הדמיה חיה בו זמנית של עוברי חרקים מרובים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים מבוססי גיליון אור קאמרית לדוגמה

Summary

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מבוססת יריעות אור היא הכלי בעל הערך הרב ביותר בביולוגיה התפתחותית. נושא מרכזי במחקרים השוואתיים הוא שונות הסביבה. הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית של דגימות מרובות, ולכן מטפל בנושא זה באופן פעיל.

Abstract

מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מבוססת יריעות אור מציעה פתרונות יעילים לחקר תהליכים מורכבים בכמה קשקשים רלוונטיים ביולוגית. הגדרות מבוססות תא לדוגמה, אשר תוכננו במיוחד כדי לשמר את השלמות התלת מימדית של הדגימה ובדרך כלל כוללות סיבוב מדגם, הן הבחירה הטובה ביותר בביולוגיה התפתחותית. למשל, הם שימשו כדי לתעד את כל מורפוגנזה עוברית של זבוב הפירות Drosophila melanogaster ואת חיפושית הקמח האדום Tribolium castaneum. עם זאת, פרוטוקולי הדמיה חיים זמינים רבים מספקים רק מסגרות ניסיוניות לעוברים בודדים. במיוחד עבור מחקרים השוואתיים, גישות כאלה אינן נוחות, שכן דגימות בתמונה רציפה מושפעות מהשונות הסביבתית. כמו כן, זה מגביל את מספר הדגימות שניתן לציין בתוך זמן נתון. אנו מספקים מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית המגבירה את התפוקה בהגדרות מבוססות תא מדגמי ובכך מבטיחה תנאי סביבה דומים לכל הדגימות. ראשית, אנו מספקים קו מנחה לכיול עבור מיקרוסקופים פלואורסצנטיים של יריעות אור. שנית, אנו מציעים שיטת הרכבה עבור עוברים מרובים התואמת לסיבוב מדגם. שלישית, אנו מספקים מודלים תלת מימדיים למופת של הדמיה חיה של Drosophila, שעבורם אנו ממקמים שלושה קווים מהונדסים עם גרעינים מתויגים פלואורסצנטיים, כמו גם של טריבוליום, שעבורו אנו משווים את הביצועים של שלושה קווי משנה מהונדסים הנושאים את אותו טרנסג'ין, אך במקומות גנומיים שונים. הפרוטוקול שלנו תוכנן במיוחד למחקרים השוואתיים מכיוון שהוא מטפל באופן פעיל בשונות הסביבה, שתמיד קיימת בהדמיה חיה רציפה. זה חשוב במיוחד לניתוחים כמותיים ואפיון של פנוטיפים חריגים, הנובעים למשל מניסויי נוקאאוט. כמו כן, הוא מגדיל את התפוקה הכוללת, וזה מאוד נוח כאשר הגישה למיקרוסקופים פלואורסצנטיים יריעות אור מוגבלת. לבסוף, שיטת ההרכבה המוצעת יכולה להיות מותאמת עבור מיני חרקים אחרים ואורגניזמים מודל נוסף, למשל, זברה, עם בעצם שום מאמץ אופטימיזציה.

Introduction

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית היא אחת מטכניקות ההדמיה החיוניות ביותר במדעי החיים, במיוחד בביולוגיה התאית וההתפתחותית. במיקרוסקופים פלואורסצנטיים קונפוקאליים¹, שהם המדינה-of-the-art עבור הדמיית פלואורסצנטיות תלת מימדית מאז אמצע שנות התשעים, אותה עדשה משמשת עבור עירור פלואורופור וזיהוי אור פליטה. קרן הלייזר לתאורה מרגשת את כל הפלואורופורים לאורך ציר התאורה/זיהוי והאות המופרך בהתאמה מופלה לפני הגילוי על ידי חור סיכה. לפיכך, עבור כל תמונה דו מימדית, כל הדגימה מוארת. כתוצאה מכך, עבור כל תמונה תלת מימדית, כלומר, ערימה של תמונות דו מימדיות רצופות, הדגימה כולה מוארת כמה עשרות עד כמה מאות פעמים², אשר מקדם photobleaching ו phototoxicity³.

