Visualizando a Interiorização Imunoreativa Do Peptídeo Relacionado ao Gene calcitonina do Rato Cranial Dura Mater com Imunofluorescência e Rastreamento Neural

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para visualizar a correlação espacial do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras nervosas imunoreativas e vasos sanguíneos na duracolia craniana usando imunofluorescência e histoquímica fluorescente com CGRP e fábulina, respectivamente. Além disso, a origem dessas fibras nervosas foi retrógrada traçada com um rastreador neural fluorescente.

Resumo

O objetivo deste estudo foi examinar a distribuição e a origem do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras sensoriais imunoreativas do duracococa craniano utilizando imunofluorescência, reconstrução tridimensional (3D) e técnica de rastreamento retrógrado. Aqui, as fibras nervosas e vasos sanguíneos foram manchados usando imunofluorescência e técnicas histoquímicas com CGRP e fábula fluorescente, respectivamente. A correlação espacial das fibras nervosas e vasos nervosos transmotivos cgrp-immuoreactive dural e vasos sanguíneos foram demonstradas pela reconstrução 3D. Enquanto isso, a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP foram detectadas pela técnica de rastreamento neural com fluorogold (FG) da área ao redor da artéria meningeal média (MMA) na duracaca craniana mater à gânglio triginal (TG) e gânglios de raiz dorsal cervical (C) (DRGs). Além disso, as características químicas dos neurônios rotulados por FG nos TG e DRGs também foram examinadas juntamente com CGRP utilizando imunofluorescências duplas. Aproveitando a amostra transparente de montagem integral e a reconstrução 3D, mostrou-se que as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias rotuladas por fálico funcionam juntas ou formando separadamente uma rede neurovascular dural em uma visão 3D, enquanto os neurônios rotulados por FG foram encontrados nos ramos oftálmico, maxilar e mandibular de TG, bem como os IPS C2-3 ao lado da aplicação do rastreador em que alguns dos neurônios rotulados por FG apresentavam expressão CGRP-imunoreactive. Com essas abordagens, demonstramos as características distributivas das fibras nervosas cgrp-imunoreativas ao redor dos vasos sanguíneos na dura-duracaca craniana, bem como a origem dessas fibras nervosas de TG e DRGs. Do ponto de vista da metodologia, pode fornecer uma referência valiosa para a compreensão da complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana sob a condição fisiológica ou patológica.

Introdução

A dura-máter craniana é a camada mais externa de meninges para proteger o cérebro e contém vasos sanguíneos abundantes e diferentes tipos de fibras nervosas^1,2. Muitos estudos têm demonstrado que a dura-dura-maternidade craniana sensibilizada pode ser o fator-chave que leva à ocorrência de dores de cabeça, envolvendo a vasodilatação anormal e a inervação^3,4,5. Assim, o conhecimento da estrutura neurovascular na dura-escola craniana é importante para a compreensão da patogênese das dores de cabeça, especialmente para a enxaqueca.

Embora a innervação dura tenha sido previamente estudada com a imunohistoquímica convencional, a correlação espacial das fibras nervosas e vasos sanguíneos na duracolia craniana foram menos estudadas^6,7,8,9. Para revelar a estrutura neurovascular dural com mais detalhes, peptídeos relacionados a genes de calcitonina (CGRP) e faloideína foram selecionados como marcadores para, respectivamente, coloração das fibras nervosas durais e vasos sanguíneos na dura-dura craniana de todo o monte com imunofluorescência e histoquímica fluorescente¹⁰. Pode ser uma escolha ideal para obter uma visão tridimensional (3D) da estrutura neurovascular. Além disso, fluorogold (FG) foi aplicada na área em torno da artéria meningeal média (MMA) na dura-dura craniana para determinar a origem das fibras nervosas imunorreativas CGRP, e rastreada à gânglio trigeminal (TG) e gânglios de raiz dorsal (DRGs) cervicais (DRGs), enquanto os neurônios rotulados pelo FG foram examinados juntamente com CGRP usando imunofluorescência.

O objetivo deste estudo foi fornecer uma ferramenta eficaz para a investigação da estrutura neurovascular na dura mater craniana para a inervação CGRP-imunoreactive e sua origem. Aproveitando a dura-dura-montagem transparente e combinando a imunofluorescência, o rastreamento retrógrado, as técnicas confocal e a reconstrução 3D, esperamos apresentar uma nova visão 3D da estrutura neurovascular na dura-duracaca craniana. Essas abordagens metodológicas podem ser ainda mais servidas para explorar a patogênese de diferentes dores de cabeça.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-09-29-1). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Foram utilizados neste estudo 12 ratos machos adultos Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Os animais [número de licença SCXK (JING) 2017-0005] foram fornecidos pelos Institutos Nacionais de Controle de Alimentos e Drogas.

