샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

요약

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

초록

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 여러 생물학적 관련 저울에서 복잡한 프로세스를 연구하는 효율적인 솔루션을 제공합니다. 시편의 3차원 무결성을 보존하도록 특별히 설계된 샘플 챔버 기반 설정은 일반적으로 샘플 회전을 특징으로 하며, 발달 생물학에서 최선의 선택입니다. 예를 들어, 그들은 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터와 붉은 밀가루 딱정벌레 트리볼륨 카스타뉴움의전체 배아 형태 발생을 문서화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 유효한 많은 살아있는 화상 진찰 프로토콜은 단 하나 태아를 위한 단지 실험적인 프레임 워크를 제공합니다. 특히 비교 연구를 위해 순차적으로 이미지된 표본이 주변 분산의 영향을 받고 있기 때문에 이러한 접근 방식이 불편합니다. 또한, 이것은 주어진 시간 내에 분석될 수 있는 표본의 수를 제한한다. 당사는 샘플 챔버 기반 설정의 처리량을 증가시키고 따라서 모든 표본에 대해 유사한 주변 조건을 보장하는 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 첫째, 우리는 광 시트 형광 현미경에 대한 교정 지침을 제공합니다. 둘째, 샘플 회전과 호환되는 다중 배아에 대한 장착 방법을 제안합니다. 셋째, Drosophila의예시적인 3차원 라이브 이미징 데이터 세트를 제공하며, 3개의 형질표시 핵과 트리볼륨을병치하여 동일한 트랜스유전자를 운반하는 3개의 트랜스제닉 서브라인의 성능을 비교하지만 다른 게놈 위치에서 제공합니다. 우리의 프로토콜은 항상 순차적인 라이브 이미징에 항상 존재하는 주변 분산을 적극적으로 해결하므로 비교 연구를 위해 특별히 설계되었습니다. 이는 녹아웃 실험과 같은 비정상적인 표현형의 정량적 분석 및 특성화에 특히 중요합니다. 또한, 전체 처리량을 증가시킵니다, 이는 광시트 형광 현미경에 접근할 때 매우 편리하며, 이는 제한적이다. 마지막으로, 제안된 장착 방법은 기본적으로 최적화 노력이 없는 다른 곤충 종 및 추가 모델 유기체(예: 제브라피시)에 적응할 수 있다.

서문

형광 현미경 검사는 특히 세포 및 발달 생물학에서 생명 과학에서 가장 필수적인 이미징 기술 중 하나입니다. 1990년대 중반부터 3차원 형광 영상에 대한 최첨단 형광 현미경^1에서동일한 렌즈가 형광 발암 및 방출 광 검출에 사용된다. 조명 레이저 빔은 조명/검출 축을 따라 모든 형광을 자극하고 핀홀에 의해 검출되기 전에 각각의 초점이 벗어난 신호가 차별된다. 따라서 각 2차원 이미지에 대해 전체 표본이 조명됩니다. 따라서, 각 3차원 이미지, 즉 공간적으로 연속적인 2차원 이미지의 스택에 대해, 전체 표본은 12~수백배^2의조명을 통해 광표백 및^{광독성3를}촉진한다.

거의 20년 전, 광시트 기반 기술^4는 3차원 형광 이미징을 위한 유망한 대안으로 등장하여 발달 생물학^5에서귀중한 도구가 되었습니다. 이 접근 방식에서는 조명 및 감지가 분리됩니다. 조명 렌즈는 수직으로 배열된 검출 렌즈의 초점 평면 내에서 몇 마이크로미터의 깊이만 있는 라이트 시트를 생성하는 데 사용됩니다. 따라서 각 2차원 이미지에 대해 초점 평면 주위의 얇은 평면 부피만 조명됩니다. 따라서, 각 입체 이미지에 대해, 전체 표본은 한 번만 조명되어 광표백 및 광독성^6을강하게 감소시다. 이러한 이유로, 광 시트 형광 현미경 (LSFM)은 여러 생물학적으로 관련된 비늘에 복잡한 프로세스를 연구하는 효율적인 솔루션을 제공하므로, 따라서, 개발 생물학에서 특히 가치, 여기서 몇 밀리미터만큼 큰 표본은 세포 극이하 수준에서 분석되어야.