לפני כמעט עשרים שנה, טכנולוגיה מבוססת יריעות אור⁴ התגלתה כחלופה מבטיחה להדמיית פלואורסצנטיות תלת מימדית ובכך הפכה לכלי רב ערך בביולוגיה התפתחותית⁵. בגישה זו, תאורה וזיהוי הם decoupled. עדשת התאורה משמשת ליצירת יריעת אור בעומק של מיקרומטרים בודדים בלבד במישור המוקד של עדשת הגילוי המאורגמת בניצב. לפיכך, עבור כל תמונה דו מימדית, רק נפח מישורי דק סביב מישור המוקד מואר. כתוצאה מכך, עבור כל תמונה תלת מימדית, הדגימה כולה מוארת רק פעם אחת, אשר מקטין מאוד photobleaching ו phototoxicity⁶. מסיבה זו, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים של יריעות אור (LSFMs) מציעים פתרונות יעילים לחקר תהליכים מורכבים בכמה קשקשים רלוונטיים ביולוגית והם, אם כן, בעלי ערך מיוחד בביולוגיה התפתחותית, שבה דגימות גדולות כמו כמה מילימטרים יש לנתח ברמה התת-תאית.

מבחינה היסטורית, LSFMs כבר מדגם תא מבוסס^7,8. בהגדרות אלה, צירי התאורה (x) והזיהוי (z) מסודרים בדרך כלל בניצב לציר הכבידה (y). תאי מדגם מציעים חופש ניסיוני בשפע. ראשית, הם מספקים קיבולות חיץ הדמיה גדולות, אשר בתורו מקל על השימוש במערכת זלוף כדי לשלוט בסביבה, למשל, כדי לשמור על טמפרטורה מסוימת⁹ או ליישם גורמי לחץ ביוכימיים. כמו כן, הם תומכים בשיטות הרכבה מותאמות אישית¹⁰ המותאמות לצרכים הניסיוניים המתאימים תוך שמירה על תלת מימד, במקרים מסוימים דינמי¹¹, שלמות הדגימה. בנוסף, הגדרות מבוססות תא מדגם מצוידות בדרך כלל בפונקציית סיבוב המשמשת לסובב את הדגימות סביב ציר y ובכך לדמות אותם לאורך שניים, ארבעה או אפילו יותר כיוונים. מאז עוברים של אורגניזמים מודל נפוץ הם, בהקשר של מיקרוסקופיה, גדול יחסית, הדמיה רצופה לאורך גחון הגב, לרוחב, ו / או צירי גוף אחוריים מספק ייצוג מקיף יותר. זה מאפשר למשל מעקב ארוך טווח אחר תאים שזזים לאורך נתיבי העברה תלת מימדיים מורכבים^12,13.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מבוסס גיליון אור יושם בהרחבה כדי לחקור את המורפוגנזה העוברית של Drosophila melanogaster, הן באופן שיטתי^14,15, כמו גם עם דגש ספציפי על ההיבטים הביופיזיים של הפיתוח. לדוגמה, הוא שימש לאיסוף נתונים מורפוגנטיים ברזולוציה גבוהה על מנת לזהות קשר ביומכני בין פולשניות אנדודרם והרחבת ציר במהלך התארכות חיידקים¹⁶ ועוד כדי לקשר את הזרימה התאית המורכבת עם דפוסי יצירת כוח במהלך gastrulation¹⁷. זה גם שולב עם טכניקות המדינה-of-the-art אחרים, למשל, אופטוגנטיקה כדי לחקור את הרגולציה של איתות Wnt במהלך דפוס אחורי-ראשי באפידרמיס¹⁸.

עם זאת, לימוד מין אחד בלבד אינו מספק תובנות על התפתחות ההתפתחות. כדי להבין עובריות בהקשר הפילוגנטי, נערך מחקר אינטנסיבי עם אורגניזמים חלופיים של מודל חרקים. אחד המינים הנחקרים ביותר הוא חיפושית הקמח האדום טריבוליום קסטנאום, מזיק תבואה מאוחסן רלוונטי מבחינה כלכלית¹⁹, אשר מורפוגנזה עוברית כבר דימוי שיטתי עם LSFM²⁰. המורפוגנזה העוברית של שני מינים אלה שונה להפליא בכמה היבטים, למשל, מצב פילוח²¹, כמו גם היווצרות והשפלה של ממברנות חוץ-עובריות²². ההיבט האחרון כבר נותח בהרחבה באמצעות LSFMs. לדוגמה, הוכח כי סרוסה, רקמה עוברית נוספת העוטפת ומגנה על עובר הטריבוליום מפני סכנות שונות עבור החלק הטוב יותר של העובר שלה^23,24, משמש גם "נהג" מורפוגנטי עבור תהליך הנסיגה שלה במהלך סגירת הגב²⁵. יתר על כן, הוכח כי במהלך gastrulation, אזור מסוים של blastoderm נשאר מעוגן קרום vitelline על מנת ליצור תנועות רקמה אסימטרית²⁶ ו, בעקבות תצפית זו, כי נזילות רקמות אזורית מאפשרת לתאים לעזוב ברצף את קצה הסרוסה במהלך סגירת חלון סרוסה²⁷.

בכל Drosophila- ו טריבוליוםהקשורים מחקרים שצוטטו לעיל, LSFMs מבוססי תא מדגם שימשו. ברוב המקרים, העוברים נרשמו בכיוונים מרובים באמצעות פונקציית הסיבוב לדוגמה. אמנם לא צוין במפורש, ניתן להניח כי הם נרשמו בנפרד ובכך עצמאי אחד את השני מבחני הדמיה חיים רציפים, בדומה לעבודה הקודמת שלנו על Tribolium^20,28. בתרחישים מסוימים, גישה כזו מקובלת, אך במיוחד בגישות השוואתיות כמותיות, שונות סביבתית יכולה לעוות את התוצאות. לדוגמה, זה זמן רב ידוע כי המהירות ההתפתחותית של חרקים הוא תלוי טמפרטורה²⁹, אבל מחקר עדכני יותר עולה כי ב Drosophila, הטמפרטורה עשויה להשפיע גם על הריכוז של מורפוגנים³⁰. כתוצאה מכך, אם מאפיינים מסוימים של עובר, למשל, הפרופורציות הדינמיות, שיעורי החלוקה ומהירויות ההגירה של התאים, צריכים להיות מכמתים במדויק, נדרשות חזרות מספיקות ללא שונות סביבתית. זה ממזער סטיות תקן ושגיאות תקן, אשר בתורו מקל על הסמיכות עם תנאים ניסיוניים אחרים, אפילו רק שוליים שונים.

עם זאת, LSFMs מבוססי תא לדוגמה מיועדים בעיקר לתוכן גבוה ולא למאמרי תפוקה גבוהים. שלא כמו מיקרוסקופים קונפוקליים, אשר מצוידים בדרך כלל עם מנגנוני הידוק סטנדרטיים עבור שקופיות מיקרוסקופיה, צלחות פטרי וצלחות היטב, כמעט כל LSFMs מבוססי תא מדגם להשתמש במנגנוני הידוק מבוססי גליל. מנגנונים אלה מיועדים למחזיקי מדגם בהתאמה אישית התואמים לסיבוב כמו גם¹⁰לא פולשניים , אך בדרך כלל אינם מיועדים ליותר מדגם אחד^20,31,32. מסגרת להדמיה חיה בו זמנית של שני עוברים או יותר, שבה היתרונות של הגדרות מבוססות תא מדגם אינם נפגעים, מטפלת בבעיית השונות הסביבתית ובכך מגדילה את הערך של LSFMs למחקרים השוואתיים.

בפרוטוקול שלנו, אנו מציגים מסגרת ניסיונית להדמיה חיה השוואתית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם (איור 1A) שבה ציר y משמש כאפשרות "לערום" עוברים. ראשית, אנו מספקים הנחיית כיול מבוססת מיקרוספרה פלואורסצנטית עבור LSFMs מבוססי תא מדגם, וזה חשוב במיוחד עבור מכשירים שאין להם עוזר כיול. שנית, אנו מתארים שיטת הרכבה לעוברים מרובים המבוססת על מחזיק קורי העכביש²⁸ (איור 1B)התואמת לסיבוב הדגימה ובכך מאפשרת הדמיה בו זמנית של דגימות מרובות בכיוונים מרובים (איור 1C). מספר עוברים מיושרים על גבי סרט agarose דק, ולאחר הכניסה לתוך תא המדגם, עבר ברציפות דרך גיליון האור כדי לרכוש תמונות תלת מימדיות. שלישית, אנו מספקים שלוש ערכות נתונים הדמיה חיה למופת עבור Drosophila, כמו גם עבור טריבוליום. עבור הראשון, אנו ממקסמים קווים מהונדסים עם גרעינים בעלי תווית פלואורסצנטית. עבור האחרון, אנו משווים את הביצועים של קווי משנה מהונדסים הנושאים את אותו טרנסג'ין, אך במקומות גנומיים שונים. לבסוף, אנו דנים בחשיבות ההקבלה ביחס להדמיה חיה השוואתית ושונות^{סביבתית 33}, דנים במגבלת התפוקה של המסגרת הניסיונית שלנו ומעריכים את התאמת הגישה שלנו לאורגניזמים מודל אחרים.