1. Innervation of rat cranial dura mater

1. Perfusões
   1. Injetar intraperitoneally uma overdose de solução de tribromoetanol (250 mg/kg) no rato para induzir eutanásia.
   2. Uma vez que a respiração pare, a perfuse transcardial com 100 mL de soro fisiológico normal de 0,9%, seguida por 250-300 mL de 4% de paraformaldeído em 0,1 M tampão fosfato (PB, pH 7.4).
   3. Após a perfusão, remova a pele da cabeça e abra o crânio para expor o lado dura e dorsal do cérebro. Em seguida, disseca a dura-máter craniana ao longo do tronco cerebral à lâmpada olfativa no padrão de montagem total(Figura 1). Realize a pós-fixação em 4% paraformaldeído por 2h e, em seguida, crioproteto em 25% de sacarose em 0,1 M PB por mais de 24h a 4 °C.
2. Imunohistoquímica de fluorescência para rotulagem de CGRP e fálico
   NOTA: Uma combinação de coloração fluorescente de CGRP e fábula foi aplicada para revelar a correlação espacial das fibras nervosas durais e vasos sanguíneos na dura-dura do rato no padrão de montagem total.
   1. Enxágüe a dura-m de 0,1 M PB por cerca de 1 min.
   2. Incubar o dura mater em uma solução de bloqueio contendo 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em 0,1 M PB por 30 min.
   3. Transfira o dura mater para o anticorpo anti-CGRP do mouse (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro normal de burro e 0,5% Triton X-100 durante a noite a 4 °C¹¹.
   4. Lave a dura mater três vezes em 0,1 M PB no dia seguinte.
   5. Incubar o dura mater em uma solução mista de anticorpo médio Alexa Fluor 488 (1:500) e falo 568 (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 h em temperatura ambiente (26 °C).
   6. Lave a dura mater três vezes em 0,1 M PB.
   7. Apare as bordas e monte-as em slides de microscópio (ver Tabela de Materiais).
   8. Coloque as tampas com 50% de glicerina antes da observação.
3. Observação e gravação
   1. Observe as amostras fluorescentes sob um microscópio fluorescente ou um sistema de imagem confocal.
   2. Pegue as imagens de toda a dura-montagem por um microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital (4x, NA: 0.13), e use um tempo de exposição de 500 ms. Os mosaicos de imagem do dura mater foram completados com um software de microscópio fluorescente (ver Tabela de Materiais).
   3. Faça imagens das fibras nervosas imunoreativas CGRP e vasos sanguíneos rotulados com falioidina na dura mater usando um microscópio confocal. Os comprimentos de onda de excitação e emissão foram de 488 nm (verde) e 594 nm (vermelho). O pinhole confocal é de 110 (20x) e 105 μm (40x). A resolução da captura de imagem é de 640 x 640 pixels.
   4. Capture 20 imagens em quadros de 2 μm de cada seção de 40 μm de espessura e realize uma integração de imagem em foco único com um sistema de software associado ao processamento de imagens confocal para análise 3D da seguinte forma: Defina o Plano Focal iniciar | Set End focal plane | Definir o tamanho do passo | Escolha | padrão de profundidade | de captura de imagens Série Z.
   5. Use um software de edição de fotos para ajustar o brilho e o contraste das imagens para otimizar a visualização. Preste atenção para não remover nenhum dado das imagens.

2. Estudo de rastreamento retrógrado com FG

1. Procedimentos cirúrgicos
   1. Determine a área de coordenação de interesse em rato cranial dura mater.
   2. Prepare uma micro-seringa de 10 μL e teste-a com parafina líquida.
   3. Anestesiar os ratos com solução de tribromoetanol (150 mg/kg) via injeção intraperitoneal. Verifique a profundidade na anestesia pela falta de resposta ao aperto do dedo do dedo do dedo.
   4. Raspe a cabeça do rato com uma navalha elétrica.
   5. Coloque as barras de ouvido cegas no rato e coloque-o no dispositivo estereotaxico. Em seguida, coloque o porta-boca e aplique pomada oftálmica nos olhos.
   6. Limpe o local cirúrgico da pele da cabeça usando 10% de iodo povidone seguido de 75% de etanol.
   7. Faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo.
   8. Remova sem rodeios e tecidos musculares do crânio usando aplicadores estéreis com ponta de algodão(Figura 1A).
   9. Faça um pequeno furo (~5-7 mm) usando uma broca de rebarba com um bit de ponta redonda (#106) nos ossos parietal esquerdo e temporal acima do MMA¹², e certifique-se de que a dura-moria craniana foi mantida intacta(Figura 1B).
   10. Construa um banco ao redor do orifício com cimento silicato dental para limitar a propagação do rastreador(Figura 1C).
   11. Adicione 2 μL de 2% FG no orifício ao redor do MMA com uma micro-seringa de 10 μL(Figura 1D).
   12. Cubra o buraco com um pequeno pedaço de esponja hemostática.
   13. Coloque um pedaço de filme de parafina no buraco e sele as bordas com cera óssea para evitar o vazamento de rastreador e para evitar contaminar os tecidos circundantes.
   14. Sutura a ferida com fio estéril.
   15. Mantenha os ratos em uma área quente até que eles se recuperem completamente.
   16. Devolva os ratos de volta às suas gaiolas e adicione um antibiótico e analgésico na água potável.
2. Perfusões e seções
   1. Após 7 dias de sobrevivência, perfundir esses ratos como mencionado acima nos procedimentos da seção 1.1.
   2. Disseca os DRGs TG e C1-4, depois pós-fixe e crioproteta-los como mencionado acima na seção 1.1.3 (Figura 1F).
   3. Corte os TG e DRGs na espessura de 30 μm em um sistema de microtome criostat na direção sagital e montado em lâminas de vidro revestidas de silano.
3. Imunofluorescências duplas para rotulagem FG e CGRP nos TG e DRGs
   NOTA: Embora a rotulagem FG possa ser observada diretamente com iluminação UV sob lâmpada de mercúrio sem coloração adicional^13,14,15,16, os neurônios rotulados com FG foram examinados posteriormente em TG e DRGs cervicais utilizando imunofluorescências duplas com FG e CGRP para revelar as origens das fibras nervosas dural CGRP-imunoreactive nos TG e DRGs.
   1. Circule as seções com a caneta histoquímica.
   2. Incubar as seções por 30 min em uma solução de bloqueio contendo 3% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 em 0,1 M PB.
   3. Transfira as amostras para a solução de coelhinho anti-fluorogold (1:1000) e anticorpo anti-CGRP do rato (1:1000) em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 durante a noite a 4 °C.
   4. Lave as seções três vezes em 0,1 M PB no dia seguinte.
   5. Incubar em uma solução mista de anti-coelho de burro Alexa Fluor 594 (1:500) e anti-mouse de burro Alexa Fluor 488 (1:500) anticorpo secundário em 0,1 M PB contendo 1% de soro de burro normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 h em temperatura ambiente.
   6. Lave e aplique tampas nas seções como os procedimentos nas etapas 1.2.6 e 1.2.8.
4. Observação e gravação
   1. Tire imagens dos neurônios rotulados por FG em TG e DRGs sob iluminação UV por microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital.
   2. Capture imagens dos neurônios rotulados FG e CGRP em TG e DRGs sob um microscópio fluorescente equipado com uma câmera digital.
   3. Use o software de edição para ajustar o brilho e o contraste das imagens e adicionar rótulos nas imagens.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Estrutura neurovascular da dura mater craniana
Após a coloração histoquímica imunofluorescente e fluorescente com CGRP e faloidina, as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias dural e tecidos conjuntivos foram claramente demonstradas em toda a duraza mater de todo o monte em um padrão 3D(Figura 2C, D,E,F). Mostrou-se que tanto as fibras nervosas espessas quanto as finas CGRP-imunoreactive funcionam em paralel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Neste estudo, demonstramos com sucesso a distribuição e a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP no dura-pena craniano usando imunofluorescência, reconstrução 3D e abordagens de rastreamento neural com anticorpo CGRP e rastreador neural FG, fornecendo as evidências histológicas e químicas para entender melhor a rede neurovascular dural.

Como era conhecido, o CGRP desempenha um papel crítico na patogênese da enxaqueca^4,17

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Fluorescent imaging system	Olympus	BX53
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	Version 4.2	Confocal image processing software system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6	Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm