Imagens ao vivo simultâneas de embriões múltiplos de insetos em microscópios de fluorescência baseados em folha de luz da amostra

Resumo

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz é a ferramenta mais valiosa na biologia do desenvolvimento. Um grande problema em estudos comparativos é a variância ambiente. Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas de múltiplos espécimes e, portanto, aborda essa questão de forma pró-ativa.

Resumo

A microscopia de fluorescência baseada em folha de luz oferece soluções eficientes para estudar processos complexos em múltiplas escalas biologicamente relevantes. As configurações baseadas em câmaras de amostra, que são especificamente projetadas para preservar a integridade tridimensional do espécime e geralmente apresentam rotação de amostras, são a melhor escolha em biologia do desenvolvimento. Por exemplo, eles têm sido usados para documentar toda a morfogênese embrionária da mosca-das-frutas Drosophila melanogaster e do besouro de farinha vermelha Tribolium castaneum. No entanto, muitos protocolos de imagem ao vivo disponíveis fornecem apenas estruturas experimentais para embriões únicos. Especialmente para estudos comparativos, tais abordagens são inconvenientes, uma vez que espécimes sequencialmente imagens são afetados pela variância ambiente. Além disso, limita o número de espécimes que podem ser testados dentro de um determinado tempo. Fornecemos uma estrutura experimental para imagens ao vivo simultâneas que aumenta o throughput em configurações baseadas em câmaras de amostra e, portanto, garante condições ambientais semelhantes para todos os espécimes. Em primeiro lugar, fornecemos uma diretriz de calibração para microscópios de fluorescência de folha de luz. Em segundo lugar, propomos um método de montagem para múltiplos embriões compatível com a rotação de amostras. Em terceiro lugar, fornecemos conjuntos de dados de imagem ao vivo tridimensionais exemplares de Drosophila, para os quais justapõem três linhas transgênicas com núcleos fluorescentes rotulados, bem como de Tribolium,para os quais comparamos o desempenho de três sublines transgênicas que carregam o mesmo transgênico, mas em diferentes locais genômicos. Nosso protocolo é especificamente projetado para estudos comparativos, pois aborda proativamente a variância ambiente, que está sempre presente em imagens vivas sequenciais. Isso é especialmente importante para análises quantitativas e caracterização de fenótipos aberrationais, que resultam, por exemplo, de experimentos eliminatórios. Além disso, aumenta o throughput global, que é altamente conveniente quando o acesso a microscópios de fluorescência de folha de luz é limitado. Finalmente, o método de montagem proposto pode ser adaptado para outras espécies de insetos e outros organismos modelo, por exemplo, zebrafish, sem basicamente nenhum esforço de otimização.

Introdução

A microscopia de fluorescência é uma das técnicas de imagem mais essenciais nas ciências da vida, especialmente na biologia celular e de desenvolvimento. Nos microscópios de fluorescência confocal¹, que são de última geração para imagens de fluorescência tridimensional desde meados da década de 1990, a mesma lente é usada para excitação fluorófora e detecção de luz de emissões. O raio laser de iluminação excita todos os fluoroforos ao longo do eixo de iluminação/detecção e o respectivo sinal fora de foco é discriminado antes da detecção por um orifício. Assim, para cada imagem bidimensional, todo o espécime é iluminado. Consequentemente, para cada imagem tridimensional, ou seja, uma pilha de imagens tridimensionais espacialmente consecutivas, todo o espécime é iluminado várias dezenas a algumas centenas^{de vezes 2}, o que promove fotobleaching e fototoxicidade³.

Há quase vinte anos, a tecnologia⁴ surgiu como uma alternativa promissora para a imagem de fluorescência tridimensional e, assim, tornou-se uma ferramenta valiosa na biologia do desenvolvimento⁵. Nesta abordagem, a iluminação e a detecção são dissociadas. A lente de iluminação é usada para gerar uma folha de luz com uma profundidade de apenas alguns micrômetros dentro do plano focal da lente de detecção perpendicularmente organizada. Assim, para cada imagem bidimensional, apenas um fino volume planar ao redor do plano focal é iluminado. Consequentemente, para cada imagem tridimensional, todo o espécime é iluminado apenas uma vez, o que diminui fortemente o fotobleaching e a fototoxicidade⁶. Por essa razão, os microscópios de fluorescência de folhas de luz (LSFMs) oferecem soluções eficientes para estudar processos complexos em múltiplas escalas biologicamente relevantes e são, portanto, de valor particular na biologia do desenvolvimento, onde espécimes tão grandes quanto vários milímetros devem ser analisados no nível subcelular.

Historicamente, os LSFMs têm sido baseados em câmara de amostra^7,8. Nestas configurações, os eixos de iluminação (x) e detecção (z) são geralmente organizados perpendicularmente ao eixo de gravidade (y). As câmaras de amostra oferecem ampla liberdade experimental. Em primeiro lugar, eles fornecem grandes capacidades de tampão de imagem, o que, por sua vez, facilita o uso de um sistema de perfusão para controlar o ambiente, por exemplo, para manter uma temperatura específica⁹ ou para aplicar estressores bioquímicos. Além disso, eles suportam métodos de montagem personalizados¹⁰ que são adaptados às respectivas necessidades experimentais, preservando o tridimensional, em alguns casos dinâmico¹¹, integridade do espécime. Além disso, as configurações baseadas em câmaras de amostra são geralmente equipadas com uma função de rotação que é usada para girar os espécimes ao redor do eixo y e, assim, imagen-los ao longo de duas, quatro ou até mais direções. Uma vez que os embriões de organismos modelos comumente usados são, no contexto da microscopia, imagens relativamente grandes e sucessivas ao longo dos eixos ventral-dorsal, lateral e/ou anterior-posterior do corpo fornecem uma representação mais abrangente. Isso permite, por exemplo, o rastreamento a longo prazo de células que se movem ao longo de complexas rotas de migração tridimensional^12,13.

A microscopia de fluorescência à base de folha de luz tem sido aplicada extensivamente para estudar a morfogênese embrionária de Drosophila melanogaster, ambos sistematicamente^14,15, bem como com foco específico nos aspectos biofísicos do desenvolvimento. Por exemplo, foi usado para coletar dados morfogenéticos de alta resolução, a fim de detectar uma ligação biomecânica entre a invaginação do endoderme e a extensão do eixo durante o alongamento da banda germinal¹⁶ e ainda para relacionar o complexo fluxo celular com padrões de geração de força durante a gastrulação¹⁷. Também foi combinado com outras técnicas de última geração, por exemplo, optogenética para investigar a regulação da sinalização Wnt durante a padronização anterior-posterior na epiderme¹⁸.

No entanto, estudar apenas uma espécie não fornece insights sobre a evolução do desenvolvimento. Para entender a embriogênese dentro do contexto filogenético, pesquisas intensivas têm sido realizadas com organismos alternativos de modelos de insetos. Uma das espécies mais bem investigadas é o besouro de farinha vermelha Tribolium castaneum, uma praga de grãos armazenados economicamente relevante^19,cuja morfogênese embrionária também já foi sistematicamente imageada com LSFM²⁰. A morfogênese embrionária dessas duas espécies difere notavelmente em vários aspectos, por exemplo, no modo de segmentação^21,bem como na formação e degradação das membranas extraembrionárias²². Este último aspecto já foi extensivamente analisado utilizando LSFMs. Por exemplo, foi demonstrado que o serosa, um tecido extraembrionário que envolve e protege o embrião do Tribípio de vários perigos para a maior parte de sua embriogênese^23,24, também atua como o "driver" morfogenético para seu próprio processo de retirada durante o fechamento dorsal²⁵. Além disso, foi demonstrado que durante a gastruação, uma determinada região do blastoderm permanece ancorada na membrana vitelline, a fim de criar movimentos assimétricos do tecido²⁶ e, após essa observação, que a fluidização de tecido regionalizado permite que as células deixem sequencialmente a borda serosa durante o fechamento da janela^{serosa 27}.

Em todos os estudos associados à Drosophila- e triboliumcitados acima, foram utilizados LSFMs baseados em câmaras de amostra. Na maioria, os embriões foram registrados ao longo de várias direções usando a função de rotação da amostra. Embora não declarado explicitamente, pode-se supor que eles foram registrados individualmente e, portanto, independentes uns dos outros em ensaios de imagem ao vivo sequencial, semelhante ao nosso trabalho anterior em Tribolium^20,28. Em certos cenários, tal abordagem é aceitável, mas especialmente em abordagens quantitativas comparativas, a variância ambiente pode distorcer os resultados. Por exemplo, sabe-se há muito tempo que a velocidade de desenvolvimento dos insetos é dependente da temperatura^29,mas um estudo mais recente sugere ainda que em Drosophila, a temperatura também pode afetar a concentração de morfogênicos³⁰. Consequentemente, se certas características da embriogênese, por exemplo, as proporções dinâmicas, as taxas de divisão e as velocidades de migração das células, devem ser precisamente quantificadas, são necessárias repetições suficientes sem variância ambiente. Isso minimiza desvios padrão e erros padrão, o que, por sua vez, facilita a justaposição com outras condições experimentais, mesmo que marginalmente divergentes.

No entanto, os LSFMs baseados em câmara de amostra são projetados principalmente para alto conteúdo em vez de ensaios de alto rendimento. Ao contrário dos microscópios confocal, que são tipicamente equipados com mecanismos padronizados de grampo para lâminas de microscopia, placas de Petri e placas de poço, quase todos os LSFMs baseados em câmara de amostra usam mecanismos de grampo baseados em cilindros. Estes mecanismos destinam-se a suportes de amostra personalizados compatíveis com a rotação, bem como não invasivos^10,mas geralmente não projetados para mais de uma amostra^20,31,32. Uma estrutura para imagens ao vivo simultâneas de dois ou mais embriões, em que as vantagens das configurações baseadas em câmaras de amostra não são comprometidas, aborda a questão da variância ambiente, aumentando assim o valor dos LSFMs para estudos comparativos.

Em nosso protocolo, apresentamos uma estrutura experimental para imagens ao vivo comparativas em LSFMs baseados em câmara de amostra (Figura 1A) em que o eixo y é usado como opção para "empilhar" embriões. Em primeiro lugar, fornecemos uma diretriz de calibração baseada em microesfera fluorescente para LSFMs baseados em câmara de amostra, o que é especialmente importante para instrumentos que não possuem um assistente de calibração. Em segundo lugar, descrevemos um método de montagem para múltiplos embriões baseado no suporte da teia de aranha²⁸ (Figura 1B) que é compatível com a rotação da amostra e, portanto, permite imagens simultâneas de múltiplas amostras ao longo de múltiplas direções(Figura 1C). Vários embriões são alinhados em cima de um filme fino de ágarose e, após a inserção na câmara de amostra, moveram-se sucessivamente através da folha de luz para adquirir imagens tridimensionais. Em terceiro lugar, fornecemos três conjuntos de dados de imagem ao vivo exemplares para Drosophila, bem como para Tribolium. Para o primeiro, justapomos linhas transgênicas com núcleos fluorescentes rotulados. Para este último, comparamos o desempenho de sublines transgênicas que carregam o mesmo transgênico, mas em diferentes locais genômicos. Por fim, discutimos a importância da paraleloização no que diz respeito à imagem ao vivo comparativa e à variância ambiente^33,debatemos o limite de rendimento de nosso quadro experimental e avaliamos a adaptação de nossa abordagem a outros organismos modelo.

Protocolo

1. Trabalho preparatório

1. Escolha uma combinação de lente/lente de detecção/câmera de iluminação para o LSFM que se adapte à questão científica e configure o microscópio. O tamanho do campo de visão é o quociente do tamanho do chip da câmera e a ampliação da lente de detecção. A lente de iluminação deve ser escolhida para que todo o campo de visão seja coberto por uma folha de luz aproximadamente planar³⁴. Três combinações recomendadas estão listadas na Tabela 1.
2. Para preparar alíquotas e pratos de recuperação, adicione 2 g de baixa derretimento à água da torneira autoclavada de 200 mL e aqueça a mistura em um forno de micro-ondas a 600-800 W até que todas as partículas de ágarose sejam dissolvidas. Prepare várias alíquotas de 1 mL em tubos de reação de 1,5 mL ou 2 mL, depois encha várias placas Ø Petri de 90 mm de 3-5 mm de altura com agarose. Armazene alíquotas e pratos solidificados a 4 °C.
3. Para Drosophila: Para preparar frascos de criação frescos, cozinhe uma quantidade adequada de meio Drosophila personalizado ou comercialmente disponível, transfira 5-15 mL em frascos largos e armazene-os a 4 °C. Para preparar pratos de colocação de ovos, adicione 1 g de agarose de baixo derretimento a 50 mL de água da torneira autoclavada e aqueça a mistura em um forno de micro-ondas a 600-800 W até que todas as partículas de agarose sejam dissolvidas. Deixe a mistura esfriar até 45 °C, depois adicione 50 mL de suco de fruta (de preferência maçã ou uva vermelha) e misture bem. Despeje a mistura em pratos Ø Petri de 35 mm e armazene pratos solidificados de colocação de ovos a 4 °C.
4. Para o Tribolium: Para preparar o meio de crescimento, passe a farinha de trigo integral, bem como a levedura seca inativa através de uma peneira de tamanho de malha de 710 μm, em seguida, suplementar a farinha peneirada com 5% (w/w) levedura peneirada. Para preparar o meio de colocação de ovos, passe farinha de trigo fina, bem como levedura seca inativa através de uma peneira de tamanho de malha de 250 μm e, em seguida, suplementar a farinha peneirada com levedura peneirada de 5% (w/w).

2. Calibração de LSFMs baseados em câmara de amostra usando microesferas fluorescentes

NOTA: O objetivo da calibração é alinhar os pontos focais das lentes de iluminação e detecção(Figura 2A),pois esta é a premissa para imagens claras. Os LSFMs devem ser calibrados regularmente, pelo menos uma vez a cada 3-4 semanas.

1. Liquefate uma alíquota agarose em um aquecedor/misturador de bloco seco a 80 °C, em seguida, permita que a alíquota agarose esfrie até 35 °C.
2. Transfira 50 μL de agarose para um tubo de reação de 1,5 mL e adicione 0,5 μL de solução de microesfera fluorescente. Misture a 1.400 rpm por 1 min.
3. Encha o orifício ranhuado do suporte da teia de aranha com 10 μL de mistura de solução de agarose/microesfera fluorescente, em seguida, aspire o máximo de agarose possível até que apenas um filme de ágarose fina permaneça. Espere 30-60 s para solidificação.
4. Encha a câmara de amostra com água da torneira autoclavada. Insira o suporte da teia de aranha lentamente na câmara de amostra e mova o orifício ranhuado com os estágios de microtranslização na frente da lente de detecção.
5. Gire o suporte da teia de aranha com o estágio de rotação para uma posição de 45° em relação aos eixos de iluminação (x) e detecção (z). O suporte da teia de aranha não deve ser visível no canal de luz de transmissão.
6. Mude para o respectivo canal de fluorescência e ajuste a potência do laser, bem como o tempo de exposição para que as microesferas fluorescentes forneçam sinal adequado.
7. Especifique um volume de visualização que cubra completamente o filme agarose orientado transversalmente. Defina o espaçamento z calculando a resolução axial máxima possível para a respectiva combinação de lente de iluminação/lente de detecção³⁴. Alternativamente, 4 vezes a resolução lateral pode ser usada como uma aproximação áspera.
8. Regissão um teste tridimensional z pilha das microesferas fluorescentes e compare as projeções máximas x, y e z com o gráfico de calibração(Figura 2). Se as microesferas aparecerem embaçadas, difusas e/ou distorcidas(Figura 2B,C),ajuste as posições da lente de iluminação e/ou detecção.

3. Coleção de embriões de Drosophila

1. Transfira 100-200 adultos da linha Drosophila de escolha para um frasco de criação fresco 2-3 dias antes do ensaio de imagem para estabelecer uma cultura de coleta de ovos. Se ainda não existe, considere usar o velho frasco de criação para iniciar uma cultura descendente. Para garantir que os adultos não têm mais de duas semanas, substitua a cultura de coleta de embriões a tempo pela cultura progênia.
2. Aqueça um prato de colocação de ovos à temperatura ambiente e adicione uma gota de pasta de levedura em cima do ágar.
3. Transfira os adultos da cultura de coleta de ovos para um frasco estreito vazio e coloque-o em cima do prato de colocação de ovos. Incubar a configuração de coleta de ovos em temperatura ambiente por 15 minutos. Evite anestesia (fria, CO₂) durante esta etapa, se possível.
4. Devolva os adultos ao frasco de criação. Incubar o prato de colocação de ovos em uma combinação conveniente de temperatura/tempo, em seguida, transfira 10-20 embriões com um pequeno pincel do prato de colocação de ovos para um coador de células de tamanho de malha de 100 μm. Descarte o prato de colocação de ovos.
5. Repita as etapas 3.1 a 3.4 para cada linha Drosophila.

4. Coleção de embriões de Tribálio

NOTA: Por conveniência, é fornecido um esquema do procedimento de coleta de ovos de Tribálio (Figura 3A)ao qual também se referem os números dentro dos suportes nesta etapa.

1. Transfira 200-300 adultos (cerca de 400-700 mg) da linha Tribolium de escolha para uma garrafa de vidro 1 L vazia 2-10 dias antes do ensaio de imagem para estabelecer uma cultura de coleta de ovos(Figura 3A_01). Encha a garrafa com 50-100 g de meio de crescimento fresco. Se ainda não existir, considere iniciar uma cultura progênita usando larvas e pupas disponíveis. Para garantir que os adultos não têm mais de 3 meses, substitua a cultura da coleta de ovos a tempo pela cultura progênia.
2. Passe a cultura de coleta de ovos através de uma peneira de tamanho de malha de 800 μm(Figura 3A_02). Devolva o meio de crescimento, que contém embriões não encenados, à garrafa inicial(Figura 3A_03) e transfira os adultos para uma garrafa de vidro 1 L vazia(Figura 3A_04). Adicione 10 g de meio de colocação de ovos(Figura 3A_05) e incubar a configuração da coleta de ovos à temperatura ambiente por 1h(Figura 3A_06,07).
3. Passe a configuração da coleta de ovos através da peneira de tamanho de malha de 800 μm(Figura 3A_08). Devolva os adultos à sua garrafa inicial(Figura 3A_09). Dependendo do processo de desenvolvimento que deve ser imageado, incubar o meio de colocação de ovos, que agora contém cerca de 30-100 embriões, a uma combinação conveniente de temperatura/tempo(Figura 3A_10).
4. Passe o meio de colocação de ovos através da peneira de tamanho de malha de 300 μm(Figura 3A_11) e transfira os embriões(Figura 3A_12) para um coador de células de tamanho de malha de 100 μm. Descarte a mídia peneirada de colocação de ovos(Figura 3A_13).
5. Repita as etapas 4.1 a 4.4 para cada linha Tribolium.

5. Descorionação à base de hipoclorito de sódio

NOTA: Tanto os embriões de Drosophila quanto o Tribolium são cobertos por um acorde, uma camada protetiva e fortemente leve que não é essencial para o desenvolvimento adequado, desde que os embriões sejam mantidos úmidos após a remoção. O protocolo de descorção para os embriões de ambas as espécies é idêntico.

1. Prepare uma placa de 6 poços preenchendo os poços A1, A2, A3 e B3 com 8 mL de água da torneira autoclavada e os poços B1 e B2 com 7 mL de água da torneira autoclavada e 1 mL de solução de hipoclorito de sódio (NaOCl)(Figura 3B). Observe o processo de descorção sob um microscópio estéreo, idealmente em luz de transmissão.
   ATENÇÃO: A hipoclorito de sódio é corrosiva.
2. Insira o coador celular contendo embriões (Passo 3.4 e/ou 4.4) no poço A1 e lave os embriões cerca de 30-60 s sob suave agitação.
3. Mova o coador de células para o B1 bem e agite as placas vigorosamente por 30 s, depois transfira-a para o poço A2 e lave os embriões por 1 min sob suave agitação.
4. Mova o coador de células para o B2 bem e agite a placa vigorosamente até que a maioria dos embriões estejam completamente descorioados(Figura 3C), depoistransfira-o para o poço A3 e lave os embriões por 1 minuto sob agitação suave.
5. Armazene bem o coador de células na B3 antes de prosseguir com o procedimento de montagem.
6. Repita as etapas 5.1 a 5.5 para cada linha.

6. Montagem de embriões múltiplos usando o suporte da teia de aranha

1. Liquefate uma alíquota agarose em um aquecedor/misturador de bloco seco a 80 °C, em seguida, permita que a alíquota agarose esfrie até 35 °C.
2. Pipet 10 μL de agarose em cima do orifício ranhuado do suporte da teia de aranha. Com a ponta da pipeta, espalhe a agarose sobre o orifício ranhudo, depois aspire o máximo possível de agarose até que apenas um filme de agarose fina permaneça. Espere 30-60 s para solidificação.
3. Para cada linha, escolha cuidadosamente um ou mais embriões com um pequeno pincel e coloque-os no filme agarose.
4. Disponha os embriões ao longo do longo eixo do orifício ranhutado, em seguida, também alinhe seu eixo anterior-posterior com o eixo longo do orifício ranhuted(Figura 3D).
5. Estabilize os embriões cuidadosamente, pipetando 1-2 μL de agarose na lacuna entre os embriões e o filme agarose. Espere 30-60 s para solidificação.
6. Insira o suporte da teia de aranha com os embriões montados lentamente na câmara de amostra cheia de tampão de imagem.

7. Imagem ao vivo comparativa em LSFMs baseados em câmara de amostra

1. Mova um dos embriões com os estágios de microtranslação na frente da lente de detecção. Certifique-se de que o suporte da teia de aranha esteja em uma posição de 45° em relação aos eixos de iluminação (x) e detecção (z) (cf. Figura 1C).
2. No canal de luz de transmissão, mova o embrião para o centro do campo de visão. O suporte da teia de aranha não deve ser visível.
3. Mova o embrião com os estágios de microtranslização em z até que o plano médio do embrião se sobreponha ao plano focal, ou seja, até que o contorno pareça afiado. Sem mudar para o canal de fluorescência, especifique o volume de visualização movendo-se 250 μm de distância do plano médio em ambas as direções.
4. Opcionalmente, se for necessária a imagem ao longo de várias direções, gire o embrião adequadamente e repita as etapas 7.2 e 7.3. O suporte da teia de aranha suporta até quatro orientações em etapas de 90°.
5. Repita as etapas 7.1 a 7.3 (ou 7.4) para todos os outros embriões montados no suporte da teia de aranha(Figura 3E). Certifique-se de que o embrião superior não deixe o tampão de imagem quando o embrião inferior estiver na frente da lente de detecção.
6. Defina os parâmetros do canal de fluorescência (potência do laser, tempo de exposição, filtro de detecção) e lapso de tempo (intervalo, duração total) e inicie o processo de imagem. Para valores indicativos, consulte a tabela de metadados dos conjuntos de dados de exemplo (Tabela Complementar 1). Para ensaios que duram vários dias, considere cobrir a abertura da câmara de amostra pelo menos parcialmente para reduzir a evaporação.

8. Recuperação e maior cultivo de embriões imaged

1. Quando o ensaio de imagem terminar, remova cuidadosamente o suporte da teia de aranha da câmara de amostra.
2. Retire os embriões do filme agarose com um pequeno pincel e transfira-os para um slide de microscópio apropriadamente rotulado. Coloque o slide em uma antena de recuperação e incubar sob as respectivas condições de criação padrão.
3. Em relação às modalidades experimentais, estima-se quando a embriogênese for concluída. À medida que o ponto de tempo de eclosão se aproxima, verifique os pratos de recuperação com frequência e transfira larvas de Drosophila eclodidas para frascos de criação individuais e larvas de Tribólio para poços individuais de uma placa de 24 poços. Encha os poços até a metade com meio de crescimento. Incubar sob as respectivas condições de criação padrão.
4. Uma vez que os indivíduos observados são adultos, forneça-lhes um parceiro de acasalamento adequado e verifique se há progêneo após vários dias.

9. Processamento de dados de imagem e documentação de metadados

NOTA: Para o processamento de dados de imagem, recomenda-se o derivado ImageJ FIJI³⁵ (imagej.net/Fiji/Downloads). O FIJI não requer instalação e versões de 32 e 64 bits estão disponíveis. Um dos formatos mais usados para dados LSFM é o formato de arquivo de imagem marcado (TIFF), que permite o armazenamento de pilhas de imagens na forma de um recipiente TIFF.