역사적으로 LSFM은 챔버 기반^7,8을샘플링했습니다. 이러한 설정에서 조명(x) 및 검출(z) 축은 일반적으로 중력 축(y)에 수직으로 배열됩니다. 샘플 챔버는 충분한 실험적 자유를 제공합니다. 첫째, 그들은 차례로 환경을 제어하기 위해 관류 시스템의 사용을 용이하게 큰 이미징 버퍼 용량을 제공합니다, 예를 들어, 특정^온도를 유지하거나 생화학 적 스트레스를 적용. 또한, 시편의 동적 11, 무결성을 유지하면서 각각의 실험 요구에 맞는 맞춤형 장착^{방법(10)을} 지원합니다. 또한, 샘플 챔버 기반 설정은 일반적으로 y 축 을 중심으로 표본을 회전시키고 따라서 2, 4 또는 더 많은 방향을 따라 이미지를 그리는 데 사용되는 회전 기능이 장착되어 있습니다. 일반적으로 사용되는 모델 유기체의 배아는 현미경 검사법의 맥락에서, 상대적으로 크고 연속적인 화상 진찰이 복부-등주, 측면 및/또는 전방 후방 바디 축을 보다 포괄적인 표현을 제공한다. 이를 통해 예를 들어, 복잡한 3차원 마이그레이션 경로를 따라 이동하는 셀의 장기^{추적(12,13)을}허용한다.

광시트 계형현미경검사는 드로소필라 멜라노가스터의배아 형태발생을 연구하기 위해 광범위하게 적용되었으며, 둘 다 체계적으로^14,15뿐만 아니라 발달의 생물물리학적 측면에 대한 구체적인 초점을 맞추고 있다. 예를 들어, 고분해능 형태유전학 데이터를 수집하여 생식기^{연신기(16)의} 내막질 질 및 축 확장 사이의 생체 기계적 연관성을 검출하고,^{가스화(17)}동안 힘 발생 패턴과 복잡한 세포 흐름을 더욱 연관시키는 데 사용되었다. 또한 다른 최첨단 기술, 예를 들어, 표피^18에서전방 후방 패터닝 중 Wnt 신호의 조절을 조사하기 위해 광유전학과 결합되었다.

그러나, 단 하나의 종을 공부하는 것은 개발의 진화에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 계통 유전학 적 맥락 내에서 배아 발생을 이해하기 위해, 집중적 인 연구는 대체 곤충 모델 유기체와 함께 실시되었습니다. 가장 포괄적으로 조사된 종 중 하나는 적색 밀가루 딱정벌레 트리볼륨 카스타늄(Tribolium castaneum)으로,경제적으로 관련된 저장된 곡물^{해충(19)이며,}배아 형태발생또한 이미 LSFM^20으로체계적으로 이미지화되었다. 이 두 종의 배아 형태발생은 여러 양상에서 현저하게 다르다, 예를 들어, 세분화^{모드(21)뿐만}아니라 엑스트라 배아^막(22)의형성 및 분해. 후자의 측면은 이미 LSFM을 사용하여 광범위하게 분석되었습니다. 예를 들어, 그 배아 발생^23,24의더 나은 부분에 대한 다양한 위험으로부터 트리볼륨 배아를 포위하고 보호하는 엑스트라 배아 조직인 세로사는 등쪽 폐쇄²⁵시 자체 철수 과정을 위한 형태유전학적 "운전자"로 작용하는 것으로 나타났다. 또한, 위트포송 시, 블라스트로드름의 특정 부위가 비대칭 조직 운동을 만들기 위해 비텔린 막에 고정되어^있으며, 이러한 관찰에 따라 지역화된 조직 유동화를 통해 세포가 세로사 창^폐쇄(27)동안 세포가 순차적으로 세로사 가장자리를 떠날 수 있다는 것이 입증되었다.

모든 드로소필라에서- 그리고 Tribolium-연관된 연구 위에서 인용, 견본 챔버 기지를 둔 LSFM가 이용되었습니다. 대부분의 경우, 배아는 샘플 회전 기능을 사용하여 여러 방향을 따라 기록되었다. 명시적으로 명시되지는 않지만, 트리볼륨^20,28에대한 이전 작업과 유사한 순차적인 라이브 이미징 소에서 개별적으로 서로 독립적으로 기록되었다고 가정할 수 있습니다. 특정 시나리오에서는 이러한 접근 방식이 허용되지만 특히 양적 비교 접근 방식에서는 주변 분산이 결과를 왜곡할 수 있습니다. 예를 들어, 곤충의 발달 속도가 온도^{의존29라는}것은 오랫동안 알려져 왔지만, 최근 연구에 따르면 드로소필라에서는온도가 모르포겐(30)의 농도에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 따라서, 배아 발생의 특정 특성, 예를 들어, 세포의 동적 비율, 분할 비율 및 이주 속도, 정확하게 정량화되어야하며, 주변 분산이 없는 충분한 반복이 필요하다. 이렇게 하면 표준 편차 및 표준 오류를 최소화하므로 다른 실험 조건과 병치가 용이합니다.

그러나 샘플 챔버 기반 LSFM은 주로 높은 처리량 애서가 아닌 높은 함량을 위해 설계되었습니다. 일반적으로 현미경 슬라이드, 페트리 접시 및 웰 플레이트에 대한 표준화된 클램프 메커니즘이 장착된 공초점 현미경과 달리 거의 모든 샘플 챔버 기반 LSFM은 실린더 기반 클램프 메커니즘을 사용합니다. 이러한 메커니즘은 회전 호환뿐만 아니라 비침습적^10인맞춤형 샘플 홀더를 위한 것이지만 일반적으로 둘 이상의 표본^20,31,32를위해 설계되지 는 않습니다. 샘플 챔버 기반 설정의 장점이 손상되지 않는 두 개 이상의 배아의 동시 라이브 이미징을 위한 프레임워크는 주변 분산 문제를 해결하여 비교 연구를 위한 LSFMs의 가치를 증가시합니다.

우리의 프로토콜에서, 우리는 y 축이 배아를 "스택"하는 옵션으로 사용되는 샘플 챔버 기반 LSFM(도 1A)에서비교 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 제시한다. 첫째, 우리는 교정 도우미가 부족한 기기에 특히 중요한 샘플 챔버 기반 LSFM에 대한 형광 마이크로스피어 기반 교정 지침을 제공합니다. 둘째, 시료 회전과 호환되는 거미줄^{홀더(28)(도} 1B)를기반으로 다중 배아에 대한 장착 방법을 설명하고 따라서 다중 방향을 따라 다중 시편의 동시 이미징을 허용한다(도1C). 몇몇 배아는 얇은 아가로즈 필름 위에 정렬되고, 샘플 챔버에 삽입 한 후, 3 차원 이미지를 얻기 위해 라이트 시트를 통해 연속적으로 이동. 셋째, 드로소필라와 트리볼륨에대한 세 가지 모범적인 라이브 이미징 데이터 세트를 제공합니다. 전자의 경우 형광으로 표지된 핵을 가진 형질전환선을 병치합니다. 후자의 경우 동일한 트랜스진을 운반하는 트랜스제닉 하위 라인의 성능을 비교하지만 다른 게놈 위치에서 비교합니다. 마지막으로, 비교 라이브 이미징 및 주변^{분산(33)과}관련하여 병렬화의 중요성에 대해 논의하고, 실험 프레임워크의 처리량 한계에 대해 논의하고 다른 모델 유기체에 대한 접근 방식의 적응을 평가합니다.

프로토콜

1. 준비 작업

1. 과학적 질문에 맞는 LSFM용 조명 렌즈/감지 렌즈/카메라 조합을 선택하고 현미경을 설정합니다. 시야의 크기는 카메라 칩 크기의 지수와 감지 렌즈의 배율입니다. 조명 렌즈는 전체 시야가 대략 평면 라이트^{시트(34)로}덮여 있도록 선택해야 합니다. 권장되는 세 가지 조합은 표 1에나열됩니다.
2. 아가로즈 알리쿼트 및 회수 접시를 준비하려면 2g의 저연아가로즈를 200mL 의 자동 수돗물에 넣고 모든 아가로즈 입자가 용해될 때까지 600-800W의 전자레인지에 혼합물을 가열합니다. 1.5mL 또는 2mL 반응 튜브에 1mL 아가로즈 알리쿼트 몇 개 준비한 다음 아가로즈로 3-5mm 높이의 90mm Ø 페트리 요리를 채웁니다. 고형화된 알리코와 요리를 4°C에 보관하십시오.
3. Drosophila의경우 : 신선한 사육 바이알을 준비하려면, 맞춤형 또는 시판 가능한 Drosophila 배지의 적절한 양을 요리하고, 넓은 유리병에 5-15 mL을 전송하고 4 ° C에 저장합니다. 달걀 누워 접시를 준비하려면 50mL의 오토클레이브 수돗물에 저용 아가로즈 1 g을 넣고 모든 아가로즈 입자가 용해될 때까지 600-800W의 전자 레인지에 혼합물을 가열합니다. 혼합물을 45°C로 식힌 다음 50mL 과일 주스(바람직하게는 사과 또는 붉은 포도)를 넣고 철저히 섞어 줍니다. 혼합물을 35mm Ø Petri 접시에 붓고 고형화된 달걀 누워 접시를 4°C에 저장합니다.
4. 트리볼륨의경우 : 성장 배지를 준비하려면 710 μm 메쉬 크기의 체로 통밀가루와 비활성 건조 효모를 통과한 다음 체질 된 밀가루를 체질 효모를 5 %(w /w)로 보충하십시오. 달걀 누워 매체를 준비하려면 250 μm 메쉬 크기의 체로 미세 밀가루와 비활성 건조 효모를 통과한 다음 체질 된 밀가루를 5 % (w / w) 체질 효모로 보충하십시오.

2. 형광 마이크로스피어를 이용한 샘플 챔버 기반 LSFMs 의 교정

참고: 교정의 목적은 선명한 이미지의 전제이기 때문에 조명 및 검출렌즈(도 2A)의초점 지점을 정렬하는 것입니다. LSFM은 3-4주에 한 번 이상 정기적으로 보정해야 합니다.

1. 80°C의 드라이 블록 히터/믹서에서 아가로즈 알리쿼트를 다시 액화한 다음 아가로즈 알리쿼트가 35°C까지 식힙니다.
2. 아가로즈 50 μL을 1.5mL 반응 튜브로 옮기고 형광 마이크로스피어 용액의 0.5 μL을 추가한다. 1분 동안 1,400rpm에서 섞으세요.
3. 거미줄 홀더의 구멍에 아가로즈/형광 마이크로스피어 용액 혼합물의 10μL로 채우고, 얇은 아가로즈 필름만 남아있을 때까지 가능한 한 많은 아가로즈를 흡인합니다. 30-60을 기다립니다.
4. 샘플 챔버를 자동 수돗물로 채웁니다. 거미줄 홀더를 샘플 챔버에 천천히 삽입하고 검출 렌즈 앞에 미세 번역 단계로 슬롯 구멍을 이동합니다.
5. 회전 스테이지로 거미줄 홀더를 일루미네이션(x) 및 검출(z) 축에 비해 45° 위치로 회전합니다. 거미줄 홀더는 전송 라이트 채널에 표시되지 않아야 합니다.
6. 각각의 형광 채널로 전환하고 형광 마이크로스피어가 적절한 신호를 제공하도록 레이저 전력뿐만 아니라 노출 시간을 조정한다.
7. 이제 횡방향 방향의 아가로즈 필름을 완전히 덮는 뷰 볼륨을 지정합니다. 각각의 조명 렌즈/검출 렌즈^{조합(34)에}대해 최대한 가능한 축 분해능을 계산하여 z 간격을 정의한다. 또는, 4배의 측면 해상도는 대략적인 근사치로 사용될 수 있다.
8. 형광 마이크로스피어의 3차원 테스트 z 스택을 기록하고 x, y 및 z 최대 투영을 교정차트(그림 2)와비교한다. 마이크로스피어가 흐릿하게 나타나거나 퍼지거나 왜곡된경우(그림 2B,C)는조명 및/또는 검출 렌즈의 위치를 조정합니다.

3. 드로소필라 배아 컬렉션

1. 드로소필라 라인의 성인 100~200명을 영상 분석 전에 2-3일 전에 신선한 양육 바이알로 옮겨 계란 수집 문화를 확립합니다. 아직 존재하지 않는 경우, 자손 문화를 시작하기 위해 오래된 양육 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 성인이 2 주 이상 오래되지 않도록하려면 배아 수집 문화를 자손 문화로 교체하십시오.
2. 달걀 누워 접시를 실온에 데우고 한천 위에 효모 페이스트를 넣습니다.
3. 어른을 달걀 수집 문화에서 빈 좁은 유리병으로 옮기고 달걀 누워 접시 위에 놓습니다. 15분 동안 실온에서 달걀 컬렉션 설정을 배양합니다. 가능하면이 단계에서 마취 (감기, CO_2)를피하십시오.
4. 어른을 양육 바이알로 되돌려 보냅니다. 달걀 누워 접시를 편리한 온도/시간 조합으로 배양한 다음, 달걀 누워 접시에서 100 μm 메쉬 크기의 세포 여과기로 작은 페인트 브러시로 10-20 배아를 옮긴다. 달걀 누워 접시를 버리십시오.
5. 각 드로소필라 라인에 대해 3.1~ 3.4단계를 반복합니다.

4. 트리볼륨 배아 의 수집

참고: 편의를 위해 트리볼륨 계란 수집 절차의 계획이제공되며(그림 3A)는이 단계에서 괄호 내의 숫자도 참조한다.

1. 알 수집문화(도 3A_01)를확립하기 위해 이미징 분석 전에 2-10일 전에 트리볼륨 라인의 200-300성인(약 400-700 mg)을 빈 1 L 유리 병으로 옮긴다. 50-100 g의 신선한 성장 매체로 병을 채웁니다. 아직 존재하지 않는 경우, 사용 가능한 애벌레와 강아지를 사용하여 자손 문화를 시작하는 것이 좋습니다. 성인이 생후 3개월 이상되지 않도록 하기 위해, 계란 수집 문화를 자손 문화로 대체하십시오.
2. 800 μm 메쉬 크기 체(그림 3A_02)를통해 계란 수집 문화를 전달합니다. 비단계 배아를 함유한 성장 배지를 초기병(그림 3A_03)으로되돌리고 성인을 빈 1L 유리병(도3A_04)으로이송한다. 계란 누워 매체 10 g(도 3A_05)를추가하고 1 시간(그림 3A_06,07)에대한 실온에서 계란 수집 설정을 배양.
3. 800 μm 메쉬 크기체(그림 3A_08)를통해 달걀 컬렉션 설정을 전달합니다. 초기 병에 성인을 반환(그림 3A_09). 이미지해야 하는 발달 과정에 따라, 현재 약 30-100개의 배아를 함유하고 있는 계란 누워 매체를 편리한 온도/시간조합(도 3A_10)에서배양한다.
4. 300 μm 메쉬 크기체(도 3A_11)를통해 계란 누워 배지를 통과하고 배아(도3A_12)를100μm 메쉬 크기의 세포 여과로 이송한다. 체질 계란 누워 매체를 폐기(그림 3A_13).
5. 각 트리볼륨 라인에 대해 4.1 ~ 4.4 단계를 반복합니다.

5. 나트륨 하이포염소산 비초화

참고: 드로소필라와 트리볼륨 배아는 제거 후 습한 채 유지되는 한 적절한 발달에 필수적이지 않은 보호 및 광산단백질 층인 초리온(chorion)에 의해 덮여 있습니다. 두 종의 배아에 대한 비반향 프로토콜은 동일합니다.

1. A1, A2, A3 및 B3 우물을 8mL의 오토클레이브 수돗물과 B1 및 B2 우물을 7mL의 오토클레이브 수돗물과 1mL의 나트륨 하이포염염(NaOCl) 용액(그림3B)으로채우어 6웰 플레이트를 준비한다. 스테레오 현미경으로, 이상적으로 전송 광에서 점등 공정을 관찰하십시오.
   주의: 염산염 나트륨은 부식성입니다.
2. 배아 함유 세포 스트레이너(3.4단계 및/또는 4.4단계)를 A1에 잘 삽입하고 부드러운 동요 하에서 약 30-60s의 배아를 세척합니다.
3. 세포 스트레이너를 B1로 잘 이동시키고 플레이트를 30초 동안 격렬하게 흔들어 A2로 잘 옮긴 다음 부드러운 동요 하에서 1분 동안 배아를 씻습니다.
4. 세포 스트레이너를 B2로 잘 이동시키고 대부분의 배아가 완전히 비반향(도 3C)될때까지 격렬하게 플레이트를 흔들어 서 A3로 옮기고 부드러운 동요 하에서 1 분 동안 배아를 씻습니다.
5. 장착 절차를 진행하기 전에 셀 스트레이너를 B3에 잘 보관하십시오.
6. 각 줄에 대해 5.1에서 5.5단계를 반복합니다.

6. 거미줄 홀더를 사용하여 여러 배아의 장착

1. 80°C의 드라이 블록 히터/믹서에서 아가로즈 알리쿼트를 다시 액화한 다음 아가로즈 알리쿼트가 35°C까지 식힙니다.
2. 거미줄 홀더의 구멍 위에 아가로즈의 파이프 10 μL. 파이펫 팁으로 아가로즈를 구멍 에 퍼뜨리고, 얇은 아가로즈 필름만 남을 때까지 가능한 한 많은 아가로즈를 흡인합니다. 30-60을 기다립니다.
3. 각 라인에 대해 작은 페인트 브러시로 하나 이상의 배아를 조심스럽게 선택하고 아가로즈 필름에 놓습니다.
4. 구멍구멍의 긴 축을 따라 배아를 정렬한 다음 전방 후방 축을 슬롯 구멍의 긴 축(도3D)과정렬합니다.
5. 아가로오스의 1-2 μL을 배아와 아가로즈 필름 사이의 간격으로 배아를 피펫팅하여 배아를 조심스럽게 안정화시다. 30-60을 기다립니다.
6. 장착된 배아와 함께 거미줄 홀더를 천천히 이미지 버퍼 로 채워진 샘플 챔버에 삽입합니다.

7. 샘플 챔버 기반 LSFM에서 비교 라이브 이미징

1. 검출 렌즈 앞에 마이크로 번역 단계로 배아 중 하나를 이동합니다. 거미줄 홀더가 조명(x) 및 검출(z) 축(참조) 축(참조) 및 감지(그림 1C)에비해 45° 위치에 있는지 확인합니다.
2. 전송 광 채널에서 배아를 시야의 중심으로 이동합니다. 거미줄 홀더를 표시해서는 안 됩니다.
3. 배아의 중비행기가 초점 평면과 겹치때까지, 즉 윤곽선이 날카로울 때까지 z의 마이크로 번역 스테이지로 배아를 이동합니다. 형광 채널로 전환하지 않고 미드 플레인에서 250 μm을 양방향으로 이동하여 뷰 볼륨을 지정합니다.
4. 선택적으로, 여러 방향을 따라 이미징이 필요한 경우, 배아를 적절히 회전시키고 7.2 및 7.3 단계를 반복한다. 거미줄 홀더는 90°의 단계에서 최대 4개의 방향을 지원합니다.
5. cobweb 홀더에 장착된 다른 모든 배아에 대해 7.1 ~ 7.3(또는 7.4)을 반복한다(도3E). 최상부 배아가 검출 렌즈 앞에 있을 때 가장 상부 배아가 이미징 버퍼를 남기지 않도록 하십시오.
6. 형광 채널(레이저 파워, 노출 시간, 검출 필터) 및 시간 경과(간격, 총 지속 시간) 매개 변수를 정의하고 이미징 프로세스를 시작합니다. 표시 값의 경우 예제 데이터 집합의 메타데이터테이블(보충 표 1)을참조하십시오. 며칠 동안 지속되는 아세의 경우, 증발을 줄이기 위해 적어도 부분적으로 샘플 챔버 개구부를 덮는 것이 좋습니다.

8. 이미지 배아의 회수 및 추가 재배

1. 이미징 분석이 끝나면 샘플 챔버에서 거미줄 홀더를 조심스럽게 제거하십시오.
2. 작은 페인트 브러시로 아가로즈 필름에서 배아를 분리하고 적절하게 표지된 현미경 슬라이드로 옮겨냅니다. 슬라이드를 검색 접시에 넣고 각 표준 양육 조건하에서 인큐베이션합니다.
3. 실험 양식에 관해서는, 배아 발생이 완료될 때 추정합니다. 부화 시점이 다가오면 검색 접시를 자주 확인하고 부화한 드로소필라 애벌레를 개별 사육 바이알과 트리볼륨 애벌레로 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮겨놓습니다. 성장 매체로 우물을 절반까지 채웁니다. 각 표준 양육 조건하에서 인큐베이션.
4. 관찰 된 개인이 성인이되면, 적절한 짝짓기 파트너를 제공하고 며칠 후 자손을 확인하십시오.

9. 이미지 데이터 처리 및 메타데이터 설명서

참고: 이미지 데이터 처리를 위해 ImageJ 는^{피지(35)를} 유도하는 것이 좋습니다(imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI는 설치가 필요하지 않으며 32- 64 비트 버전을 사용할 수 있습니다. LSFM 데이터에 가장 자주 사용되는 형식 중 하나는 TIFF 컨테이너 형태로 이미지 스택을 저장할 수 있는 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF)입니다.

1. 모든 z 스택에 대한 z 최대 투영을 계산합니다(이미지| 스택 | Z 프로젝트, 최대 강도를선택). 최대 투영은 공간 치수수를 3개에서 2개로 줄이는 데이터 단순화 접근 방식입니다. 일괄 처리를 위한 FIJI 스크립트가제공됩니다(보충 파일 1).
2. 각 z 최대 투영을 연결하여 시간 스택(t 스택)을 만듭니다. 이를 하나의 TIFF 컨테이너에 저장합니다. 모든 기록된 배아뿐만 아니라 해당되는 경우 각 방향 및 형광 채널을 위해 이 작업을 수행하십시오.
3. z축 주위의 z 및 t 스택을 회전하여 배아의 전방 후방 축을 x 또는 y 이미지축(이미지 | | 변환 회전). x 및 y 이미지 축에 있는 세 개의 이미지 축과 t 스택을 모두 따라 z 스택을 자르면 배아 주위의 최소 버퍼 공간(x 및 y 축을 따라 20-40 픽셀, z 축을 따라 5-10 개의 이미지)만 남아 있습니다(이미지 | 조정 | x 및 y 축용 캔버스 크기, 이미지 | 스택 | 도구 | z 축에 대한 슬라이스 키퍼).
   1. 모든 기록된 배아뿐만 아니라 해당되는 경우 개별적으로 이 작업을 수행하십시오. 해당되는 경우 형광 채널은 동일한 회전 및 자르기 매개 변수로 처리되어야 합니다.
4. 메타데이터를 가능한 한 자세히 문서화합니다. 지침으로 대표 결과 섹션에 나와 있는 예제 데이터 집합의 메타데이터 테이블을 사용할 수있습니다(보충표 1).

10. 데이터 시각화

참고: 이 데이터 시각화 지침은 주로 여러 방향 및/또는 시간이 지남에 따라 여러 개의 기록된 배아를 표시하는 z 최대 프로젝션 이미지 행렬을 만드는 데 중점을 둡니다. 다음 단계는 표시된 수치 및 대표 결과 섹션에 연결된 비디오를 만들기 위해 예제 데이터 집합에 적용된 데이터 시각화 절차를 설명합니다.

1. 여러 방향의 t 스택을 결합(이미지 | 스택 | 도구 | 결합)및/또는 여러 형광 채널병합(이미지 | 색상 | 채널병합) 생물학적 구조 및/또는 관심 있는 과정을 시각화합니다.
2. t 스택의 강도를 조정(이미지 | 조정 | 밝기/대비)필요에 따라 "설정" 함수를 사용합니다. 표시최소 값은 배경 신호 보다 약간 높게 설정되어야 하며, 표시된 최대 값은 편리한 콘트라스트를 초래해야 합니다. 각 z 스택을 일관되게 조정하는 데 사용할 수 있는 두 값을 모두 문서화합니다. "적용"함수를 사용하여 각인 조정. 실험 양식에 따라 기록된 모든 배아를 동일한 값으로 처리하는 것이 좋습니다.
3. 강도 조정 된 t 스택을 별도의 파일로 저장하고 조정되지 않은 t 스택을 재정의하지 않습니다. 전용 이미지 선택 기능(예: 이미지 | 조정된 t 스택에서 적절한 하위 스택을 컴필레이트합니다. 스택 | 도구 | 슬라이스 키퍼)몽타주 도구를 사용(이미지 | 스택 | 몽타주를 확인)그림 디자인에 사용할 수있는 이미지 그리드를 만들 수 있습니다.

결과

우리의 프로토콜은 샘플 챔버 기반 LSFM에서 비교 형광 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명합니다. 예를 들어, 프레임워크는 두 종 이상의 종의 배아,(ii) 하나 이상의 유전자가 두개 이상의 유전자를 두드리고, (iii) 동일한 형질형 선의 다발배, (iv) 다른 형질대사로부터의 배아, 또는 동일한 트랜스젠선으로부터의 배아를 병치하는 데 사용될 수 있다. 그러나 다른 게놈 위치에서. 이 섹션?...

토론

LSFM의 독점적 인 응용 분야 중 하나는 발달 생물학입니다. 이 분야에서, 살아있는 표본을 보는 것이 중요합니다, 그렇지 않으면 형태 유전학 과정은 동적 방식으로 설명 될 수 없다. 여기에 설명된 바와 같이 샘플 챔버 기반 LSFM에서 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크는 두 가지 주요 이유로 편리합니다.

순차적인 라이브 이미징에서 피할 수 없는 주변 분산은 적극적?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well plate	Orange Scientific	4430500
24-well plate	Orange Scientific	4430300	Only for live imaging involving Tribolium
35-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	153066	Only for live imaging involving Drosophila.
90-mm Ø Petri dish	Fisher Scientific	L9004575
100 µm mesh size cell strainer	BD Biosciences	352360
250 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-038	Only for live imaging involving Tribolium
300 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-040	Only for live imaging involving Tribolium
710 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-050	Only for live imaging involving Tribolium
800 µm mesh size sieve	VWR International	200.025.222-051	Only for live imaging involving Tribolium
405 fine wheat flour	Demeter e.V.	SP061006	Only for live imaging involving Tribolium
commercially available Drosophila medium	Genesee Scientific	66-115	Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø	Thermo Fisher Scientific	T7282
inactive dry yeast	Genesee Scientific	62-108
low-melt agarose	Carl Roth	6351.2
narrow vials	Genesee Scientific	32-109	Only for live imaging involving Drosophila
small paint brush	VWR International	149-2121
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl	Carl Roth	9062.3	Caution: sodium hypochlorite is corrosive
whole wheat flour	Demeter e.V.	SP061036	Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour
wide vials	Genesee Scientific	32-110	Only for live imaging involving Drosophila