Imaging live simultaneo di più embrioni di insetti nei microscopi a fluorescenza a fogli di luce a camera campione

Riepilogo

La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è lo strumento più prezioso nella biologia dello sviluppo. Uno dei principali problemi degli studi comparativi è la varianza ambientale. Il nostro protocollo descrive un framework sperimentale per l'imaging live simultaneo di più campioni e, pertanto, affronta questo problema in modo pro-attivo.

Abstract

La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri offre soluzioni efficienti per studiare processi complessi su più scale biologicamente rilevanti. Le configurazioni basate su camera campione, che sono specificamente progettate per preservare l'integrità tridimensionale del campione e di solito presentano la rotazione del campione, sono la scelta migliore nella biologia dello sviluppo. Ad esempio, sono stati utilizzati per documentare l'intera morfogenesi embrionale della mosca della frutta Drosophila melanogaster e dello scarabeo di farina rossa Tribolium castaneum. Tuttavia, molti protocolli di imaging dal vivo disponibili forniscono solo framework sperimentali per singoli embrioni. Soprattutto per gli studi comparativi, tali approcci sono scomodi, poiché i campioni di immagine sequenziale sono influenzati dalla varianza ambientale. Inoltre, questo limita il numero di campioni che possono essere saggiati entro un dato tempo. Forniamo un framework sperimentale per l'imaging live simultaneo che aumenta la velocità effettiva nelle configurazioni basate su camera campione e quindi garantisce condizioni ambientali simili per tutti i campioni. In primo luogo, forniamo una linea guida di calibrazione per i microscopi a fluorescenza a fogli leggeri. In secondo luogo, proponiamo un metodo di montaggio per più embrioni compatibile con la rotazione del campione. In terzo luogo, forniamo set di dati tridimensionali esemplari di imaging vivo di Drosophila, per i quali giustappongiamo tre linee transgeniche con nuclei etichettati fluorescentmente, così come di Tribolium, per i quali confrontiamo le prestazioni di tre sottolinee transgeniche che trasportano la stessa transgenica, ma in diverse posizioni genomiche. Il nostro protocollo è specificamente progettato per studi comparativi in quanto affronta in modo pro-attivo la varianza ambientale, che è sempre presente nell'imaging dal vivo sequenziale. Ciò è particolarmente importante per le analisi quantitative e la caratterizzazione dei fenotipi aberrazione, che derivano ad esempio da esperimenti ad eliminazione diretta. Inoltre, aumenta la produttività complessiva, che è molto conveniente quando l'accesso ai microscopi a fluorescenza a fogli leggeri è limitato. Infine, il metodo di montaggio proposto può essere adattato ad altre specie di insetti e ad altri organismi modello, ad esempio il pesce zebra, senza praticamente alcuno sforzo di ottimizzazione.

Introduzione

La microscopia a fluorescenza è una delle tecniche di imaging più essenziali nelle scienze della vita, specialmente nella biologia cellulare e dello sviluppo. Nei microscopi a fluorescenza confocale¹, che sono all'avanguardia per l'imaging tridimensionale a fluorescenza dalla metà degli anni '90, la stessa lente viene utilizzata per l'eccitazione del fluorofore e il rilevamento della luce di emissione. Il raggio laser di illuminazione eccita tutti i fluorofori lungo l'asse di illuminazione/rilevamento e il rispettivo segnale fuori fuoco viene discriminato prima del rilevamento da parte di un foro stenopeico. Quindi, per ogni immagine bidimensionale, l'intero campione è illuminato. Di conseguenza, per ogni immagine tridimensionale, cioè una pila di immagini bidimensionali spazialmente consecutive, l'intero campione viene illuminato da diverse decine a poche centinaia di^{volte 2,}il che promuove il fotoblesciaching e la fototossicità³.

Quasi vent'anni fa, la tecnologia⁴ basata su fogli di luce emerse come una promettente alternativa per l'imaging tridimensionale a fluorescenza e divenne così un prezioso strumento nella biologia dello sviluppo⁵. In questo approccio, l'illuminazione e il rilevamento vengono disaccoppiati. L'obiettivo di illuminazione viene utilizzato per generare una scheda luminosa con una profondità di pochi micrometri all'interno del piano focale della lente di rilevamento disposta perpendicolarmente. Quindi, per ogni immagine bidimensionale, viene illuminato solo un sottile volume planare attorno al piano focale. Di conseguenza, per ogni immagine tridimensionale, l'intero campione viene illuminato una sola volta, il che diminuisce fortemente il fotobleaching e la fototossicità⁶. Per questo motivo, i microscopi a fluorescenza a fogli leggeri (LSFMs) offrono soluzioni efficienti per studiare processi complessi su più scale biologicamente rilevanti e sono, quindi, di particolare valore nella biologia dello sviluppo, dove campioni grandi fino a diversi millimetri devono essere analizzati a livello subcellulare.

Storicamente, gli LSFM sono stati campionati a camera^7,8. In queste configurazioni, gli assi di illuminazione (x) e di rilevamento (z) sono solitamente disposti perpendicolarmente all'asse gravitazionale (y). Le camere campione offrono un'ampia libertà sperimentale. In primo luogo, forniscono grandi capacità tampone di imaging, il che a sua volta facilita l'uso di un sistema di perfusione per controllare l'ambiente, ad esempio per mantenere una^{temperatura specifica 9} o per applicare stressanti biochimici. Inoltre, supportano metodi di^{montaggio personalizzati 10} su misura per le rispettive esigenze sperimentali preservando l'integrità tridimensionale, in alcuni casi^{dinamica 11,}del campione. Inoltre, le configurazioni basate su camera campione sono solitamente dotate di una funzione di rotazione che viene utilizzata per ruotare i campioni attorno all'asse y e quindi immaginirli lungo due, quattro o anche più direzioni. Poiché gli embrioni di organismi modello comunemente usati sono, nel contesto della microscopia, immagini successive relativamente grandi lungo gli assi del corpo ventrale-dorsale, laterale e/o anteriore-posteriore forniscono una rappresentazione più completa. Ciò consente, ad esempio, il tracciamento a lungo termine delle celle che si muovono lungo complessi percorsi di migrazione^{tridimensionale 12,13}.

La microscopia a fluorescenza a fogli leggeri è stata ampiamente applicata per studiare la morfogenesi embrionale della Drosophila melanogaster,sia^{sistematicamente 14,15,} sia con un focus specifico sugli aspetti biofisici dello sviluppo. Ad esempio, è stato utilizzato per raccogliere dati morfogenetici ad alta risoluzione al fine di rilevare un legame biomeccanico tra l'invaginazione dell'endoderma e l'estensione dell'asse durante l'allungamento della banda^{germinale 16} e oltre per correlare il flusso cellulare complesso con i modelli di generazione della forza durante la gastrulazione¹⁷. È stato anche combinato con altre tecniche all'avanguardia, ad esempio l'optogenetica per indagare la regolazione della segnalazione Wnt durante la modelliatura anteriore-posteriore nell'epidermide¹⁸.

Tuttavia, studiare solo una specie non fornisce approfondimenti sull'evoluzione dello sviluppo. Per comprendere l'embriogenesi all'interno del contesto filogenetico, è stata condotta un'intensa ricerca con organismi alternativi del modello di insetto. Una delle specie più studiate è lo scarabeo di farina rossa Tribolium castaneum,un parassita di grano immagazzinato^{economicamente rilevante 19}, la cui morfogenesi embrionale è già stata sistematicamente immagine con LSFM²⁰. La morfogenesi embrionale di queste due specie differisce notevolmente in diversi aspetti, ad esempio il modo di segmentazione²¹, così come la formazione e la degradazione delle membrane extra-embrionali²². Quest'ultimo aspetto è già stato ampiamente analizzato utilizzando LSFM. Ad esempio, è stato dimostrato che il serosa, un tessuto extra-embrionale che avvolge e protegge l'embrione del Tribolium da vari pericoli per la maggior parte della sua embriogenesi^23,24, agisce anche come "driver" morfogenetico per il proprio processo di astinenza durante la chiusura dorsale²⁵. Inoltre, è stato dimostrato che durante la gastrulazione, una particolare regione del blastoderma rimane ancorata alla membrana vitellina al fine di creare movimenti asimmetrici dei tessuti²⁶ e, a seguito di questa osservazione, che la fluidizzazione dei tessuti regionalizzata consente alle cellule di lasciare sequenzialmente il bordo della serosa durante la chiusura della finestra di serosa²⁷.

In tutti gli studi associati alla Drosophila- e al Triboliumsopra citati, sono stati utilizzati LSFM a camera campione. Nella maggior parte dei casi, gli embrioni sono stati registrati lungo più direzioni utilizzando la funzione di rotazione del campione. Sebbene non siano esplicitamente dichiarati, si può presumere che siano stati registrati individualmente e quindi indipendenti l'uno dall'altro in saggi sequenziali di imaging dal vivo, simili al nostro precedente lavoro su Tribolium^20,28. In alcuni scenari, tale approccio è accettabile, ma soprattutto negli approcci comparativi quantitativi, la varianza ambientale può distorcere i risultati. Ad esempio, è noto da tempo che la velocità di sviluppo degli insetti dipende dalla temperatura²⁹, ma uno studio più recente suggerisce inoltre che in Drosophila, la temperatura può anche influenzare la concentrazione di morfogeni³⁰. Di conseguenza, se alcune caratteristiche dell'embriogenesi, ad esempio le proporzioni dinamiche, i tassi di divisione e le velocità di migrazione delle cellule, dovrebbero essere quantificate con precisione, sono necessarie ripetizioni sufficienti senza varianza ambientale. Ciò riduce al minimo le deviazioni standard e gli errori standard, che a loro volta facilitano la giustapposizione con altre condizioni sperimentali, anche solo marginalmente divergenti.

Tuttavia, gli LSFM a camera campione sono progettati principalmente per test ad alto contenuto piuttosto che ad alta produttività. A differenza dei microscopi confocali, che sono tipicamente dotati di meccanismi di bloccaggio standardizzati per vetrine per microscopia, piastre di Petri e piastre di pozzo, quasi tutti gli LSFM a camera campione utilizzano meccanismi di bloccaggio basati su cilindri. Questi meccanismi sono destinati a supporti campione su misura compatibili con la rotazione e non invasivi^10,ma di solito non progettati per più^{di un campione 20,31,32}. Un quadro per l'imaging live simultaneo di due o più embrioni, in cui i vantaggi delle configurazioni basate su camere campione non sono compromessi, affronta il problema della varianza ambientale aumentando così il valore degli LSFM per gli studi comparativi.

Nel nostro protocollo, presentiamo un quadro sperimentale per l'imaging dal vivo comparativo in LSFM a camera campione (Figura 1A) in cui l'asse y viene utilizzato come opzione per "impilare" gli embrioni. In primo luogo, forniamo una linea guida di calibrazione fluorescente basata sulla microsfera per gli LSFM a camera campione, che è particolarmente importante per gli strumenti che non dispongono di un assistente di calibrazione. In secondo luogo, descriviamo un metodo di montaggio per più embrioni basato sul titolare della ragnatela²⁸ (Figura 1B) che è compatibile con la rotazione del campione e consente quindi l'imaging simultaneo di più campioni lungo più direzioni (Figura 1C). Diversi embrioni sono allineati sopra una sottile pellicola di agarosio e, dopo l'inserimento nella camera campione, si spostano successivamente attraverso la lastra luminosa per acquisire immagini tridimensionali. In terzo luogo, forniamo tre set di dati di imaging dal vivo esemplari per Drosophila e tribolium. Per il primo, giustapponemo linee transgeniche con nuclei etichettati fluorescentmente. Per quest'ultimo, confrontiamo le prestazioni delle sottolinee transgeniche che trasportano lo stesso transgene, ma in diverse posizioni genomiche. Infine, discutiamo dell'importanza della parallelizzazione per quanto riguarda l'imaging vivo comparativo e la varianza ambientale^33,discutiamo il limite di produttività del nostro quadro sperimentale e valutiamo l'adattamento del nostro approccio ad altri organismi modello.

Protocollo

1. Lavori preparatori

1. Scegli una combinazione obiettivo di illuminazione/obiettivo di rilevamento/fotocamera per l'LSFM che si adatta alla domanda scientifica e imposta il microscopio. La dimensione del campo visivo è il quoziente della dimensione del chip della fotocamera e l'ingrandimento dell'obiettivo di rilevamento. L'obiettivo di illuminazione deve essere scelto in modo che l'intero campo visivo sia coperto da una scheda luminosa approssimativamente planare³⁴. Nella tabella 1 sono elencate tre combinazioni consigliate.
2. Per preparare aliquote di agarosio e piatti di recupero, aggiungere 2 g di agarosio a bassa fusione all'acqua del rubinetto autoclavata da 200 mL e riscaldare la miscela in un forno a microonde a 600-800 W fino a quando tutte le particelle di agarosio non vengono sciolte. Preparare diverse aliquote di agarosio da 1 ml in tubi di reazione da 1,5 ml o 2 ml, quindi riempire diverse piastre Ø Petri da 90 mm alte 3-5 mm con agarosio. Conservare aliquote e piatti solidificati a 4 °C.
3. Per Drosophila: Per preparare fiale di allevamento fresche, cuocere una quantità adeguata di mezzo Drosophila su misura o disponibile in commercio, trasferire 5-15 mL in fiale larghe e conservarle a 4 °C. Per preparare piatti di deposizione delle uova, aggiungere 1 g di agarosio a bassa fusione a 50 mL di acqua del rubinetto autoclavata e riscaldare la miscela in un forno a microonde a 600-800 W fino a quando tutte le particelle di agarosio non vengono sciolte. Lasciare raffreddare il composto a 45 °C, quindi aggiungere 50 mL di succo di frutta (preferibilmente mela o uva rossa) e mescolare accuratamente. Versare il composto in stoviglie Ø Petri da 35 mm e conservare piatti solidificati per la deposizione delle uova a 4 °C.
4. Per tribolium: Per preparare il mezzo di crescita, passare la farina integrale e il lievito secco inattivo attraverso un setaccio a maglie da 710 μm, quindi integrare la farina setacciata con lievito setacciato al 5% (w/w). Per preparare il mezzo di deposizione delle uova, passare la farina di grano fine e il lievito secco inattivo attraverso un setaccio di dimensioni delle maglie di 250 μm, quindi integrare la farina setacciata con il 5% (w/w) lievito setacciato.

2. Taratura di LSFM a camera campione che utilizzano microsfere fluorescenti

NOTA: Lo scopo della calibrazione è quello di allineare i punti focali delle lenti di illuminazione e rilevamento (Figura 2A), poiché questa è la premessa per immagini chiare. Gli LSMM devono essere calibrati regolarmente, almeno una volta ogni 3-4 settimane.

1. Riliquefare un'aliquota di agarosio in un riscaldatore/miscelatore a blocchi secchi a 80 °C, quindi lasciare raffreddare l'aliquota di agarosio a 35 °C.
2. Trasferire 50 μL di agarosio in un tubo di reazione da 1,5 ml e aggiungere 0,5 μL di soluzione di microsfera fluorescente. Mescolare a 1.400 giri/min per 1 minuto.
3. Riempire il foro fessurato del supporto della ragnatela con 10 μL di miscela di soluzione di agarosio / microsfera fluorescente, quindi aspirare quanta più agarosio possibile fino a quando rimane solo un sottile film di agarosio. Attendere 30-60 s per la solidificazione.
4. Riempire la camera campione con acqua del rubinetto autoclavata. Inserire lentamente il supporto della ragnatela nella camera campione e spostare il foro fessurato con le fasi di microtraslazione davanti all'obiettivo di rilevamento.
5. Ruotare il supporto della ragnatela con lo stadio di rotazione in una posizione di 45° rispetto agli assi di illuminazione (x) e rilevamento (z). Il supporto della ragnatela non deve essere visibile nel canale della luce di trasmissione.
6. Passare al rispettivo canale di fluorescenza e regolare la potenza del laser e il tempo di esposizione in modo che le microsfere fluorescenti forniscano un segnale adeguato.
7. Specificate un volume di vista che copra completamente la pellicola di agarosio ora orientata trasversalmente. Definire la spaziatura z calcolando la massima risoluzione assiale possibile per la rispettiva combinazione obiettivo di illuminazione/obiettivo di^{rilevamento 34}. In alternativa, 4 volte la risoluzione laterale può essere utilizzata come approssimazione approssimativa.
8. Registrare una pila z di test tridimensionale delle microsfere fluorescenti e confrontare le proiezioni massime x, y e z con il grafico di calibrazione (Figura 2). Se le microsfere appaiono sfocate, sfocate e/o distorte (Figura 2B,C), regolare le posizioni dell'obiettivo di illuminazione e/o rilevamento.

3. Raccolta di embrioni di Drosophila

1. Trasferire 100-200 adulti della linea Drosophila preferita in una fiala di allevamento fresca 2-3 giorni prima del test di imaging per stabilire una coltura di raccolta delle uova. Se non ancora esistente, considera di usare la vecchia fiala di allevamento per iniziare una cultura della progenie. Per garantire che gli adulti non hanno più di due settimane, sostituire la cultura della raccolta degli embrioni in tempo con la cultura della progenie.
2. Scaldare un piatto di deposizione delle uova a temperatura ambiente e aggiungere una goccia di pasta di lievito sopra l'agar.
3. Trasferisci gli adulti dalla cultura della raccolta delle uova a una fiala stretta vuota e posizionalo sopra il piatto di deposizione delle uova. Incubare la configurazione della raccolta delle uova a temperatura ambiente per 15 minuti. Evitare l'anestesia (fredda, CO₂) durante questo passaggio, se possibile.
4. Riportare gli adulti al flaconcino di allevamento. Incubare il piatto di deposizione delle uova a una comoda combinazione temperatura/ tempo, quindi trasferire 10-20 embrioni con un piccolo pennello dal piatto di deposizione delle uova a un colino per celle di dimensioni delle maglie da 100 μm. Scartare il piatto di deposizione delle uova.
5. Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.4 per ogni linea Drosophila.

4. Raccolta di embrioni di Tribolium

NOTA: Per comodità, viene fornito uno schema della procedura di raccolta delle uova tribolium (figura 3A) a cui si riferiscono anche i numeri all'interno delle parentesi di questo passaggio.

1. Trasferire 200-300 adulti (circa 400-700 mg) della linea tribolium preferita in una bottiglia di vetro vuota da 1 L 2-10 giorni prima del saggio di imaging per stabilire una coltura di raccolta delle uova(Figura 3A_01). Riempire la bottiglia con 50-100 g di mezzo di crescita fresco. Se non ancora esistente, considera di iniziare una coltura di progenie usando larve e pupe disponibili. Per garantire che gli adulti non hanno più di 3 mesi, sostituisci la cultura della raccolta delle uova nel tempo con la cultura della progenie.
2. Passare la coltura della raccolta delle uova attraverso un setaccio di dimensioni delle maglie di 800 μm (Figura 3A_02). Riportare il mezzo di crescita, che contiene embrioni non messi in scena, nella bottiglia iniziale (Figura 3A_03 ) e trasferire gli adultiinuna bottiglia di vetro vuota da 1 L(figura 3A_04). Aggiungere 10 g di mezzo di deposizione delle uova (Figura 3A_05) e incubare l'impostazione di raccolta delle uova a temperatura ambiente per 1 h(Figura 3A_06,07).
3. Passare la configurazione della raccolta delle uova attraverso il setaccio di dimensioni delle maglie di 800 μm (Figura 3A_08). Riportare gli adulti alla loro bottiglia iniziale(figura 3A_09). A seconda del processo di sviluppo che dovrebbe essere immaginato, incubare il mezzo di deposizione delle uova, che ora contiene circa 30-100 embrioni, a una comoda combinazione temperatura/tempo(Figura 3A_10).
4. Passare il mezzo di deposizione delle uova attraverso il setaccio di dimensioni delle maglie di 300 μm(figura 3A_11) e trasferire gli embrioni (Figura 3A_12) a un colino cellulare di dimensioni delle maglie di 100 μm. Scartare il supporto setacciato per la deposizione delleuova (figura 3A_13).
5. Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.4 per ogni linea tribolium.

5. Dechorionazione a base di ipoclorito di sodio

NOTA: Sia gli embrioni di Drosophila che di Tribolium sono coperti da un corone, uno strato proteico protettivo e fortemente dispersore dalla luce che non è essenziale per un corretto sviluppo finché gli embrioni vengono mantenuti umidi dopo la rimozione. Il protocollo di dechorionation per gli embrioni di entrambe le specie è identico.

1. Preparare una piastra a 6 pocchi riempiendo i pozzi A1, A2, A3 e B3 con 8 mL di acqua del rubinetto autoclavata e i pozzi B1 e B2 con 7 mL di acqua del rubinetto autoclavata e 1 mL di ipoclorito di sodio (NaOCl) soluzione(Figura 3B). Osservare il processo di decorrionazione al microscopio stereo, idealmente nella luce di trasmissione.
   ATTENZIONE: L'ipoclorito di sodio è corrosivo.
2. Inserire il filtro cellulare contenente embrioni (Passaggio 3.4 e/o 4.4) nel pozzo A1 e lavare gli embrioni circa 30-60 s sotto delicata agitazione.
3. Spostare bene il filtro cellulare sul B1 e agitare vigorosamente le piastre per 30 s, quindi trasferirlo nel pozzo A2 e lavare gli embrioni per 1 minuto sotto delicata agitazione.
4. Spostare il colino cellulare nel pozzo B2 e scuotere vigorosamente la piastra fino a quando la maggior parte degli embrioni non viene completamente dechorionata (Figura 3C), quindi trasferirla nel pozzo A3 e lavare gli embrioni per 1 minuto sotto delicata agitazione.
5. Conservare bene il filtro cellulare nel B3 prima di procedere con la procedura di montaggio.
6. Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.5 per ogni riga.

6. Montaggio di più embrioni utilizzando il supporto della ragnatela

1. Riliquefare un'aliquota di agarosio in un riscaldatore/miscelatore a blocchi secchi a 80 °C, quindi lasciare raffreddare l'aliquota di agarosio a 35 °C.
2. Pipetta 10 μL di agarosio sopra il foro fessurato del supporto della ragnatela. Con la punta della pipetta, stendere l'agarosio sul foro fessurato, quindi aspirare il più possibile l'agarosio fino a quando rimane solo un sottile film di agarosio. Attendere 30-60 s per la solidificazione.
3. Per ogni linea, raccogliere con cura uno o più embrioni con un piccolo pennello e posizionarli sul film di agarosio.
4. Disporre gli embrioni lungo l'asse lungo del foro fessurato, quindi allineare anche il loro asse anteriore-posteriore con l'asse lungo del foro fessurato (Figura 3D).
5. Stabilizzare accuratamente gli embrioni pipettando 1-2 μL di agarosio nello spazio tra gli embrioni e il film di agarosio. Attendere 30-60 s per la solidificazione.
6. Inserire lentamente il supporto della ragnatela con gli embrioni montati nella camera campione riempita di buffer dell'immagine.

7. Imaging dal vivo comparativo in LSFM a camera campione

1. Spostare uno degli embrioni con le fasi di microtraslazione davanti alla lente di rilevamento. Assicurarsi che il supporto della ragnatela si trova in una posizione di 45° rispetto agli assi di illuminazione (x) e di rilevamento (z) (cfr. figura 1C).
2. Nel canale della luce di trasmissione, spostare l'embrione al centro del campo visivo. Il supporto della ragnatela non dovrebbe essere visibile.
3. Spostare l'embrione con gli stadi di microtraslazione in z fino a quando il piano intermedio dell'embrione si sovrappone al piano focale, cioè fino a quando il contorno appare nitido. Senza passare al canale di fluorescenza, specificare il volume della vista allontanando 250 μm dal piano intermedio in entrambe le direzioni.
4. Facoltativamente, se è richiesta l'imaging lungo più direzioni, ruotare l'embrione in modo appropriato e ripetere i passaggi 7.2 e 7.3. Il supporto per ragnatela supporta fino a quattro orientamenti in fasi di 90°.
5. Ripetere i passaggi da 7.1 a 7.3 (o 7.4) per tutti gli altri embrioni montati sul supporto della ragnatela (Figura 3E). Assicurarsi che l'embrione più in alto non lasci il buffer di imaging quando l'embrione più in basso si trova davanti alla lente di rilevamento.
6. Definire i parametri del canale di fluorescenza (potenza laser, tempo di esposizione, filtro di rilevamento) e time lapse (intervallo, durata totale) e avviare il processo di imaging. Per i valori indicativi, consultare la tabella dei metadati dei set di dati di esempio (Tabella supplementare 1). Per i saggi che durano diversi giorni, prendere in considerazione la possibilità di coprire l'apertura della camera campione almeno parzialmente per ridurre l'evaporazione.

8. Recupero e ulteriore coltivazione di embrioni con immagini

1. Al terminazione del test di imaging, rimuovere con cura il supporto della ragnatela dalla camera campione.
2. Staccare gli embrioni dal film di agarosio con un piccolo pennello e trasferirli in un vetrino del microscopio opportunamente etichettato. Posizionare lo scivolo in un piatto di recupero e incubare nelle rispettive condizioni di allevamento standard.
3. Per quanto riguarda le modalità sperimentali, stimare quando l'embriogenesi è completata. Con l'avvicinarsi del punto di tempo di schiusa, controlla frequentemente i piatti di recupero e trasferisci le larve di Drosophila tratteggiate alle singole fiale di allevamento e alle larve di Tribolium in singoli pozzi di un piatto di 24 po '. Riempire i pozzi fino alla metà con mezzo di crescita. Incubare nelle rispettive condizioni di allevamento standard.
4. Una volta che gli individui osservati sono adulti, fornire loro un partner di accoppiamento adatto e verificare la progenie dopo diversi giorni.

9. Elaborazione dei dati delle immagini e documentazione dei metadati

NOTA: Per l'elaborazione dei dati delle immagini, è consigliato imagej derivate FIJI³⁵ (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI non richiede l'installazione e sono disponibili versioni a 32 e 64 bit. Uno dei formati più utilizzati per i dati LSFM è il formato tiff (Tagged Image File Format), che consente la memorizzazione di stack di immagini sotto forma di contenitore TIFF.

1. Calcolare le proiezioni massime z per tutti gli stack z (Image | Stack | Progetto Z, scegliere Intensità massima). Le proiezioni massime sono approcci di semplificazione dei dati che riducono il numero di dimensioni spaziali da tre a due. Viene fornito uno script FIJI per l'elaborazione batch (File supplementare 1).
2. Concatenare le rispettive proiezioni massime z per creare pile di tempo (pile t). Salvarli in un contenitore TIFF. Eseguire questa attività per tutti gli embrioni registrati, nonché per le rispettive direzioni e canali di fluorescenza, se applicabile.
3. Ruotare la pila z e t attorno all'asse z per allineare l'asse anteriore-posteriore degli embrioni con l'asse dell'immagine x o y (Image | Trasforma | Ruotare). Ritaglia le pile z lungo tutti e tre gli assi dell'immagine e la pila t negli assi dell'immagine x e y in modo che rimanga solo uno spazio buffer minimo (20-40 pixel lungo gli assi x e y, 5-10 immagini lungo l'asse z) intorno all'embrione (Image | Regola | Dimensioni canvas per gli assi x e y, immagine | Stack | Strumenti | Filtro sezioni per l'asse z).
   1. Fallo individualmente per tutti gli embrioni registrati e le rispettive direzioni, se applicabile. I canali di fluorescenza, se del caso, devono essere elaborati con parametri di rotazione e ritaglio identici.
4. Documentare i metadati nel modo più dettagliato possibile. Come linea guida, è possibile utilizzare la tabella dei metadati dei set di dati di esempio, presenti nella sezione Risultati rappresentativi (Tabella complementare 1).

10. Visualizzazione dei dati

NOTA: Questa linea guida per la visualizzazione dei dati si concentra principalmente sulla creazione di matrici di immagini di proiezione massime z che mostrano diversi embrioni registrati lungo più direzioni e / o nel tempo. Nei passaggi seguenti viene descritta la procedura di visualizzazione dei dati applicata ai set di dati di esempio per la creazione delle figure mostrate e dei video collegati nella sezione Risultati rappresentativi.

1. Combina pile t di più direzioni(immagine | Stack | Strumenti | Combinare) e/o unire più canali di fluorescenza (Image | Colore | Merge Channels) per visualizzare la struttura biologica e/o il processo di interesse.
2. Regolare le intensità delle pile t (Image | Regola | Brightness/Contrast) in base alle esigenze utilizzando la funzione "Set". Il valore minimo visualizzato deve essere impostato leggermente al di sopra del segnale di sfondo, il valore massimo visualizzato dovrebbe comportare un contrasto conveniente. Documentare entrambi i valori, in quanto possono essere utilizzati per una regolazione coerente dei rispettivi stack z. Regolazioni dell'impronta utilizzandola funzione" Apply ". A seconda delle modalità sperimentali, prendere in considerazione l'elaborazione di tutti gli embrioni registrati con valori identici.
3. Salva gli stack t regolati in intensità come file separati, non ignorare gli stack t non regolati. Compilate sotto stack adatti dagli stack t regolati con funzioni di selezione delle immagini dedicate (ad esempio, image | Stack | Strumenti | Slice Keeper) e utilizzare lo strumento di montaggio (Image | Stack | Crea montaggio ( Make Montage) per creare griglie di immagini che possono essere utilizzate per la progettazione delle figure.

Risultati

Il nostro protocollo descrive un quadro sperimentale per l'imaging dal vivo a fluorescenza comparativa negli LSFM basati su camera campione. Ad esempio, la struttura può essere utilizzata per giustapporsi (i) embrioni di due o più specie, (ii) embrioni di linee in cui uno o più geni sono eliminati più controlli di tipo selvaggio, (iii) embrioni multipli della stessa linea transgenica, (iv) embrioni da diverse linee transgeniche, o (v) embrioni da sottolinee che trasportano la stessa transgenica , ma in diverse locali...

Discussione

Una delle aree di applicazione esclusive degli LSFM è la biologia dello sviluppo. In questa disciplina, è importante guardare gli esemplari viventi, altrimenti i processi morfogenetici non possono essere descritti in modo dinamico. Un quadro sperimentale per l'imaging live simultaneo negli LSFM a camera campione, come descritto qui, è conveniente per due motivi principali.

La varianza ambientale, che è inevitabile nell'imaging dal vivo sequenziale, può essere affrontata pro-attivamente. N...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300	Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	153066	Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	L9004575
100 µm mesh size cell strainer	BD Biosciences	352360
250 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-038	Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-040	Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-050	Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-051	Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	SP061006	Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium	Genesee Scientific	66-115	Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-108
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
narrow vials	Genesee Scientific	32-109	Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush	VWR International	149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl	Carl Roth	9062.3	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour	Demeter e.V.	SP061036	Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials	Genesee Scientific	32-110	Only for live imaging involving Drosophila