Protocol

1. עבודת הכנה

1. בחר עדשת תאורה / זיהוי עדשה / שילוב מצלמה עבור LSFM שמתאים לשאלה המדעית ולהגדיר את המיקרוסקופ. גודל שדה הראייה הוא המנה של גודל שבב המצלמה והגדלת עדשת הגילוי. יש לבחור בעדשת התאורה כך שכל שדה הראייה יכסה על ידי גיליון אור מישורי גס³⁴. שלושה שילובים מומלצים מפורטים בטבלה 1.
2. להכנת aliquots agarose ו מנות אחזור, להוסיף 2 גרם נמוך להמיס agarose כדי 200 מ"ל autoclaved מי ברז לחמם את התערובת במיקרוגל ב 600-800 W עד שכל חלקיקי agarose מומסים. הכן כמה 1 מ"ל agarose aliquots ב 1.5 מ"ל או 2 צינורות תגובה מ"ל, ולאחר מכן למלא כמה מנות Ø פטרי 90 מ"מ 3-5 מ"מ גבוה עם agarose. אחסן aliquots מוצקים ומנות ב 4 מעלות צלזיוס.
3. עבור Drosophila: כדי להכין בקבוקונים גידול טרי, לבשל כמות מספקת של מדיום Drosophila בהתאמה אישית או מסחרית זמין, להעביר 5-15 מ"ל לתוך בקבוקונים רחבים ולאחסן אותם ב 4 מעלות צלזיוס. להכנת מנות הטלת ביצים, הוסיפו 1 גרם של אגרוז נמוך להמסה ל-50 מ"ל של מי ברז אוטוקלאבים ומחממים את התערובת במיקרוגל ב-600-800 ואט עד שכל חלקיקי ההתעוררות מומסים. אפשר לתערובת להתקרר עד 45 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 50 מ"ל מיץ פירות (רצוי תפוח או ענבים אדומים) ומערבבים ביסודיות. יוצקים את התערובת לתוך 35 מ"מ Ø פטרי מנות ולאחסן מנות מוצקות הטלת ביצים ב 4 מעלות צלזיוס.
4. עבור Tribolium: כדי להכין את מדיום הצמיחה, להעביר קמח מחיטה מלאה, כמו גם שמרים יבשים לא פעילים דרך מסננת בגודל רשת 710 מיקרומטר, ולאחר מכן להשלים את הקמח מנופה עם 5% (w / w) שמרים מנופים. כדי להכין מדיום הטלת ביצה, להעביר קמח חיטה דק, כמו גם שמרים יבשים לא פעילים דרך מסננת בגודל רשת 250 מיקרומטר, ולאחר מכן להשלים את הקמח מנופה עם 5% (w / w) שמרים מנופים.

2. כיול של LSFMs מבוססי תא מדגם באמצעות מיקרוספרות פלואורסצנטיות

הערה: מטרת הכיול היא ליישר את נקודות המוקד של עדשות התאורה והזיהוי (איור 2A),שכן זוהי הנחת היסוד לתמונות ברורות. יש לכייל LSFMs באופן קבוע, לפחות פעם אחת בכל 3-4 שבועות.

1. ממיסים מחדש aliquot agarose בתנור בלוק יבש / מיקסר ב 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפשר aliquot agarose להתקרר עד 35 מעלות צלזיוס.
2. העבר 50 μL של agarose לצינור תגובה 1.5 מ"ל ולהוסיף 0.5 μL של פתרון מיקרוספרה פלואורסצנטית. מערבבים ב 1,400 סל"ד במשך דקה.
3. מלאו את החור המחורץ של מחזיק קורי העכביש ב-10 μL של תערובת פתרון מיקרוספרה אגרוז/פלואורסצנטית, ואז שאפו כמה שיותר גלאה עד שרק סרט אפרוז דק יישאר. חכה 30-60 שניות להתמצקות.
4. ממלאים את תא הדגימה במי ברז אוטומטיים. הכנס את מחזיק קורי העכביש באיטיות לתא הדגימה והזז את החור המחורץ עם שלבי המיקרו-טרנזיציה מול עדשת הגילוי.
5. סובב את מחזיק קורי העכביש עם שלב הסיבוב למיקום של 45° יחסית לצירי התאורה (x) והזיהוי (z). מחזיק קורי העכביש לא צריך להיות גלוי בערוץ אור השידור.
6. עבור לערוץ הפלואורסצנטי המתאים והתאם את עוצמת הלייזר כמו גם את זמן החשיפה כך שהמיקרוספרות הפלואורסצנטיות יספקו אות מתאים.
7. ציין כרך תצוגה המכסה לחלוטין את סרט ההתעוררות בעל הכיוון הרוחבי. הגדר את המרווח z על ידי חישוב הרזולוציה הצירית המקסימלית האפשרית עבור עדשת התאורה המתאימה / שילוב עדשת זיהוי³⁴. לחלופין, 4 פעמים את הרזולוציה לרוחב יכול לשמש קירוב גס.
8. רשום מחסנית z תלת-ממדית של המיקרוספרות הפלואורסצנטיות והשווה את התחזיות המרביות x, y ו- z לתרשים הכיול (איור 2). אם המיקרוספרות נראות מטושטשות, מטושטשות ו/או מעוותות (איור 2B,C),כווננו את מיקומי התאורה ו/או עדשת הגילוי.

3. אוסף עוברי דרוזופילה

1. העבר 100-200 מבוגרים של קו Drosophila של בחירה בקבוקון גידול טרי 2-3 ימים לפני מבחני ההדמיה כדי להקים תרבות איסוף ביצים. אם עדיין לא קיים, שקול להשתמש בקבוקון גידול הישן כדי להתחיל תרבות צאצאים. כדי להבטיח שמבוגרים אינם בני יותר משבועיים, החלף את תרבות איסוף העוברים בזמן בתרבות הצאצאים.
2. מחממים צלחת הטלת ביצה לטמפרטורת החדר ומוסיפים טיפת משחת שמרים על גבי האגר.
3. מעבירים את המבוגרים מתרבות איסוף הביצים לבקבוקון צר וריק ומניחים אותו על צלחת הטלת הביצים. דגירה את ההתקנה איסוף הביצים בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. הימנע הרדמה (קר, CO₂) במהלך שלב זה במידת האפשר.
4. החזירו את המבוגרים לבקבוקון גידול. דגירה צלחת הטלת ביצה בשילוב טמפרטורה / זמן נוח, ולאחר מכן להעביר 10-20 עוברים עם מברשת צבע קטנה מן המנה מטיל ביצה מסננת תא בגודל 100 מיקרומטר. השליכו את צלחת הטלת הביצים.
5. חזור על שלבים 3.1 עד 3.4 עבור כל קו דרוזופילה.

4. אוסף עוברי טריבוליום

הערה: לנוחותך, תוכנית של הליך איסוף ביצי טריבוליום מסופקת (איור 3A) שאליו מתייחסים גם המספרים בתוך הסוגריים בשלב זה.

1. העבר 200-300 מבוגרים (כ-400-700 מ"ג) של קו הטריבוליום הנבחר לבקבוק זכוכית ריק של 1 ל' 2-10 ימים לפני מבחני ההדמיה להקמת תרבות איסוף ביצים(איור 3A_01). ממלאים את הבקבוק ב-50-100 גרם של מדיום צמיחה טרי. אם עדיין לא קיים, לשקול להתחיל תרבות צאצאים באמצעות זחלים זמינים וגומה. כדי להבטיח שמבוגרים אינם בני יותר מ -3 חודשים, החלף את תרבות איסוף הביצים בזמן בתרבות הצאצאים.
2. העבירו את תרבות איסוף הביצים דרך מסננת בגודל רשת בגודל 800 מיקרומטר(איור 3A_02). החזירו את מדיום הגדילה, המכיל עוברים שאינם מבוימים, לבקבוק הראשוני (איור 3A_03)והעבירו מבוגרים לבקבוק זכוכית ריק של 1 ליטר(איור 3A_04). הוסיפו 10 גרם של מדיום הטלת ביצים (איור 3A_05)ודגרו את מערך איסוף הביצים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת(איור 3A_06,07).
3. העבירו את מערך איסוף הביצים דרך מסננת רשת בגודל 800 מיקרומטר(איור 3A_08). החזירו מבוגרים לבקבוק הראשוני שלהם (איור 3A_09). בהתאם לתהליך ההתפתחותי שיש לדמות, דגירו את המדיום המטילה ביצים, המכיל כיום כ-30-100 עוברים, בשילוב טמפרטורה/זמן נוח(איור 3A_10).
4. העבירו את מדיום הטלת הביצים דרך מסננת רשת בגודל 300 מיקרומטר(איור 3A_11)והעבירו את העוברים(איור 3A_12)למסננת תא בגודל רשת של 100 מיקרומטר. השליכו את המדיה המטילה ביצים(איור 3A_13).
5. חזור על שלבים 4.1 עד 4.4 עבור כל קו טריבוליום.

5. נתרן היפוכלוריט מבוסס dechorionation

הערה: הן עוברי דרוסופילה והן עוברי טריבוליום מכוסים על ידי כוריון, שכבת חלבון מגן ומפזרת אור בכבדות שאינה חיונית להתפתחות נאותה כל עוד העוברים נשמרים לחים לאחר ההסרה. פרוטוקול ההקלה לעוברים של שני המינים זהה.

1. הכינו צלחת של 6 בארות על ידי מילוי בארות A1, A2, A3 ו-B3 ב-8 מ"ל של מי ברז אוטומטיים ובארות B1 ו-B2 עם 7 מ"ל של מי ברז אוטומטיים ופתרון של 1 מ"ל של נתרן היפוכלוריט (NaOCl)(איור 3B). שים לב לתהליך dechorionation תחת מיקרוסקופ סטריאו, באופן אידיאלי באור שידור.
   התראה: היפוכלוריט נתרן הוא מאכל.
2. הכנס את מסננת התא המכילה עובר (שלב 3.4 ו /או 4.4) לתוך הבאר A1 ולשטוף את העוברים על 30-60 s תחת תסיסה עדינה.
3. מעבירים את מסננת התאים לבאר B1 ומנערים את הצלחות במרץ במשך 30 שניות, ואז מעבירים אותה לבאר A2 ושוטפים את העוברים במשך דקה תחת תסיסה עדינה.
4. מעבירים את מסננת התאים לבאר B2 ומנערים את הצלחת במרץ עד שרוב העוברים מתים לחלוטין(איור 3C),ואז מעבירים אותה לבאר A3 ושוטפים את העוברים למשך דקה תחת תסיסה עדינה.
5. לאחסן את מסננת התא B3 הרבה לפני שתמשיך עם הליך ההרכבה.
6. חזור על שלבים 5.1 עד 5.5 עבור כל שורה.

6. הרכבה של עוברים מרובים באמצעות מחזיק קורי העכביש

1. ממיסים מחדש aliquot agarose בתנור בלוק יבש / מיקסר ב 80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לאפשר aliquot agarose להתקרר עד 35 מעלות צלזיוס.
2. פיפט 10 μL של agarose על גבי החור המחורץ של מחזיק קורי העכביש. עם קצה פיפטה, להפיץ את agarose מעל החור המחורץ, ואז לשאוף כמה שיותר agarose עד רק סרט agarose דק נשאר. חכה 30-60 שניות להתמצקות.
3. עבור כל שורה, בחר בזהירות עובר אחד או יותר עם מברשת צבע קטנה והנח אותם על הסרט agarose.
4. מסדרים את העוברים לאורך הציר הארוך של החור המחורץ, ואז גם מיישרים את הציר האחורי-קצר שלהם עם הציר הארוך של החור המחורץ(איור 3D).
5. לייצב את העוברים בזהירות על ידי pipetting 1-2 μL של agarose לתוך הפער בין העוברים לבין הסרט agarose. חכה 30-60 שניות להתמצקות.
6. הכנס את מחזיק קורי העכביש עם העוברים הרכובים לאט לתוך תא הדגימה מלא מאגר התמונה.

7. הדמיה חיה השוואתית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם

1. להזיז את אחד העוברים עם שלבי microtranslation מול עדשת הגילוי. ודאו שמחזיק קורי העכביש נמצא במיקום של 45° יחסית לצירי התאורה (x) והזיהוי (z) (cf. איור 1C).
2. בערוץ תאורת השידור, הזיזו את העובר למרכז שדה הראייה. מחזיק קורי העכביש לא צריך להיות גלוי.
3. להזיז את העובר עם שלבי microtranslation ב z עד המטוס האמצעי של העובר חופף עם מישור המוקד, כלומר עד קווי המתאר נראה חד. מבלי לעבור לערוץ הפלואורסצנטי, ציין את נפח התצוגה על-ידי הזזת 250 מיקרומטר מהמטוס האמצעי לשני הכיוונים.
4. לחלופין, אם נדרשת הדמיה בכיוונים מרובים, סובב את העובר כראוי וחזור על שלבים 7.2 ו- 7.3. מחזיק קורי העכביש תומך ב-4 כיוונים במדרגות של 90°.
5. חזור על שלבים 7.1 עד 7.3 (או 7.4) עבור כל העוברים האחרים המותקנים על מחזיק קורי העכביש (איור 3E). ודא שהעובר העליון אינו משאיר את מאגר ההדמיה כאשר העובר התחתון נמצא מול עדשת הגילוי.
6. הגדר את הפרמטרים של ערוץ הפלואורסצנטיות (עוצמת לייזר, זמן חשיפה, מסנן זיהוי) ופער זמן (מרווח זמן, משך כולל) והתחל את תהליך ההדמיה. לקבלת ערכים אינדיקטיביים, עיין בטבלת המטה-נתונים של ערכות הנתונים לדוגמה (טבלה משלימה 1). עבור מבחנים שנמשכים מספר ימים, שקול לכסות את תא הדגימה שנפתח לפחות באופן חלקי כדי להפחית את האידוי.

8. אחזור וטיפוח נוסף של עוברים בתמונה

1. כאשר מבחני ההדמיה מסתיימים, הסר בזהירות את מחזיק קורי העכביש מתא הדגימה.
2. נתק את העוברים מסרט האגרוז עם מברשת צבע קטנה והעבר אותם למגלשת מיקרוסקופ המסומנת כראוי. מניחים את השקופית לתוך צלחת אחזור דגירה בתנאי גידול סטנדרטיים בהתאמה.
3. לגבי אופני הניסוי, להעריך מתי עוברי הושלם. כאשר נקודת זמן הבקיעה מתקרבת, לבדוק את מנות אחזור לעתים קרובות ולהעביר זחלים Drosophila בקעו בקבוקונים גידול בודדים זחלי טריבוליום לבארות בודדות של צלחת 24-well. מלאו את הבארות עד למחצית במדיום צמיחה. דגירה בתנאי גידול סטנדרטיים בהתאמה.
4. לאחר האנשים שנצפו הם מבוגרים, לספק להם שותף הזדווגות מתאים ולבדוק צאצאים לאחר מספר ימים.

9. תיעוד עיבוד ומטה-נתונים של נתוני תמונה

הערה: לעיבוד נתוני תמונה, מומלץ להפיק את IMAGEJ FIJI³⁵ (imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI אינה דורשת התקנה וגירסאות 32 סיביות וכן 64 סיביות זמינות. אחת הפורמטים הנפוצים ביותר עבור נתוני LSFM היא תבנית קובץ התמונה המתויגת (TIFF), המאפשרת אחסון של ערימות תמונות בצורה של גורם מכיל TIFF.

1. חישוב התחזיות המרביות z עבור כל ערימות z (תמונה | ערימות | פרוייקט Z, בחר בעוצמה מרבית). התחזיות המרביות הן גישות לפישוט נתונים המפחיתות את מספר הממדים המרחביים משלוש לשתיים. סקריפט FIJI לעיבוד אצווה מסופק (קובץ משלים 1).
2. שרשור התחזיות המרביות z בהתאמה כדי ליצור ערימות זמן (ערימות t). שמור אותם במיכל TIFF אחד. עשה זאת עבור כל העוברים המוקלטים, כמו גם את הכיוונים ואת ערוצי הפלואורסצנטיות המתאימים במידת הצורך.
3. סובב את הערימה z ו- t סביב ציר z כדי ליישר את הציר האחורי-אחורי של העוברים עם ציר התמונה x או y (תמונה | שינוי צורה | סיבוב). חותכים את ערימות z לאורך כל שלושת צירי התמונה ואת מחסנית t בצירי התמונה x ו- y כך שרק שטח חיץ מינימלי (20-40 פיקסלים לאורך צירי x ו- y, 5-10 תמונות לאורך ציר z) סביב העובר נשאר (תמונה | כוונון | גודל בד ציור עבור צירי x ו- y, תמונה | ערימות | כלים | שומר פרוסות לציר z).
   1. עשה זאת בנפרד עבור כל העוברים המוקלטים, כמו גם את הכיוונים המתאימים, אם רלוונטי. ערוצי פלואורסצנטיות, אם רלוונטי, יש לעבד עם פרמטרים זהים של סיבוב וחיתוך.
4. תעד את המטה-נתונים כמפורטים ככל האפשר. כהנחיה, ניתן להשתמש בטבלת המטה-נתונים של ערכות הנתונים לדוגמה, המוצגות במקטע תוצאות מייצגות (טבלה משלימה 1).

10. תצוגה חזותית של נתונים

הערה: קו מנחה זה להמחנאת נתונים מתמקד בעיקר ביצירת מטריצות תמונה של הקרנה מרבית z המציגות מספר עוברים מוקלטים לאורך מספר כיוונים ו/או לאורך זמן. השלבים הבאים מתארים את שגרת הפריטים החזותיים של הנתונים שהוחלה על ערכות הנתונים לדוגמה ליצירת האיורים המוצגים וסרטי הווידאו המקושרים במקטע תוצאות מייצגות.

1. שילוב ערימות של כיוונים מרובים (תמונה | ערימות | כלים | שילוב) ו/או מיזוג ערוצי פלואורסצנטיות מרובים (תמונה | | צבע מיזוג ערוצים) כדי לדמיין את המבנה הביולוגי ו / או תהליך של עניין.
2. התאמת העוצמות של ערימות t (תמונה | כוונון | בהירות/ניגודיות) לפי הצורך באמצעות הפונקציה "Set". יש להגדיר את הערך המוצג המינימלי מעט מעל אות הרקע, הערך המוצג המרבי אמור לגרום לחדות נוחה. תעד את שני הערכים, מכיוון שניתן להשתמש בהם להתאמה עקבית של ערימות z המתאימות. הדפס התאמות באמצעות הפונקציה "Apply". בהתאם לאופנים הניסיוניים, שקול לעבד את כל העוברים המוקלטים עם ערכים זהים.
3. שמרו ערימות t מותאמות עוצמה כקבצים נפרדים, אל תעקפו את ערימות t שאינן מותאמות. קומפילציה ערימות משנה מתאימות מערימות t מותאמות עם פונקציות ייעודיות לבחירת תמונה (למשל, תמונה | ערימות | כלים | Slice Keeper) והשתמש בכלי מונטאז'(תמונה | ערימות | Make Montage) כדי ליצור רשתות תמונה שניתן להשתמש בהן לעיצוב איורים.

תוצאות

הפרוטוקול שלנו מתאר מסגרת ניסיונית להדמיה חיה פלואורסצנטית השוואתית בתא מדגם מבוסס LSFMs. לדוגמה, ניתן להשתמש במסגרת כדי לחבר (i) עוברים משני מינים או יותר, (ii) עוברים של קווים שבהם גנים אחד או יותר מופקים בתוספת פקדים מסוג בר, (iii) עוברים מרובים מאותו קו מהונדס, (iv) עוברים מקווים מהונדסים שונים, ?...

Discussion

אחד מאזורי היישום הבלעדיים של LSFMs הוא ביולוגיה התפתחותית. במשמעת זו, יש חשיבות להסתכל על דגימות חיות, אחרת לא ניתן לתאר תהליכים מורפוגנטיים באופן דינמי. מסגרת ניסיונית להדמיה חיה בו זמנית ב- LSFMs מבוססי תא מדגם, כמתואר כאן, נוחה משתי סיבות עיקריות.

ניתן לטפל בשונות הסביבה, שהיא ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300	Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	153066	Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	L9004575
100 µm mesh size cell strainer	BD Biosciences	352360
250 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-038	Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-040	Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-050	Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-051	Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	SP061006	Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium	Genesee Scientific	66-115	Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-108
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
narrow vials	Genesee Scientific	32-109	Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush	VWR International	149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl	Carl Roth	9062.3	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour	Demeter e.V.	SP061036	Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials	Genesee Scientific	32-110	Only for live imaging involving Drosophila