Visualizzazione dell'innervazione immunoreattiva peptidica legata al gene calcitonina del topo Cranial Dura Mater con immunofluorescenza e tracciamento neurale

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare la correlazione spaziale delle fibre nervose immunoreattive peptidiche (CGRP) e dei vasi sanguigni correlati al gene calcitonina nel dura mater cranico usando rispettivamente immunofluorescenza e istochimica fluorescente con CGRP e phalloidina. Inoltre, l'origine di queste fibre nervose è stata tracciata retrogradamente con un tracciante neurale fluorescente.

Abstract

Lo scopo di questo studio era quello di esaminare la distribuzione e l'origine delle fibre nervose sensoriali immunoreattive del peptide (CGRP) immunoreattive del basamento cranico utilizzando l'immunofluorescenza, la ricostruzione tridimensionale (3D) e la tecnica di tracciamento retrogrado. Qui, le fibre nervose e i vasi sanguigni sono stati macchiati usando rispettivamente immunofluorescenza e tecniche istochimiche con CGRP e falloidina fluorescente. La correlazione spaziale delle fibre nervose durali CGRP-immuoreattive e dei vasi sanguigni è stata dimostrata dalla ricostruzione 3D. Nel frattempo, l'origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP sono state rilevate con la tecnica di tracciamento neurale con fluorogold (FG) dall'area intorno all'arteria meningea media (MMA) nella dura mater cranica al ganglio trigeminale (TG) e gangli della radice dorsale cervicale (C). Inoltre, sono state esaminate anche le caratteristiche chimiche dei neuroni etichettati FG nei TG e nei DRG insieme al CGRP utilizzando doppie immunofluorescenze. Sfruttando il campione trasparente a montaggio intero e la ricostruzione 3D, è stato dimostrato che le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole etichettate con phalloidina corrono insieme o formano separatamente una rete neurovascolare uditivo in una vista 3D, mentre i neuroni etichettati FG sono stati trovati nei rami oftalmico, mascellare e mandibolare del TG, così come nei DRG C2-3 ipsilateral sul lato dell'applicazione del tracciante in cui alcuni dei neuroni etichettati FG presentavano espressione immunoreattiva CGRP. Con questi approcci, abbiamo dimostrato le caratteristiche distributivi delle fibre nervose immunoreattive CGRP intorno ai vasi sanguigni nella dura madre cranico, così come l'origine di queste fibre nervose da TG e DRG. Dal punto di vista metodologico, può fornire un prezioso riferimento per comprendere la complicata struttura neurovascolare del dura mater cranicio sotto la condizione fisiologica o patologica.

Introduzione

Il dura mater cranico è lo strato più esterno di meningi per proteggere il cervello e contiene abbondanti vasi sanguigni e diversi tipi di fibre nervose^1,2. Molti studi hanno dimostrato che la dura mater cranici sensibilizzata può essere il fattore chiave che porta al verificarsi di mal di testa, che coinvolge la vasodilatazione e l'innervazione^{anomale 3,4,5}. Pertanto, la conoscenza della struttura neurovascolare nella dura madre cranale è importante per comprendere la patogenesi del mal di testa, specialmente per l'emicrania.

Sebbene l'innervazione dura sia stata precedentemente studiata con l'immunoistochimica convenzionale, la correlazione spaziale delle fibre nervose e dei vasi sanguigni nella dura madre cranico è stata^{meno studiata 6,7,8,9}. Al fine di rivelare la struttura neurovascolare durale in modo più dettagliato, peptide correlato al gene calcitonina (CGRP) e phalloidin sono stati selezionati come marcatori per la colorazione rispettivamente delle fibre nervose durali e dei vasi sanguigni nella dura madre cranale a montaggio intero con immunofluorescenza e istochimica fluorescente¹⁰. Può essere una scelta ottimale ottenere una visione tridimensionale (3D) della struttura neurovascolare. Inoltre, il fluorogold (FG) è stato applicato sull'area intorno all'arteria meningea media (MMA) nel dura mater cranico per determinare l'origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP, e rintracciato al ganglio trigemino (TG) e ai gangli della radice dorsale cervicale (C), mentre i neuroni etichettati FG sono stati ulteriormente esaminati insieme alla CGRP usando l'immunofluorescenza.

Lo scopo di questo studio era quello di fornire uno strumento efficace per studiare la struttura neurovascolare nella dura mater cranale per l'innervazione immunoreattiva CGRP e la sua origine. Sfruttando il dura mater trasparente a montaggio intero e combinando l'immunofluorescenza, il tracciamento retrogrado, le tecniche confocali e la ricostruzione 3D, ci aspettavamo di presentare una nuova visione 3D della struttura neurovascolare nella dura mater cranale. Questi approcci metodologici possono essere ulteriormente serviti per esplorare la patogenesi di diversi mal di testa.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (numero di riferimento D2018-09-29-1). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati dodici ratti maschi adulti Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Gli animali [numero di licenza SCXK (JING) 2017-0005] sono stati forniti dai National Institutes for Food and Drug Control.

1. Innervazione del dura mater cranale di ratto

1. Perfusioni
   1. Iniettare per via intraperitoneale un sovradosaggio di soluzione di tribromoetanolo (250 mg/kg) al ratto per indurre l'eutanasia.
   2. Una volta che il respiro si ferma, per infusione transcardiale con 100 mL dello 0,9% di soluzione salina normale seguita da 250-300 mL di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).
   3. Dopo la perfusione, rimuovere la pelle della testa e aprire il cranio per esporre la dura madre e il lato dorsale del cervello. Quindi sezionare la dura mater cranale lungo il tronco encefalico fino al bulbo olfattivo nel modello a montaggio intero (Figura 1). Eseguire la post-fissazione in paraformaldeide al 4% per 2 ore, quindi crioproteggere in saccarosio al 25% in 0,1 M PB per più di 24 ore a 4 °C.
2. Immunoistochimica a fluorescenza per l'etichettatura CGRP e phalloidin
   NOTA: Una combinazione di colorazione fluorescente di CGRP e phalloidin è stata applicata per rivelare la correlazione spaziale delle fibre nervose durali e dei vasi sanguigni nel dura mater cranico del ratto nel modello a montaggio intero.
   1. Risciacquare il dura mater craniciale in 0,1 M PB per circa 1 minuto.
   2. Incubare il dura mater in una soluzione di blocco contenente il 3% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 in 0,1 M PB per 30 min.
   3. Trasferire il dura mater in anticorpo anti-CGRP del topo (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 durante la notte a 4 °C¹¹.
   4. Lavare la dura mater tre volte in 0,1 M PB il giorno seguente.
   5. Incubare il dura mater in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 488 dell'asino (1:500) e phalloidin 568 (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente (26 °C).
   6. Lavare la dura mater tre volte in 0,1 M PB.
   7. Tagliare i bordi e montarlo su vetrini al microscopio (vedere Tabella dei materiali).
   8. Indossare coverlips con 50% glicerina prima dell'osservazione.
3. Osservazione e registrazione
   1. Osservare i campioni fluorescenti al microscopio fluorescente o a un sistema di imaging confocale.
   2. Scatta le immagini dell'intera dura mater montata da un microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale (4x, NA: 0.13) e usa un tempo di esposizione di 500 ms. I mosaici di immagini della dura mater sono stati completati con un software di microscopio fluorescente (vedi Tabella dei materiali).
   3. Scatta immagini delle fibre nervose immunoreattive CGRP e dei vasi sanguigni etichettati con phalloidina nella dura madre usando un microscopio confocale. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione erano di 488 nm (verde) e 594 nm (rosso). Il foro a spillo confocale è 110 (20x) e 105 μm (40x). La risoluzione dell'acquisizione dell'immagine è di 640 x 640 pixel.
   4. Cattura 20 immagini in fotogrammi da 2 μm da ogni sezione spessa 40 μm ed esegui un'integrazione di immagini singole a fuoco con un sistema software associato all'elaborazione delle immagini confocali per l'analisi 3D come segue: Set Start Focal Plane | Impostare il piano focale finale | Impostare le dimensioni dei | Selezionate Serie profondità (Depth Pattern| Acquisizione immagini | Serie Z.
   5. Usa un software di fotoritocco per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini per ottimizzare la visualizzazione. Prestare attenzione a non rimuovere alcun dato dalle immagini.

2. Studio di tracciamento retrogrado con FG

1. Procedure chirurgiche
   1. Determinare l'area di coordinate di interesse nella dura mater cranicia del ratto.
   2. Preparare una micro siringa da 10 μL e testarla con paraffina liquida.
   3. Anestetizzare i ratti con soluzione di tribromoetanolo (150 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale. Verificare la profondità in anestesia per la mancanza di risposta al dito del dito del piedi.
   4. Radere la testa al topo con un rasoio elettrico.
   5. Mettere le barre dell'orecchio smussate sul topo e posizionarlo sul dispositivo stereotassico. Quindi mettere il porta bocca e applicare un unguento oftalmico sugli occhi.
   6. Pulire il sito chirurgico della pelle della testa usando il 10% di iodio di povidone seguito dal 75% di etanolo.
   7. Fai un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto.
   8. Rimuovere senza mezzi termini il periostio e i tessuti muscolari dal cranio utilizzando applicatori sterili con punta di cotone (Figura 1A).
   9. Praticare un piccolo foro (~5-7 mm) utilizzando un trapano a bava con una punta rotonda (#106) sulle ossa parietali e temporali sinistra sopra l'MMA¹²e assicurarsi che il dura mater cranici sia stato mantenuto intatto(Figura 1B).
   10. Costruire una banca intorno al foro con cemento silicato dentale per limitare la diffusione del tracciante(Figura 1C).
   11. Aggiungere 2 μL di 2% FG nel foro intorno a MMA con una microsiringa da 10 μL (Figura 1D).
   12. Coprire il foro con un piccolo pezzo di spugna emostatica.
   13. Mettere un pezzo di pellicola di paraffina sul foro e sigillare i bordi con cera ossea per evitare perdite di tracciante ed evitare di contaminare i tessuti circostanti.
   14. Suturare la ferita con filo sterile.
   15. Tenere i ratti in una zona calda fino a quando non si sono completamente ripresi.
   16. Riportare i ratti nelle loro gabbie e aggiungere un antibiotico e un analgesico nell'acqua potabile.
2. Perfusioni e sezioni
   1. Dopo 7 giorni di sopravvivenza, perfondere questi ratti come accennato in precedenza nelle procedure di cui al punto 1.1.
   2. Sezionare i DDG TG e C1-4, quindi post-fissarli e crioproteggerli come sopra menzionato nella sezione 1.1.3 (Figura 1F).
   3. Tagliare i TG e i DRG allo spessore di 30 μm su un sistema di microtomi criostatici in direzione sagittale e montati su vetri rivestiti di silani.
3. Doppia immunofluorescenza per l'etichettatura FG e CGRP nei TG e nei DRG
   NOTA: Sebbene l'etichettatura FG possa essere osservata direttamente con l'illuminazione UV sotto lampada al mercurio senza colorazione^{aggiuntiva 13,14,15,16}, i neuroni etichettati con FG sono stati ulteriormente esaminati nei TG e nelle DRAG cervicali utilizzando doppie immunofluorescenze con FG e CGRP per rivelare le origini delle fibre nervose duralI CGRP-immunoreattive nei TG e nei DRG.
   1. Cerchia le sezioni con la penna istochimica.
   2. Incubare le sezioni per 30 min in una soluzione di blocco contenente il 3% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 in 0,1 M PB.
   3. Trasferire i campioni nella soluzione di antifluorogoldo di coniglio (1:1000) e anticorpo anti-CGRP del topo (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 durante la notte a 4 °C.
   4. Lavare le sezioni tre volte in 0,1 M PB il giorno seguente.
   5. Incubare in una soluzione mista di anticorpo secondario alexa fluor 594 (1:500) e anti-topo d'asino Alexa Fluor 488 (1:500) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente.
   6. Lavare e applicare le coperture alle sezioni come procedure nei passaggi 1.2.6 e 1.2.8.
4. Osservazione e registrazione
   1. Scatta immagini dei neuroni etichettati FG in TG e DRG sotto illuminazione UV tramite microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale.
   2. Cattura le immagini dei neuroni etichettati FG e CGRP in TG e DRG sotto un microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale.
   3. Utilizzare il software di modifica per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini e aggiungere etichette nelle immagini.

Risultati

Struttura neurovascolare del dura mater craniciale
Dopo la colorazione istochimica immunofluorescente e fluorescente con CGRP e phalloidin, le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole duriali e i tessuti connettivi etichettati con falloidina sono stati chiaramente dimostrati in tutta la dura madre cranica a montaggio intero in un modello 3D(Figura 2C,D, E, F). È stato dimostrato che sia le fibre nervose immunoreat...

Discussione

In questo studio, abbiamo dimostrato con successo la distribuzione e l'origine delle fibre nervose cgrp-immunoreattive nel dura mater cranico utilizzando l'immunofluorescenza, la ricostruzione 3D e gli approcci di tracciamento neurale con anticorpo CGRP e tracciante neurale FG, fornendo le evidenze istologiche e chimiche per comprendere meglio la rete neurovascolare udirica.

Come era noto, il CGRP svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi dell'emicrania^4,...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Fluorescent imaging system	Olympus	BX53
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	Version 4.2	Confocal image processing software system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6	Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm