La Visualización De La Calcitonina Gen-Relacionado Con El Péptido Inmunorreactiva Inervación De La Rata Dura Mater Craneal Con Inmunofluorescencia Y Trazado Neural

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para visualizar la correlación espacial del péptido gene-relacionado de la calcitonina (CGRP) - fibras de nervio immunoreactive y vasos sanguíneos en el mater craneal del dura usando inmunofluorescencia e histoquímica fluorescente con CGRP y phalloidin, respectivamente. Además, el origen de estas fibras de nervio era retrógrado trazado con un trazador de los nervios fluorescente.

Resumen

El objetivo de este estudio era examinar la distribución y el origen del péptido gene-relacionado de la calcitonina (CGRP) - fibras de nervio sensoriales immunoreactive del mater craneal del dura usando inmunofluorescencia, la reconstrucción tridimensional (3D) y la técnica retrógrada del trazo. Aquí, las fibras de nervio y los vasos sanguíneos fueron manchados usando técnicas de la inmunofluorescencia y de la histoquímica con CGRP y el phalloidin fluorescente, respectivamente. La correlación espacial de las fibras de nervio CGRP-immuoreactive durales y de los vasos sanguíneos fue demostrada por la reconstrucción 3D. Mientras tanto, el origen de las fibras de nervio CGRP-immunoreactive fue detectado por técnica de los nervios que trazaba con el fluorogold (FG) del área alrededor de la arteria meníngea media (MMA) en el mater craneal del dura al ganglio del trigeminal (TG) y a los ganglios cervicales (c) de la raíz dorsal (DRGs). Además, las características químicas de las neuronas FG-etiquetadas en el TG y drgs también fueron examinadas junto con CGRP usando inmunofluorescencias dobles. Aprovechando la muestra transparente de montaje completo y la reconstrucción 3D, se demostró que las fibras nerviosas CGRP-inmunorreactivas y las arteriolas etiquetadas con faloidina corren juntas o formando por separado una red neurovascular dural en una vista 3D, mientras que las neuronas etiquetadas con FG se encontraron en las ramas oftálmicas, maxilares y mandibulares de TG, así como el C2-3 DRGs ipsolateral al lado de la aplicación del trazador en el que algunas de las neuronas etiquetadas con FG presentaron expresión CGRP-inmunorreactiva. Con estos acercamientos, demostramos las características distributionales de las fibras de nervio CGRP-immunoreactive alrededor de los vasos sanguíneos en el mater craneal del dura, así como el origen de estas fibras de nervio del TG y de DRGs. Desde la perspectiva de la metodología, puede proporcionar una referencia valiosa para comprender la complicada estructura neurovascular de la duramadre craneal bajo la condición fisiológica o patológica.

Introducción

La duramadre craneal es la capa más externa de meninges para proteger el cerebro y contiene abundantes vasos sanguíneos y diferentes tipos de fibras nerviosas^1,2. Muchos estudios han demostrado que la duramadre craneal sensibilizada puede ser el factor clave que conduce a la aparición de dolores de cabeza, que implican la vasodilatación anormal y la inervación^3,4,5. Así, el conocimiento de la estructura neurovascular en el mater craneal del dura es importante para entender la patogenesia de dolores de cabeza, especialmente para la jaqueca.

Aunque la inervación de la duramadre se haya estudiado previamente con la inmunohistoquímica convencional, la correlación espacial de las fibras nerviosas y los vasos sanguíneos en la duramadre craneal fueron menos estudiadas^6,7,8,9. Para revelar la estructura neurovascular dural más detalladamente, el péptido gene-relacionado de la calcitonina (CGRP) y el phalloidin fueron seleccionados como los marcadores para la coloración respectivamente de las fibras nerviosas durales y de los vasos sanguíneos en el mater craneal del entero-montaje con inmunofluorescencia e histoquímica fluorescente^10. Puede ser una opción óptima para obtener una visión tridimensional (3D) de la estructura neurovascular. Además, el fluorogold (FG) fue aplicado en el área alrededor de la arteria meníngea media (MMA) en el mater craneal del dura para determinar el origen de las fibras de nervio CGRP-immunoreactive, y trazado al ganglio del trigeminal (TG) y a los ganglios cervicales (c) de la raíz dorsal (DRGs), mientras que las neuronas FG-etiquetadas fueron examinadas más a fondo junto con CGRP usando inmunofluorescencia.

El objetivo de este estudio era proporcionar una herramienta eficaz para investigar la estructura neurovascular en el mater craneal del dura para la inervación CGRP-immunoreactive y su origen. Tomando la ventaja del mater transparente del dura del entero-montaje y combinando la inmunofluorescencia, el trazo retrógrado, las técnicas confocales, y la reconstrucción 3D, esperábamos presentar una vista 3D nueva de la estructura neurovascular en el mater craneal del dura. Estos acercamientos metodológicos se pueden servir más a fondo para explorar la patogenesia de diversos dolores de cabeza.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas (número de referencia D2018-09-29-1). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Doce ratas masculinas adultas de Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g) fueron utilizadas en este estudio. Los animales [número de licencia SCXK (JING) 2017-0005] fueron proporcionados por los Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Medicamentos.

1. Inervación de la duramadre craneal de rata

1. Perfusiones
   1. Inyecte por vía intraperitoneal una sobredosis de solución de tribromoetanol (250 mg/kg) a la rata para inducir la eutanasia.
   2. Una vez que la respiración se detiene, perfundir transcardialmente con 100 mL de solución salina normal al 0,9% seguido de 250-300 mL de paraformacionaldehído al 4% en tampón de fosfato de 0,1 M (PB, pH 7,4).
   3. Después de la perfusión, retire la piel de la cabeza y abra el cráneo para exponer la duramadre y el lado dorsal del cerebro. A continuación, diseccionar la duramadre craneal a lo largo del tronco encefálico hasta el bulbo olfatorio en el patrón de montaje completo (Figura 1). Realizar post-fijación en paraformadehído al 4% durante 2 h, y luego crioproteger en sacarosa al 25% en 0,1 M PB durante más de 24 h a 4 °C.
2. Fluorescencia inmunohistoquímica para cgrp y phalloidin etiquetado
   NOTA: Una combinación de coloración fluorescente de CGRP y del phalloidin fue aplicada para revelar la correlación espacial de las fibras de nervio durales y de los vasos sanguíneos en el mater craneal del dura de la rata en el patrón del entero-montaje.
   1. Enjuague la duramadre craneal en 0,1 M PB durante aproximadamente 1 min.
   2. Incubar la duramadre en una solución de bloqueo que contenga 3% de suero de burro normal y 0,5% tritón X-100 en 0,1 M PB durante 30 min.
   3. Transferir la duramadre al anticuerpo anti-CGRP de ratón (1:1000) en 0,1 M PB que contenga 1% de suero de burro normal y 0,5% tritón X-100 durante la noche a 4 °C^11.
   4. Lave la duramadre tres veces en 0,1 M PB al día siguiente.
   5. Incubar la duramadre en una solución mixta de anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 anti-ratón burro (1:500) y faloidina 568 (1:1000) en 0,1 M PB que contenga un 1% de suero de burro normal y un 0,5% tritón X-100 durante 1,5 h a temperatura ambiente (26 °C).
   6. Lavar la duramadre tres veces en 0,1 M PB.
   7. Recorte los bordes y móntelo en portaobjetos de microscopio (consulte Tabla de materiales).
   8. Póngase cubrebocas con glicerina al 50% antes de la observación.
3. Observación y registro
   1. Observe las muestras fluorescentes bajo un microscopio fluorescente o un sistema de imágenes confocales.
   2. Tome las imágenes de la duramadre de montaje completo mediante un microscopio fluorescente equipado con una cámara digital (4x, NA: 0.13), y use un tiempo de exposición de 500 ms. Los mosaicos de imágenes de la duramadre se completaron con un software de microscopio fluorescente (ver Tabla de Materiales).
   3. Tome imágenes de las fibras nerviosas cgrp-inmunorreactivas y los vasos sanguíneos marcados con faloidina en la duramadre usando un microscopio confocal. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 488 nm (verde) y 594 nm (rojo). El agujero de alfiler confocal es de 110 (20x) y 105 μm (40x). La resolución de captura de imagen es de 640 x 640 píxeles.
   4. Capture 20 imágenes en fotogramas de 2 μm de cada sección de 40 μm de espesor y realice una sola integración de imágenes enfocadas con un sistema de software asociado al procesamiento de imágenes confocales para el análisis 3D de la siguiente manera: Establezca el plano focal de inicio | Definir | de plano focal final Establecer | de tamaño de paso Elegir patrón de profundidad | | de captura de imágenes Serie Z.
   5. Utilice un software de edición de fotos para ajustar el brillo y el contraste de las imágenes para optimizar la visualización. Preste atención a no eliminar ningún dato de las imágenes.

2. Estudio de trazado retrógrado con FG

1. Procedimientos quirúrgicos
   1. Determinar el área de coordenadas de interés en la duramadre craneal de rata.
   2. Prepare una microinginga de 10 μL y pruébela con parafina líquida.
   3. Anestesiar a las ratas con solución de tribromoetanol (150 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal. Compruebe la profundidad en la anestesia por la falta de respuesta al pellizco del dedo deldo del trabajo.
   4. Afeitar la cabeza de la rata con una maquinilla de afeitar eléctrica.
   5. Coloque barras para los oídos romas a la rata y colóquela en el dispositivo estereotáxico. Luego coloque el soporte bucal y aplique ungüento oftálmico en los ojos.
   6. Limpie el sitio quirúrgico de la piel de la cabeza usando 10% de povidona yodada seguido de 75% de etanol.
   7. Haga una incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo.
   8. Retire sin rodeos el periostio y los tejidos musculares lejos del cráneo utilizando aplicadores estériles con punta de algodón (Figura 1A).
   9. Perfore un pequeño agujero (~ 5-7 mm) usando un taladro de rebabas con una broca de punta redonda (#106) en los huesos parietales y temporales izquierdos por encima del MMA^12,y asegúrese de que la duramadre craneal se mantuvo intacta(Figura 1B).
   10. Construir un banco alrededor del agujero con cemento de silicato dental para limitar la propagación del trazador (Figura 1C).
   11. Añadir 2 μL de 2% de FG en el agujero alrededor de MMA con una micro-jeringa de 10 μL (Figura 1D).
   12. Cubra el agujero con un pequeño pedazo de esponja hemostática.
   13. Coloque un pedazo de película de parafina en el agujero y selle los bordes con cera ósea para evitar la fuga del trazador y para evitar la contaminación de los tejidos circundantes.
   14. Suturar la herida con hilo estéril.
   15. Mantenga a las ratas en un área cálida hasta que se hayan recuperado por completo.
   16. Devuelva a las ratas a sus jaulas y agregue un antibiótico y un analgésico en el agua potable.
2. Perfusiones y secciones
   1. Después de 7 días de supervivencia, perfunda estas ratas como se mencionó anteriormente en los procedimientos de la sección 1.1.
   2. Diseccionar los DRGs TG y C1-4, luego post-fijarlos y crioprotegerlos como se mencionó anteriormente en la sección 1.1.3 (Figura 1F).
   3. Corte el TG y los DRG a un espesor de 30 μm en un sistema de microtomo de criostato en la dirección sagital y montado en portaobjetos de vidrio recubiertos de silano.
3. Inmunofluorescencias dobles para FG- y CGRP-etiquetado en el TG y DRGs
   NOTA: Aunque el FG-etiquetado se pueda observar directamente con la iluminación ULTRAVIOLETA bajo lámpara del mercurio sin la coloración adicional^13,14,15,16,las neuronas etiquetadas con FG fueron examinadas más a fondo en el TG y drgs cervical usando inmunofluorescencias dobles con FG y CGRP para revelar los orígenes de las fibras nerviosas CGRP-immunoreactive durales en el TG y los DRGs.
   1. Rodee las secciones con la pluma histoquímica.
   2. Incubar las secciones durante 30 min en una solución de bloqueo que contenga 3% de suero de burro normal y 0,5% tritón X-100 en 0,1 M PB.
   3. Transferir las muestras a la solución de conejo anti-fluorogold (1:1000) y anticuerpo anti-CGRP de ratón (1:1000) en 0,1 M PB que contiene 1% de suero de burro normal y 0,5% Triton X-100 durante la noche a 4 °C.
   4. Lavar las secciones tres veces en 0.1 M PB al día siguiente.
   5. Incubar en una solución mixta de anticuerpo secundario anti-conejo Alexa Fluor 594 (1:500) y anti-ratón de burro Alexa Fluor 488 (1:500) en 0.1 M PB que contenga 1% de suero de burro normal y 0.5% tritón X-100 durante 1.5 h a temperatura ambiente.
   6. Lave y aplique cubrebocas a las secciones como los procedimientos de los pasos 1.2.6 y 1.2.8.
4. Observación y registro
   1. Tome imágenes de las neuronas etiquetadas con FG en TG y DRGs bajo iluminación UV mediante microscopio fluorescente equipado con una cámara digital.
   2. Capture imágenes de las neuronas etiquetadas con FG y CGRP en TG y DRGs bajo un microscopio fluorescente equipado con una cámara digital.
   3. Utilice el software de edición para ajustar el brillo y el contraste de las imágenes y para agregar etiquetas en las imágenes.

Resultados

Estructura neurovascular de la duramadre craneal
Después de la tinción histoquímica inmunofluorescente y fluorescente con CGRP y faloidina, las fibras nerviosas CGRP-inmunorreactivas y las arteriolas durales etiquetadas con faloidina y los tejidos conectivos se demostraron claramente en toda la duramadre craneal de montaje completo en un patrón 3D(Figura 2C,D, E, F). Se demostró que tanto las fibras nerviosas cgrp-inm...

Discusión

En este estudio, hemos demostrado con éxito la distribución y el origen de las fibras nerviosas CGRP-inmunorreactivas en la duramadre craneal utilizando inmunofluorescencia, reconstrucción 3D y enfoques de trazado neuronal con anticuerpo CGRP y trazador neural FG, proporcionando las evidencias histológicas y químicas para comprender mejor la red neurovascular dural.

Como era sabido, CGRP desempeña un papel crítico en la patogenesia de la^{jaqueca 4,}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Fluorescent imaging system	Olympus	BX53
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	Version 4.2	Confocal image processing software system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6	Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm