño de malla de 100 μm. Deseche los medios de puesta de huevos tamizados (Figura 3A_13).
  5. Repita los pasos 4.1 a 4.4 para cada línea de Tribolium.

5. Descorionación a base de hipoclorito de sodio

NOTA: Tanto los embriones de Drosophila como los de Tribolium están cubiertos por un corion, una capa proteica protectora y de dispersión muy ligera que no es esencial para el desarrollo adecuado, siempre y cuando los embriones se mantengan húmedos después de la extracción. El protocolo de decorionación para los embriones de ambas especies es idéntico.

  1. Preparar una placa de 6 pozos llenando los pozos A1, A2, A3 y B3 con 8 mL de agua del grifo en autoclave y los pozos B1 y B2 con 7 mL de agua del grifo en autoclave y 1 mL de solución de hipoclorito de sodio (NaOCl)(Figura 3B). Observe el proceso de decorionación bajo un microscopio estéreo, idealmente en luz de transmisión.
    PRECAUCIÓN: El hipoclorito de sodio es corrosivo.
  2. Inserte el colador celular que contiene embriones (Paso 3.4 y/o 4.4) en el pozo A1 y lave los embriones unos 30-60 s bajo agitación suave.
  3. Mueva el colador celular al pozo B1 y agite las placas vigorosamente durante 30 s, luego transfilícelo al pozo A2 y lave los embriones durante 1 minuto bajo agitación suave.
  4. Mueva el colador celular al pozo B2 y agite la placa vigorosamente hasta que la mayoría de los embriones estén completamente descoronados(Figura 3C),luego transfilíquelo al pozo A3 y lave los embriones durante 1 minuto bajo agitación suave.
  5. Guarde bien el colador celular en el B3 antes de continuar con el procedimiento de montaje.
  6. Repita los pasos 5.1 a 5.5 para cada línea.

6. Montaje de múltiples embriones utilizando el soporte de telaraña

  1. Vuelva a licuar una alícuota de agarosa en un calentador/mezclador de bloque seco a 80 °C, luego deje que la alícuota de agarosa se enfríe a 35 °C.
  2. Pipeta 10 μL de agarosa en la parte superior del orificio ranurado del soporte de la telaraña. Con la punta de la pipeta, extienda la agarosa sobre el agujero ranurado, luego aspire tanta agarosa como sea posible hasta que solo quede una película de agarosa delgada. Espere 30-60 s para la solidificación.
  3. Para cada línea, elija cuidadosamente uno o más embriones con un pincel pequeño y colóquelos en la película de agarosa.
  4. Coloque los embriones a lo largo del eje largo del agujero ranurado, luego también alinee su eje anterior-posterior con el eje largo del agujero ranurado (Figura 3D).
  5. Estabilice los embriones cuidadosamente pipeteando 1-2 μL de agarosa en el espacio entre los embriones y la película de agarosa. Espere 30-60 s para la solidificación.
  6. Inserte el soporte de la telaraña con los embriones montados lentamente en la cámara de muestra llena de tampón de imagen.

7. Imágenes vivas comparativas en LSFMs basados en cámaras de muestra

  1. Mueva uno de los embriones con las etapas de microtraducción delante de la lente de detección. Asegúrese de que el soporte de la telaraña esté en una posición de 45° en relación con los ejes de iluminación (x) y detección (z) (cf. Figura 1C).
  2. En el canal de luz de transmisión, mueva el embrión al centro del campo de visión. El soporte de la telaraña no debe ser visible.
  3. Mueva el embrión con las etapas de microtraducción en z hasta que el plano medio del embrión se superponga con el plano focal, es decir, hasta que el contorno aparezca nítido. Sin cambiar al canal de fluorescencia, especifique el volumen de visión alejándose 250 μm del plano medio en ambas direcciones.
  4. Opcionalmente, si se requiere la obtención de imágenes en varias direcciones, gire el embrión adecuadamente y repita los pasos 7.2 y 7.3. El soporte de telaraña soporta hasta cuatro orientaciones en pasos de 90°.
  5. Repita los pasos 7.1 a 7.3 (o 7.4) para todos los demás embriones montados en el soporte de la telaraña (Figura 3E). Asegúrese de que el embrión superior no salga del tampón de imágenes cuando el embrión más abajo esté delante de la lente de detección.
  6. Defina los parámetros del canal de fluorescencia (potencia del láser, tiempo de exposición, filtro de detección) y lapso de tiempo (intervalo, duración total) e inicie el proceso de obtención de imágenes. Para obtener valores indicativos, consulte la tabla de metadatos de los conjuntos de datos de ejemplo (Tabla suplementaria 1). Para los ensayos que duran varios días, considere cubrir la abertura de la cámara de muestra al menos parcialmente para reducir la evaporación.

8. Recuperación y posterior cultivo de embriones fotodados

  1. Cuando el ensayo de imágenes haya terminado, retire cuidadosamente el soporte de la telaraña de la cámara de muestra.
  2. Desprenda los embriones de la película de agarosa con un pequeño pincel y transfiéchelos a un portaobjetos de microscopio debidamente etiquetado. Coloque el portaobjetos en un plato de recuperación e incube bajo las respectivas condiciones de cría estándar.
  3. En cuanto a las modalidades experimentales, estimar cuándo se completa la embriogénesis. A medida que se acerca el punto de tiempo de eclosión, revise los platos de recuperación con frecuencia y transfiera las larvas de Drosophila eclosionadas a viales de cría individuales y las larvas de Tribolium a pozos individuales de una placa de 24 pozos. Llene los pozos hasta la mitad con medio de crecimiento. Incubar bajo las respectivas condiciones de cría estándar.
  4. Una vez que los individuos observados son adultos, proporcionarles un compañero de apareamiento adecuado y comprobar si hay progenie después de varios días.

9. Procesamiento de datos de imágenes y documentación de metadatos

NOTA: Para el procesamiento de datos de imagen, se recomienda el derivado de ImageJ FIJI35 (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI no requiere instalación y están disponibles las versiones de 32 y 64 bits. Uno de los formatos más utilizados para los datos LSFM es el formato de archivo de imagen etiquetado (TIFF), que permite el almacenamiento de pilas de imágenes en forma de contenedor TIFF.

  1. Calcular las proyecciones máximas z para todas las pilas z (Image | Pilas | Proyecto Z, elija Intensidad máxima). Las proyecciones máximas son enfoques de simplificación de datos que reducen el número de dimensiones espaciales de tres a dos. Se proporciona un script FIJI para el procesamiento por lotes (Archivo suplementario 1).
  2. Concatene las respectivas proyecciones máximas z para crear pilas de tiempo (pilas t). Guárdelos en un contenedor TIFF. Haga esto para todos los embriones registrados, así como las direcciones respectivas y los canales de fluorescencia, si corresponde.
  3. Gire la pila z y t alrededor del eje z para alinear el eje anterior-posterior de los embriones con el eje de imagen x o y (Image | | de transformación Rotar). Recorte las pilas z a lo largo de los tres ejes de imagen y la pila t en los ejes de imagen x e y para que solo permanezca un espacio de búfer mínimo (20-40 píxeles a lo largo de los ejes x e y, 5-10 imágenes a lo largo del eje z) alrededor del embrión(Image | Ajustar | Tamaño del lienzo para los ejes x e y, image | Pilas | Herramientas | Slice Keeper para el eje z).
    1. Haga esto individualmente para todos los embriones registrados, así como las instrucciones respectivas, si corresponde. Los canales de fluorescencia, si procede, deben procesarse con parámetros de rotación y recorte idénticos.
  4. Documente los metadatos lo más detalladamente posible. Como guía, se puede utilizar la tabla de metadatos de los conjuntos de datos de ejemplo, que se presentan en la sección Resultados representativos (Tabla suplementaria 1).

10. Visualización de datos

NOTA: Esta guía de visualización de datos se centra principalmente en la creación de matrices de imágenes de proyección máxima z que muestran varios embriones grabados a lo largo de múltiples direcciones y / o a lo largo del tiempo. Los pasos siguientes describen el procedimiento de visualización de datos que se aplicó a los datasets de ejemplo para la creación de las figuras mostradas y los vídeos vinculados en la sección Resultados representativos.

  1. Combinar t pilas de múltiples direcciones (Image | Pilas | Herramientas | Combinar) y/o fusionar múltiples canales de fluorescencia (Image | Color | Fusionar Canales) para visualizar la estructura biológica y/o proceso de interés.
  2. Ajuste las intensidades de las pilas t (Image | Ajustar | Brillo/Contraste) según sea necesario usando la función "Set". El valor mínimo mostrado debe establecerse ligeramente por encima de la señal de fondo, el valor máximo mostrado debe dar lugar a un contraste conveniente. Documente ambos valores, ya que se pueden utilizar para un ajuste coherente de las respectivas pilas z. Ajustes de impresión mediante la función "Aplicar". Dependiendo de las modalidades experimentales, considere procesar todos los embriones registrados con valores idénticos.
  3. Guarde las pilas t ajustadas a la intensidad como archivos separados, no invalide las pilas t no ajustadas. Compilar sub pilas adecuadas de las pilas t ajustadas con funciones de selección de imágenes dedicadas (por ejemplo, Image | Pilas | Herramientas | Slice Keeper) y utilice la herramienta de montaje (Image | Pilas | Hacer montaje )para crear cuadrículas de imagen que se pueden utilizar para el diseño de la figura.

Resultados

Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva de la fluorescencia comparativa en LSFMs basado cámara de la muestra. Por ejemplo, el marco se puede utilizar para yuxtaponer (i) embriones de dos o más especies, (ii) embriones de líneas en las que uno o más genes son eliminados más controles de tipo salvaje, (iii) múltiples embriones de la misma línea transgénica, (iv) embriones de diferentes líneas transgénicas, o (v) embriones de sublíneas que portan el mismo transgén , pe...

Discusión

Una de las áreas de aplicación exclusivas de LSFMs es la biología del desarrollo. En esta disciplina, es importante observar especímenes vivos, de lo contrario los procesos morfogenéticos no se pueden describir de manera dinámica. Un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea en LSFMs cámara-basados de la muestra, según lo descrito aquí, es conveniente por dos razones principales.

La varianza ambiental, que es inevitable en imágenes en vivo secuenciales, se pue...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Ernst H. K. Stelzer por la oportunidad de utilizar sus recursos, así como sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, Anita Anderl por su apoyo con las imágenes en vivo de Tribolium, Sven Plath por el apoyo técnico, así como a Ilan Davis, Nicole Grieder y Gerold Schubiger por compartir sus líneas transgénicas de Drosophila a través del Bloomington Stock Center.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
6-well plateOrange Scientific4430500 
24-well plateOrange Scientific4430300Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dishFisher Scientific153066Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dishFisher ScientificL9004575
100 µm mesh size cell strainerBD Biosciences352360
250 µm mesh size sieveVWR International200.025.222-038Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieveVWR International200.025.222-040Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieveVWR International200.025.222-050Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieveVWR International200.025.222-051Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flourDemeter e.V.SP061006Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila mediumGenesee Scientific66-115Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm ØThermo Fisher ScientificT7282
inactive dry yeastGenesee Scientific62-108
low-melt agaroseCarl Roth6351.2
narrow vialsGenesee Scientific32-109Only for live imaging involving Drosophila
small paint brushVWR International149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active ClCarl Roth9062.3Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flourDemeter e.V.SP061036Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vialsGenesee Scientific32-110Only for live imaging involving Drosophila

Referencias

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