1. Calcule as projeções máximas de z para todas as pilhas z(Imagem | Pilhas | Projeto Z, escolha Intensidade Máxima). Projeções máximas são abordagens de simplificação de dados que reduzem o número de dimensões espaciais de três para dois. Um script FIJI para processamento em lote é fornecido(Arquivo Suplementar 1).
2. Concatenar as respectivas projeções máximas de z para criar pilhas de tempo (pilhas de t). Guarde isso em um recipiente TIFF. Faça isso para todos os embriões registrados, bem como para as respectivas direções e canais de fluorescência, se aplicável.
3. Gire a pilha z e t ao redor do eixo z para alinhar o eixo anterior-posterior dos embriões com o eixo de imagem x ou y(Imagem | Transforme | Gire). Crop as pilhas z ao longo de todos os três eixos de imagem e a pilha t nos eixos de imagem x e y de modo que apenas o espaço mínimo de buffer (20-40 pixels ao longo dos eixos x e y, 5-10 imagens ao longo do eixo z) em torno dos restos de embrião(Imagem | Ajuste | Tamanho da tela para os eixos x e y, imagem | Pilhas | Ferramentas | Corta Guardião para o eixo z).
   1. Faça isso individualmente para todos os embriões registrados, bem como para as respectivas direções, se aplicável. Os canais de fluorescência, se aplicável, devem ser processados com parâmetros de rotação e corte idênticos.
4. Documente os metadados o mais detalhado possível. Como diretriz, a tabela de metadados dos conjuntos de dados de exemplo, que são apresentados na seção Resultados Representativos, pode ser utilizada (Tabela Suplementar 1).

10. Visualização de dados

NOTA: Esta diretriz de visualização de dados se concentra principalmente na criação de matrizes de imagem de projeção máxima z que mostram vários embriões gravados ao longo de várias direções e/ou ao longo do tempo. As etapas a seguir descrevem o procedimento de visualização de dados aplicado aos conjuntos de dados de exemplo para a criação dos números mostrados e vídeos vinculados na seção Resultados Representativos.

1. Combine pilhas de várias direções(| de imagem Pilhas | Ferramentas | Combine) e/ou mescle vários canais de fluorescência(imagem | | de cor Mesclar Canais) para visualizar a estrutura biológica e/ou processo de interesse.
2. Ajuste as intensidades das pilhas t(Imagem | Ajuste | Brilho/Contraste) conforme necessário usando a função "Set". O valor mínimo exibido deve ser definido ligeiramente acima do sinal de fundo, o valor máximo exibido deve resultar em um contraste conveniente. Documente ambos os valores, pois podem ser usados para um ajuste consistente das respectivas pilhas z. Ajuste de impressão usando a função "Aplicar". Dependendo das modalidades experimentais, considere processar todos os embriões registrados com valores idênticos.
3. Salve pilhas de t ajustadas com intensidade como arquivos separados, não substitua as pilhas de t não ajustadas. Compilar sub pilhas adequadas das pilhas de t ajustadas com funções de seleção de imagem dedicadas (por exemplo, imagem | Pilhas | Ferramentas | Slice Keeper) e use a ferramenta de montagem(Imagem | Pilhas | Faça montage) para criar grades de imagem que podem ser usadas para o design de figuras.

Resultados

Nosso protocolo descreve uma estrutura experimental para imagens ao vivo de fluorescência comparativa em LSFMs baseados em câmara de amostra. Por exemplo, a estrutura pode ser usada para justapor (i) embriões (i) de duas ou mais espécies, (ii) embriões de linhas em que um ou mais genes são eliminados mais controles do tipo selvagem, (iii) embriões múltiplos da mesma linha transgênica, (iv) embriões de diferentes linhas transgênicas, ou (v) embriões de sublines que carregam o mesmo transgene , mas em diferente...

Discussão

Uma das áreas de aplicação exclusivas dos LSFMs é a biologia do desenvolvimento. Nesta disciplina, é importante olhar para espécimes vivos, caso contrário, processos morfogenéticos não podem ser descritos de forma dinâmica. Uma estrutura experimental para a imagem ao vivo simultânea em LSFMs baseados em câmara de amostras, como descrito aqui, é conveniente por duas razões principais.

A variância ambiente, que é inevitável em imagens vivas sequenciais, pode ser tratada proativa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300	Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	153066	Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	L9004575
100 µm mesh size cell strainer	BD Biosciences	352360
250 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-038	Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-040	Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-050	Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-051	Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	SP061006	Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium	Genesee Scientific	66-115	Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-108
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
narrow vials	Genesee Scientific	32-109	Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush	VWR International	149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl	Carl Roth	9062.3	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour	Demeter e.V.	SP061036	Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials	Genesee Scientific	32-110	Only for live imaging involving Drosophila